SPOP-突变体表达增加pca细胞的全局dna甲基化
Pca患者tcga序列中dna甲基化谱揭示了spop突变的原发肿瘤中的dna甲基化模式。3。然而，到目前为止，还不清楚SPOP突变是否在DNA超甲基化表观基因组的形成中起任何因果作用。到目前为止，在PCA患者中检测到的绝大多数SPOP突变都是半义突变。3,14,15。同意SPOP通过形成二聚体或低聚物促进蛋白质降解的报告12,33，异位表达的spop突变体以显性阴性的方式抑制内源野生型spop的活性。17,34。为了在患者标本中重复表达这一场景，我们将几个PCa衍生的SPOP突变体稳定地表达到22Rv1PCA细胞中，并利用特异性识别甲基化胞嘧啶的抗5 mC抗体进行了全局DNA甲基化的免疫荧光细胞化学(IFC)分析。我们发现，与空载体(EV)相比，SPOP突变体Y87C、F102C、F133V和Q165P的表达必然增加22Rv1细胞的DNA甲基化，差异有统计学意义(图1)。1A-c)。相反，野生型SPOP的异位表达明显降低了DNA甲基化(补充图)。1A，b)，并在很大程度上逆转SPOP-突变体F133V诱导的DNA甲基化，尽管其作用不像DNMT抑制剂5-氮胞苷(5-AzaC)那样严格(补充图)。1C-E)。我们用从SPOP中产生的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)来扩展我们的分析。氧氟沙星-停-氧氟沙星-F102C我们之前报道过有条件的老鼠35。我们用表达CMV驱动的Cre重组酶的慢病毒感染MEFs，发现Myc-SPOP-F102C突变体的瞬时诱导显著增加了DNA甲基化。1D，e)。我们还用抗5 mC抗体对popp突变型q165p pca患者源性异种移植物(Pdx)肿瘤进行了免疫组织化学(Ihc)分析。14。Q165P PDX肿瘤的5mC信号强度高于SPOP-WT肿瘤(图1)。1F，g)。为了研究spop突变对原发性pca患者标本中5 mC水平的影响，我们对84例pca患者进行了sanger测序，并在其中发现了9例spop突变的肿瘤(补充数据)。1)。我们的样本SPOP突变频率(9/84，10.71%)与包括TCGA在内的不同PCA群体的结果一致。3,15。在接受检查的病人样本中，大约90%的SPOP突变的原发肿瘤表现出强烈或中间的5mC信号。相反，只有56%的SPOP-WT肿瘤有强烈或中间的5mC信号(如图所示)。1H，I，补充数据1)。这些发现不仅与spop突变的pca患者标本中dna甲基化增加的检测结果一致。3,8，但也提供了直接证据表明，SPOP突变在诱导PCA细胞DNA甲基化过程中起着因果作用。
图1：SPOP-突变体的表达在培养的PCA细胞和患者标本中诱导DNA过甲基化.a–c感染表达空载体(EV)的22Rv1细胞、HA标记的SPOP Y87C、F102C、F133V或Q165P突变体的整个细胞裂解液(Wcl)的Westernblots(？)a)。有代表性的5mC和HA-SPOP染色的IFC图像如下(b)和5mC信号用ImageJ光密度(OD)/核面积(像素)进行量化。c)。数据显示为±SD(n=50细胞/组)。标尺，10μm。d, eMff中Myc-SPOP F102C和5 mC染色的IFC图像(来源于Myc-SPOP)LSL条件转基因小鼠)被指示的慢病毒(d)和5mC信号用ImageJ光密度(OD)/核面积(像素)进行量化。e)。数据显示为±SD(n=50细胞/组)。标尺，50μm。f, g5 mC染色在SPOP WT和SPOP Q165P突变体PDX组织中的代表性IHC图像(f)和5mC染色的定量数据(g)。标尺为200×字段，100μm，标尺为400×字段，50μm。n=3个复制/组)。h, i84例PCA患者标本中具有代表性的5mC染色图像，包括75例SPOP-WT和9例SPOP-突变体(Mut)标本。h)和5mC染色的定量数据(i)。标度栏，50μm。统计显着性由未配对的双尾学生的。t测试(c, e, f)。用双尾Wilcoxon秩和检验(i)。(实验)a)被重复了两次。源数据作为源数据文件提供。
GLP是SPOP的结合底物。
在哺乳动物中，dna甲基化由dnmt 1、dnmt3A和dnmt3b三种dna甲基转移酶直接调控。36。为了明确SPOP突变导致DNA甲基化的分子机制，我们首先研究了它们对DNMT蛋白表达的影响。我们发现DNMT 1、DNMT3A和Dnmt3b蛋白在SPOP WT和Q165P突变型PDX肿瘤之间具有可比性(附图)。1F5 mC水平在Q165P型PDX肿瘤中明显增高(图1)。1F，g)。进一步证实了短发夹RNA(ShRNAs)和F102C和F133V突变体对22Rv1和DU145PCA细胞株DNMT 1、DNMT3A和Dnmt3b蛋白表达的影响。1g，h)。共免疫共沉淀(co-ip)实验表明，体外表达的Myc标记的SPOP不能降低22Rv1细胞内源性DNMT蛋白的表达(补充图)。1I)。这些结果排除了SPOP通过直接结合或调控PCa细胞中DNMT蛋白表达来调控DNA甲基化的可能性。
为了不偏不倚地确定SPOP突变调控DNA甲基化的分子机制，我们使用全长SPOP作为诱饵，在人胎肾cDNA文库(最好是来自前列腺的文库，但不能从源-Takara/Clontech获得)中进行Y2H筛选。虽然这个屏幕的大部分点击量与我们在大脑cDNA库中执行的前一个屏幕的结果重叠。17(如dek，BRD 2/3/4，GLI 2/3)，我们鉴定了一些新的SPOP相互作用蛋白，包括组蛋白H3K9甲基转移酶GLP。2A)。我们选择关注glp，因为有报道称glp及其伴侣蛋白g9a由于与dnmt蛋白的结合而与dna甲基化有关。25,37,38。通过共ip分析，我们证实了在293 T细胞中，SPOP与GLP相互作用，而非G9a(补充图)。2A)。在22Rv1细胞中，GLP与SPOP和G9a(阳性对照)也在内源水平上相互作用，而SPOP仅与内源性GLP相互作用，而在这些细胞中G9a与G9a相互作用，反之亦然。2B)。SPOP和GLP在22Rv1细胞中的邻近连接试验(PLA)进一步证实了SPOP与GLP之间的相互作用，并与Myc-SPOP和FLAG-GLP的异位表达进行了比较。2C)。这些数据表明SPOP与GLP的相互作用独立于PCA细胞中的GLP/G9a复合物。
图2：GLP是SPOP的泛素化和蛋白酶体降解靶点。a用全长度SPOP作为诱饵，从Y2H筛选中鉴定出4个GLP克隆。由阳性克隆共享的最小相互作用区域(两个虚线之间的区域)覆盖两个假定的SBC基序(红色矩形)。b20RMMG 132处理22Rv1细胞8h后，共ip样品的Westernblots。c转染指示质粒的22Rv1细胞近距离连接试验(PLA)的典型图像。标尺，10μm。dSPOP缺失突变体的示意图表示，表明了它们与GLP的结合能力。e转染指示质粒的293 T细胞WCL和Co-IP的Westernblots，用20μMG 132处理8h。f表达shRNAs的22Rv1细胞WCL的Westernblots。g表达指示shRNA的22Rv1细胞指示基因的RT-qPCR分析。数据显示为±SD(n=3次/组)。h转染所述质粒的293 T细胞WCL的Westernblots。i, j转染Myc-SPOP的22Rv1细胞Myc-SPOP和GLP染色的典型IFC图像(i)。用成象J光密度(OD)/核面积(像素)对10μm.glp染色进行量化。j)。数据显示为±SD(n=50细胞/组)。k用DMSO、MG 132(20μM)、硼替佐米(200 NM)或氯喹(50μM)处理293 T细胞后，产生Westernblots。l转染所述质粒的293 T细胞WCL和Co-IP的Westernblots，用20 MMG 132处理8h。m表达shRNA和HA-Ub的22Rv1细胞体内泛素化产物的Westernblots分析。n–o用50μg/ml放线菌酰亚胺(CHX)处理22 Rv1细胞，并在不同时间点采集细胞进行Western blots检测。n)。西方印迹中GLP蛋白的定量表示为肌动蛋白，然后到0-h时间点(o)。统计学意义由未配对的双尾学生决定t测试(g, j)。(实验)b, c, e, h, k, l)被重复了两次。源数据作为源数据文件提供。
SPOP包含两个主要的结构域，一个位于N端的基底结合数学结构域和一个位于C端区域的CUL3结合的BTB结构域。为了确定SPOP的哪个域与GLP相互作用，我们分别删除了这些域，生成了SPOP-ΔBTB和SPOP-Δ数学突变体。二维空间)。对293 T细胞的共ip分析表明，全长spop-WT和spop-Δbtb，而不是spop-Δ数学突变体与glp有效地相互作用。2E)，建议SPOP通过数学域与GLP进行交互。
CRL 3SPOPE3泛素连接酶复合物诱导GLP蛋白酶体降解
我们研究了GLP是否是SPOP的蛋白水解底物。内源性SPOP的敲除(KD)提高了22Rv1、PC-3和DU 145 PCA细胞系内源性GLP蛋白的稳态水平。2F，补充图。2B)。SPOP KD还能提高G9a蛋白水平。2F，补充图。2B)。这种影响可能是间接的，因为SPOP不与G9a结合(见图)。2B)，但已经证明G9a稳定需要GLP。23。事实上，GLP的缺失在很大程度上降低了22Rv1细胞的G9a蛋白水平。2F)。相反，spopkd对EHMT 1和EHMT 2MRNA表达2G)，表明SPOP在转录后水平调控GLP的表达。SPOP WT的异位表达以剂量依赖性的方式降低了GLP蛋白的表达，这种作用依赖于SPOP(图1)的数学(结合GLP)和BTB(BindingCUL3)结构域。2H-j)。SPOP介导的GLP蛋白表达下降完全被蛋白酶体抑制剂MG 132或硼替佐米所阻断，而溶酶体抑制剂氯喹则完全阻断。2K)，表明SPOP促进GLP蛋白酶体的降解，而不促进溶酶体的降解。MLN 4924是nedd 8激活酶的一种小分子抑制剂，是crl复合物激活所必需的。39。MLN 4924与MG 132和硼替佐米的作用相似，在蛋白质水平上也能引起GLP和G9a的积累，但不引起mRNA水平的积累(附图)。2C，d)。我们还耗尽了CRL 3的两个关键部件CUL3或RBX 1。SPOP在22Rv1细胞中，由两个独立的小干扰RNA(SiRNAs)组成的E3泛素连接酶复合物。我们发现CUL3或RBX 1耗竭显著增加了GLP和G9a蛋白水平(附图)。2E)。我们进一步证明WT-SPOP的表达增强了GLP的多泛素化，但在表达酶死亡的∆BTB突变体的细胞中没有这种作用。2L)。因此，内源性SPOP的减少减少了内源性GLP蛋白的泛素化。2M)。SPOP耗竭也在很大程度上延长了22Rv1细胞内源性GLP蛋白的半衰期(见图)。2N，o)。我们使用药理学和遗传学的方法来证明CRL 3SPOPE3泛素连接酶复合物促进Pca细胞的GLP多泛素化和蛋白酶体降解。
SPOP与GLP中的两个SBC基序结合
以前的研究表明，在spop底物中存在一个或多个spop结合共识(Spc)基序。12。我们试图确定GLP蛋白是否携带任何SBC基序。为此，我们重点研究了由四组SPOP结合阳性Y2H克隆所定义的GLP(氨基酸(A.A.)630-712)中的最小SPOP相互作用区域。2A)。该区域的蛋白质基序分析表明，在已知的spop底物中，有两个完全匹配的sbc基序与sbc基序非常相似，如MacroH2A、dxx、dek和brd 4。11,17,40,41(补充图。2F)。为了确定SPOP-GLP相互作用是否需要这些假定的基序，我们产生了三个GLP突变体SBC1-m、SBC2-m和SBC1/2-m，其中SBC基序中的丝氨酸和苏氨酸残基分别突变为丙氨酸或在一起发生突变(附图)。2G)。共ip分析表明，GLP中第一或第二基序的突变部分减少了其与SPOP的结合，而双突变体SBC 1/2-m则完全丧失了与SPOP(补充图)的结合能力。2H)，表明SPOP-GLP相互作用需要两个SBC基序.接下来，我们研究了SPOP介导的GLP降解是否需要这两个基元.GLP-SBC1-m和GLP-SBC2-m的突变体仍被SPOP降解，尽管效果不如WT的突变体(附图)。2I)。相反，双突变体GLP-SBC1/2-m对SPOP介导的降解具有完全抗性(附图)。2I)。为了进一步确定这两个基元作为degrons的重要性，进行了泛素化试验。这两个基序的缺失完全废除了SPOP介导的GLP多泛素化(补充图)。2J)。此外，SBC 1/2-m双突变显著延长了GLP蛋白的半衰期(附图)。2K，l)。这些数据揭示了两个功能的SBC基序，它们是SPOP结合和多泛素化依赖的GLP降解所必需的。
SPOP突变提高Pca细胞株、PDX肿瘤和患者标本中GLP和G9a蛋白水平
绝大多数pca相关的spop突变主要发生在数学领域。14，它与靶向底物结合。我们推测SPOP的PCA相关突变体可能在介导GLP蛋白破坏方面存在缺陷.我们进行了共同IP分析，并证明与WT SPOP不同，我们检测到的所有与PCA相关的SPOP突变体都没有与GLP结合(图1)。3A)。SPOP介导的GLP蛋白的降解和泛素化也受到这些突变的影响。3B，c)。因此，稳定表达了一些特征良好的pca相关的spop突变体，包括y87c、f102C、f133v和q165p。14提高22Rv1和DU 145细胞内源性GLP/G9a蛋白水平。三维空间，补充图。3A)。我们还进行了IFC分析，结果表明，在瞬时转染SPOP-F102C突变体的22Rv1细胞中，内源性GLP和G9a蛋白水平明显高于未转染的对照细胞(图一)。3E，f，补充图。3B，c)。相反，没有观察到这种影响的mrna表达。EHMT 1和EHMT 2在这两个细胞系中发现了类似的基因，并在另外三个PCA细胞系中观察到了相似的结果，包括LNCaP、C4-2和PC-3(附图)。3D，e).
图3：GLP/G9a蛋白在SPOP-突变型PCA细胞和患者标本中均有表达。a转染空载体质粒(EV)或表明SPOP突变体的293 T细胞经20 MMG 132处理8h后，WCL和Co-IP细胞中均有标记抗体的Westernblots。bWCL中有指示抗体的Westernblots和293 T细胞的抗国旗抗体共ip样品，转染指示质粒，用20 MMG 132处理8h。c转染所述质粒的293 T细胞WCL的Westernblots。d稳定表达EV、WT或突变型HA-SPOP的22Rv1细胞WCL的Westernblots研究。e, f转染Myc-SPOP F102C的22Rv1细胞具有代表性的Myc-SPOP及内源性GLP染色e)，用ImageJ()对GLP染色的光密度(OD)/核面积(像素)进行量化。f)。数据显示为±SD(n=50细胞/组)。标尺，10μm。g, hSPOP-WT和Q165P突变型PDX肿瘤中GLP和G9a染色的典型IHC图像(g)以及GLP和G9a染色的定量数据(h)。标度条在200 X图像中，100μm；刻度条在400 X图像中，50μm。数据显示为±SD(n=3个复制/组)。i, j84例PCA标本GLP和G9a染色的典型IHC图像(i)以及GLP和G9a染色的定量数据(j)。标度栏，50μm。统计显着性由未配对的双尾学生的。t测试(f, h)。用双尾Wilcoxon秩和检验(j)。(实验)a–d)被重复了两次。源数据作为源数据文件提供。
我们进一步检测了GLP和G9a蛋白在PDX肿瘤和患者标本中的表达。我们发现在SPOP Q165P突变体PDXs和SPOP突变的PCA患者标本中，与SPOP WT患者相比，它们的表达上调(见图)。3G-j，补充数据1)。这些数据表明，在培养、PDX肿瘤和患者标本中，SPOP突变的PCA细胞中GLP和G9a蛋白水平均升高。
SPOP突变通过GLP/G9a诱导全球DNA超甲基化
除了发现全球DNA甲基化和GLP/G9a蛋白的表达在SPOP突变的患者样本中比SPOP WT更高(图五)。1H，我，3i，j，补充数据1我们进一步证明，GLP/G9a的高表达也与患者标本中的DNA甲基化有关。4A)。这些结果促使我们确定GLP/G9a蛋白的上调是否与SPOP突变引起的DNA甲基化增加有关。为此，我们击倒了GLP、G9a或对照组(EV)和SPOP F133V稳定的22Rv1细胞。我们进行了5 mC的IFC分析，结果表明GLP或G9a基因敲除不仅降低了对照细胞的5 mC水平，而且完全阻断了SPOP F133V诱导的5 mC水平的升高(图1)。4B-d)。相比之下，击倒了其他一些已知的spop降解底物，包括AR、brd 4和pd-l1。16,17,19,21未导致EV或SPOP-F133V表达细胞的全局DNA甲基化发生明显变化(补充图)。4A-C)。此外，GLP(G9a同时下调)可阻断SPOP F133V-促进22Rv1细胞增殖。4E，f)。除与dnmt蛋白结合等功能外，glp/g9a复合物主要作为hmtase催化h3k9和非组蛋白的甲基化。42。事实上，SPOP F133V突变体的稳定表达增加了GLP和G9a的蛋白表达，同时也提高了22Rv1细胞H3K9me2的表达水平。4G)。GLP/G9a甲基转移酶抑制剂CD 0642对H3K9me2细胞和SPOP F133V-表达22Rv1细胞均有抑制作用。4G)。然而，不管F133V的状态如何，CD 0642的处理并不影响全球DNA甲基化和细胞增殖。4G-I，补充图。4D)。这些发现表明glp/g9a在介导spop突变诱导的pca细胞DNA过甲基化和增殖中起着关键作用，这些作用独立于h3k9me2甲基转移酶活性，这与glp/g9a在调控dna甲基化过程中与hmtase无关的作用是一致的。24,43。值得注意的是，GLP/G9a的酶功能对SPOP突变增强的细胞迁移有重要作用(附图)。4E-I).
图4：GLP/G9a介导的SPOP突变诱导的高甲基化与其HMTase活性无关。a84例PCA患者5mC与GLP/G9a IHC评分的Pearson相关分析b–d表达慢病毒的22Rv1细胞WCL的Westernblots标记及shRNAs(b)。有代表性的5mC和HA-SPOP F133V染色的IFC图像如下(c)，利用ImageJ对5mC信号的光密度(OD)/核面积(像素)进行量化。d)。数据显示为±SD(n=50细胞/组)。标尺，10μm。e, f以表达指示结构的慢病毒感染的22Rv1细胞为标记抗体(e)或用于MTS检测细胞增殖(f)。数据显示为±SD(n=5个复制/组)。g-i用表达EV和SPOP F133V的慢病毒感染的22Rv1细胞，用2M CD 0642处理24 h后进行西方印迹。g)。有代表性的5mC和HA-SPOP F133V染色的IFC图像如下(h)和5mC信号分别用ImageJ(i)。数据显示为±SD(n=50细胞/组)。标度栏，10μm。非配对双尾学生的统计显着性。t测试(a, d, f, i)。(实验)b, e, g)被重复了两次。源数据作为源数据文件提供。
SPOP突变通过上调GLP和G9a蛋白诱导TSG甲基化
为了全面确定SPOP突变诱导的PCa细胞甲基化基因组位点，我们用对照组的Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip(850 K)和SPOP F102C-表达22Rv1细胞进行了DNA甲基化分析。主成分分析(PCA)图、散点图和密度图的数据表明，无论是对照细胞还是F102C表达细胞的生物复制都有很好的一致性(附图)。5A-C，补充数据2–4)。我们发现，与EV细胞相比，SPOP F102C表达细胞的DNA甲基化水平要高得多。5A，补充图。5C，d)，与IFC的数据一致，表明SPOP突变会导致DNA甲基化的总体增加(图1)。1)。我们证明，差异甲基化的CPGS位于CpG岛(CGIS)、启动子、外显子、内含子和基因间区域(附图)。5E)。我们发现514,056个CPGS(FDR<0.05)在表达22 Rv1的F102C细胞中甲基化水平明显高于EV对照细胞(如图所示)。5B，补充数据5)。通过聚类我们的甲基EPIC生物芯片数据与TCGA450K阵列数据在病人(32016 cpgs，甲基化增加的SPOP-突变样本相比，spopWT对应物)(图1)。5B，补充数据6我们鉴定了18,916个共享的高甲基化的CPGS，它们被定位到6,947个基因上(如图所示)。5B，c，补充数据7, 8)。在6,947个常见甲基化基因中，有1,362个基因与2725个基因重叠，其中115个基因是已知的抑癌基因。5C，d，补充数据9).
图5：SPOP-GLP轴调控DNA甲基化和TSG表达.a表达空载体(EV)或SPOP F102C突变体的22Rv1细胞总β值的Jitter图比较，每组4次。bVenn图显示了在22Rv1细胞中EPIC 850 K阵列(F102C VsEV)上的甲基化CPGS之间的重叠。n=514056，fdr<0.0 5)和来自450 K的高甲基化cpgs(spop突变vsWT)在tcga数据库中(n=32016，FDR<0.0 5)。双尾超几何检验，P=1.07E−07。cVenn图显示了表达22Rv1(EP850 K)和SPOP突变患者样本(450 K)的SPOP F102C基因甲基化增加、tcga队列中SPOP突变的前列腺肿瘤基因下调和先前报道的抑癌基因之间的重叠(Https://bioinfo.uth.edu/TSGene/index.html?csrt=17897587749110957416)。双尾超几何检验，P=9.01E−05。d热图显示115个重叠基因的差异表达。c)在SPOP中，与TCGA队列中的SPOP WT肿瘤相比发生突变。e热图显示映射到FOXO 3, GATA 5和NDRG 1与EV对照22Rv1细胞相比，F102C基因座表达水平较高。f基因启动子甲基化的MeDIP-qPCR分析EV或SPOP突变体表达22Rv1细胞。数据显示为±SD(n=3个复制/组)。g, h表达指示质粒和shRNAs的22Rv1细胞DNA甲基化的MeDIP-qPCR分析g)和甲基化特异性PCR(h)。数据显示为±SD(n=3个复制/组)。i, j测量FOXO 3, GATA 5, NDRG 1Rt-qPCR技术在表达指示质粒和shRNAs的22Rv1细胞中的mRNA和蛋白表达(英文)i)和westernblot(j)。数据显示为±SD(n=3个复制/组)。k, l分析FOXO 3, GATA 5和NDRG 1RT-qPCR法表达mRNA和蛋白(英文)k)和westernblot(l)，在EV和F133V-表达22Rv1的细胞中，分别用2μM5-AzaC处理48h。n=3个复制/组)。统计学意义由未配对的双尾学生决定t测试(f, g, i, k)。(实验)j, l)被重复了两次。源数据作为源数据文件提供。
对115例高甲基化下调TSGS的通路分析表明，这些基因在造血干细胞基因调控、VEGFA-VEGFR信号通路和腺样囊性癌等多种肿瘤相关通路中富集。5F)。其中，一些具有良好特性的tsg包括FOXO 3, GATA 5，和NDRG 1更重要的是，这些基因在培养的SPOP突变体22Rv1细胞和TCGA患者样本中都被高度甲基化。5E，补充图。5G)。这些基因位点的SPOP突变增强的DNA甲基化通过对这些TSGS启动子区的独立甲基化DNA免疫沉淀定量PCR(MeDIP-qRCR)分析进一步证实。5F)。此外，Meta分析显示dna甲基化的趋势与FOXO 3, GATA 5，和NDRG 1转移去势耐药前列腺癌(Mcrpc)患者标本中的基因位点7(补充图。5H-j)。甲基化NDRG 1基因也与其在TCGA患者标本中的表达呈负相关(补充图)。5K)。此外，这些基因在SPOP-突变细胞中甲基化的增加被GLP基因敲除所逆转。5G，h)。相反，其他几种SPOP降解底物，包括AR、BRD 4和PD-L1的基因敲除并不能逆转SPOP F133V诱导的这些基因的甲基化(补充图)。6a，b)。此外，在SPOP F133V-表达的22Rv1细胞中重新引入WT SPOP或处理DNA去甲基化试剂5-AzaC可有效地逆转SPOP突变引起的这些基因位点的甲基化(补充图)。6C)。MeDIP-qRCR在22 Rv1细胞中也证实了SPOP突变引起的代表基因甲基化。6d-h).
实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和westernblot分析显示FOXO 3, GATA 5和NDRG 1SPOP F133V对22Rv1细胞mRNA和蛋白水平均有抑制作用，GLP耗竭或5-AzaC处理可逆转这一效应，但不受其他SPOP底物如AR、BRD 4和PD-L1基因敲除的影响。5I-l，补充图。6A)。与SPOP突变的影响相似，SPOP基因敲除也降低了这些TSG蛋白的表达，同时增加了GLP和G9a水平(附图)。7A)。SPOP、Q165P、PDX肿瘤中GLP和G9a水平升高，这些靶点表达降低，与对照组比较差异有显着性(附图)。7b)。此外，我们还证明，对SPOP-GLP轴的放松管制也通过另一细胞系DU 145(补充图)的DNA甲基化抑制了这些TSGS的表达。7C-f)。这些数据表明，SPOP突变通过稳定PCa细胞中的GLP/G9a，诱导TSG启动子甲基化及其下调。
对22Rv1细胞的c 0642处理可降低H3K9me2水平，但未能逆转F133V对H3K9me2的抑制作用。FOXO 3, GATA 5，和NDRG 1基因在蛋白质和mRNA水平的表达-尽管如预期的那样-CA 0642阻止了LATS 2，据报道，一个基因受GLP/G9a HMTase活性调控。44在F133V-表达细胞中(附图)。7g，h)。我们进一步证明，cn 0642也不能逆转f133v诱导的dna甲基化的上调。FOXO 3, GATA 5和NDRG 1基因(附图)7I)。因此，与对全球DNA甲基化的影响是一致的(如图所示)。4这些结果表明，GLP/G9a对DNA甲基化的影响，至少在一部分TSG启动子中是不可能通过其HMTase活性在SPOP突变的PCA细胞中介导的。
SPOP突变通过GLP/G9a与Dnmts的相互作用调节DNA甲基化和TSG基因表达
GLP和G9a中的ANK结构域对DNMT结合是重要的，GLP中的NHHC结构域对G9a结合是必不可少的。24,25,38。为了确定GLP/G9a在介导SPOP-突变细胞DNA超甲基化中的作用，我们构建了GLP DNMT结合缺陷突变体ΔANK&NHHC(由于缺乏ANK结构域而不能与DNMT蛋白直接结合，与G9a结合的NHHC结构域丧失而间接结合)和酶活性不活跃的突变体C1201A(阴性对照)(见图)。6A)。共IP分析表明，C1201A突变体与DNMT 1的结合程度与WT GLP相似，而ΔANK&NHHC突变体在22Rv1细胞中不能与DNMT 1相互作用。6B)。如预期的那样，ΔANK&NHHC突变体与G9a的结合被取消(图1)。6B)。IFC和斑点杂交结果表明，popp突变诱导的高甲基化被glp基因敲除，并被抗shRNA的WT或酶活性不稳定的C1201A突变体所拯救，而不是Δank&nhc突变体(图1)。6C-E，补充图。8A)。同样，medip-qPCR分析表明，glp基因敲除可消除f133v诱导的dna过甲基化。FOXO 3, GATA 5，和NDRG 1基因启动子和这一效应被恢复表达的抗shRNA GLP WT或酶活性的C1201A而不是ΔANK&NHHC突变体所逆转。6f)。RT-qPCR和WB分析均表明，shRNA抗性GLP WT或C1201A突变体的异位表达，而非ΔANK&NHHC缺失突变体，逆转了这些TSGS在GLP缺失的22Rv1细胞中的上调(如图1所示)。6C，补充图。8B)。此外，GLP WT或C1201A突变体也可以挽救细胞增殖，但不能用ΔANK和NHHC缺失突变体(补充图)。8C)。这些数据进一步强调了GLP ANK和NHHC结构域的重要性，以及Dnmts在介导SPOP突变增强DNA甲基化中的作用。当蛋白降解被MG 132阻断时，SPOP WT或SPOP突变体的表达不影响G9a的GLP二聚体化和DNMT 1的结合。8D，e)，表明SPOP不影响G9a或DNMT 1与GLP的亲和力。此外，FOXO 3或NDRG 1的强制表达分别部分逆转了SPOP F133V的表达，促进了DU 145细胞的生长(附图)。9A-d)，提示由于启动子甲基化导致这些TSGS的表达降低，导致SPOP突变增强了PCA细胞的生长。这些结果共同支持了DNMT结合，而不是GLP/G9a复合物的HMTase活性是SPOP突变诱导的全球DNA甲基化和表观遗传沉默这些TSGS的关键(图一)。6g).
图6：SPOP突变通过GLP/G9a与DNMT蛋白的相互作用调节DNA甲基化。a图为野生型GLP、酶活性突变体C1201A和ANK&NHHC结构域双缺失突变体。b转染指示质粒的22Rv1细胞的WCL和co-IP样品中有指示抗体的Western印迹。c–f用表达指示质粒和(或)shRNAs的慢病毒感染的22Rv1细胞进行westernblot分析。c)、国际金融公司(d)和MeDIP-qPCR(f)。用ImageJ定量测定各组5mC染色的光密度(OD)/核面积(象素)。数据显示为±SD(n=50个细胞/组)(e)。标度栏，10μm.显示的数据为±SD(n=3个复制/组)(f). g一种基于目前调查结果的工作模型。左边WT SPOP识别和促进GLP的蛋白酶体降解，从而破坏GLP/G9a复合物的稳定性，抑制GLP/G9a介导的与Dnmts和DNA甲基化的相互作用，诱导FOXO 3等肿瘤抑制因子的表达，抑制细胞增殖。正确的，PCa相关的SPOP突变不能结合和降解GLP，从而导致GLP/G9a复合物的升高及其与Dnmts的相互作用，增加DNA甲基化，抑制肿瘤抑制因子的表达，促进细胞增殖。然而，DNA去甲基化试剂(如5-AzaC)可以逆转SPOP-突变细胞的这一过程.统计学意义由未配对的双尾学生决定t测试(e, f)。(实验)b, c)被重复了两次。源数据作为源数据文件提供。
DNA甲基化抑制剂在体外和体内对SPOP-突变型PCA细胞对紫杉烷的敏感性
Dna去甲基化剂5-azaC已被批准用于治疗骨髓增生异常综合征(Mds)和其他类型白血病等异常dna甲基化的恶性肿瘤。45,46。5-AzaC与hdac抑制剂等其他药物的结合已被证明在某些癌症类型中是有效的。47,48。我们的机械模型(图1.6g)预测DNA去甲基化剂逆转SPOP突变介导的TSGS的超甲基化和表观遗传沉默，可有效恢复TSG的表达，抑制SPOP突变促进PCa细胞的生长。由于SPOP突变主要发生在PTEN阳性的PCa中，我们研究了SPOP突变对PTEN阳性的Pca细胞系22Rv1和DU 145的影响。正如预期的那样，SPOP突变体在22Rv1和DU 145中的表达促进了细胞的生长，但5-AzaC处理阻断了这一生长进程。7a，b)。我们从SPOP WT和Q165P突变体PCA PDX中生成了有机化合物。14。5-AzaC处理也阻断了Q165P突变体的生长，促进了三维培养中类细胞器的生长。7C，d)。因此，5-AzaC对SPOP-突变细胞和细胞器的抑制作用比SPOP-WT对照更为明显，表明DNA去甲基化剂可抑制SPOP突变的PCA细胞体外生长。
图7：SPOP-突变型PCA细胞对DNA去甲基化剂或与紫杉烷联合作用较敏感。a, b用MTS法测定22Rv1细胞的活力。a)和DU 145细胞(b5-AzaC(2μM)处理5天。数据显示为±SD(n=5个复制/组)。c, d用基质凝胶培养，用DMSO或5-AzaC(2或4μM)处理7天后摄影(c)和量化(d)。标尺，50μm。数据显示平均值±SD(n=6个字段/组)。e, fDU 145细胞经DMSO、DTX(0.05NM)、5-AzaC(2μM)或两者作用48h后，取细胞进行Western印迹观察。e)或接受MTS检测(f)。数据显示为±SD(n=5个复制/组)。g, hDU 145细胞表达EV或SPOP-F102C，用药物治疗。e)进行集落形成实验12天，然后拍摄(g)和量化(h)。数据显示为±SD(n=3个复制/组)。i–kDU 145细胞分别注射EV或SPOP-F102C。取SCID雄性小鼠，分别给予DTX(5mg/kg)、5-AzaC(2mg/kg)或DTX与5-AzaC联合治疗。在指定的时间点测量肿瘤体积(i)。肿瘤于第28天采集并拍照(j)，并测量肿瘤重量(k)。数据显示为±SD(n=6个重复/组)。l对GLP、G9a、5mC和Ki-67进行IHC染色。每组均取有代表性的图像。实验重复了两次。标尺，50μm。m–pIHC数据的量化(l)。不同染色强度(弱、中、强)的GLP细胞百分比(m)，G9a(n)和5mC(o)测定。Ki-67染色阳性细胞百分比(p)。数据显示为±SD(n=3例异种移植组织/组)。统计学意义由未配对的双尾学生决定t测试(a, b, d, f, h, i, k, p)。(实验)e)被重复了两次。源数据作为源数据文件提供。
紫杉醇包括多西紫杉醇(DTX)是一种用于治疗高危或转移性PCA的一线化疗。虽然dtx及其天然类似物紫杉醇(Ptx)已知通过与微管结合和稳定而导致细胞周期阻滞，但它们也通过在某些癌细胞类型中引起FOXO 3等FOXO家族蛋白的核定位和转活化而诱导细胞凋亡。49,50,51。如预期的那样，我们发现DTX处理增强了FOXO 3在22Rv1细胞中的核定位(补充图)。9E)。因此，我们试图验证这样的假设：5-AzaC(增加FOXO 3和其他TSG蛋白的表达水平)共同处理使SPOP突变的PCA细胞对DTX(引起FOXO 3核定位)敏感。如预期的那样，5-AzaC在DTX处理或不存在时增加了SPOP F102C-表达的DU 145细胞中FOXO 3和NDRG 1蛋白的表达(图1)。7E)。重要的是，MTS和集落形成实验表明，5-AzaC处理不仅能有效地抑制SPOP F102C-表达的DU 145细胞的生长，而且对DTX也有明显的致敏作用。7e-h)。5-AzaC单独或联合DTX明显的抗癌作用使人联想起它们对凋亡细胞死亡指标-PARP的表达的影响。7E)，表明这些作用是通过诱导细胞凋亡而起作用的，至少部分是通过诱导凋亡来实现的。DU 145异种移植研究也取得了类似的结果。7i-k)。IHC分析显示，SPOP-F102C异种移植物中GLP、G9a和5mC的表达较高，但5-AzaC处理可逆转GLP或G9a的表达，但未达到预期的水平(图5-AzaC)。7L-o)。与上述观察相一致，Ki-67在F102C突变型肿瘤中的表达明显高于对照组，但单独或与DTX联合应用5-AzaC可消除这一效应。7L，p)。这些结果表明，去甲基化试剂与紫杉烷的结合是治疗SPOP突变型PCA的一种可行的治疗策略。
