小鼠血液交换法测定CTCs的动力学及转移倾向

目前已有的获得转移过程中罕见循环肿瘤细胞(CTCS)扩散动力学的临床前方法不能直接测量CTC在循环中的输注率和半衰期。在这里，我们演示了一种测量内源性ctc动力学的方法，即在未麻醉的荷瘤小鼠和健康的无瘤小鼠之间持续交换几小时的含ctc的血液。通过跟踪ctc转移率，我们推断了小细胞肺癌(SCLC)、胰管腺癌(PDAC)和非小细胞肺癌(NSCLC)小鼠模型的半衰期在40到260秒之间，以及在60到107,000 CTCS/小时之间的输注率。此外，用我们的血液交换技术从晚期小细胞肺癌小鼠中直接转移1−2%的每日脱落的ctc，在健康的受体小鼠中产生大转移。我们设想，我们的技术将有助于进一步阐明CTCS的作用和在转移中的限速步骤。

循环肿瘤细胞(CTCS)--细胞从原发和转移的肿瘤沉积物流入血液--是转移级联的中间成分。测量它们在循环系统中的输注率和半衰期，这些循环系统共同控制着它们的血液水平，这是阐明它们在远处组织的播散和随后的转移集落生长的动力学的重要一步。传统上，肿瘤细胞的命运是通过在动物模型(主要是小鼠、大鼠和兔子)中静脉注射肿瘤细胞来检测的。1,2,3,4。通过对多只动物在接种后不同时间点的末梢血和其他主要器官的分析，初步研究表明血液循环半衰期极短(小于1s)。3,5。静脉注入的细胞在注射后的第一器官毛细血管中似乎几乎立即停止，但它们随后向继发性病变的增殖受特定器官内的宿主-肿瘤细胞相互作用的影响。尽管这些研究为“种子和土壤”假说奠定了基础。6,7,8这些方法不适用于从实体原发肿瘤中产生的内生CTCs的研究，这将显示出不同于已建立的细胞系的CTCs的生理特性。另外，以前的方法9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19尚未提供CTCS输注率的直接测量方法。

除了循环动力学外，对CTCs在远处器官实质中增殖的内在倾向进行直接的功能评估对于识别这些转移起始细胞的生物学特性具有重要意义。目前解决这方面问题的临床前方法要么依赖于小鼠细胞株，要么依赖于从患者体内血液样本中分离出来的ctcs，然后将其注射到免疫缺陷动物体内。20,21,22,23,24,25。虽然这些不同的研究为实验动物生长肿瘤提供了不同的方法来研究转移或探索不同的治疗方案，但较新的利用免疫活性小鼠的临床前方法和较少的体内外操作CTCS可能有助于更深入地了解CTCs在转移中所起的作用。

在此，我们提出了一种非麻醉小鼠之间的血液交换方法，用于研究内源性CTCs在周围基质和功能齐全的宿主免疫系统中的动力学。我们将我们的方法应用于小细胞肺癌(SCLC)的本土转基因小鼠模型(GEMM)，该模型的特点是血液中的ctc水平较高，此外还有非小细胞肺癌(NSCLC)的GEMM和各种类型的胰管腺癌(PDAC)，后者的特点是CTC水平明显降低。与脊柱侧凸不同，我们的方法不需要在两只小鼠的血管之间建立永久性的手术连接。相反，血液通过植入的导管被暂时交换了几个小时。我们这里描述的血液交换方法提供了一系列的实验，可以回答有关CTC特征与转移之间关系的基本问题。

直接ctc动力学研究中的血液交换

为了测量ctc半衰期和产生(血管内)率，我们使用一种同基因的、非荷瘤小鼠“健康”小鼠(Hm)作为由荷瘤小鼠(Tbm)产生的ctc的受体。对三种不同浓度的小鼠肿瘤模型进行了表征。在小细胞肺癌模型中，原发肿瘤是通过将cre表达的病毒传递到小鼠肺上皮而引起的，从而导致小鼠肺上皮细胞的缺失。Trp53, Rb1，和PTEN(统称PRPten)抑癌基因26激活tdTomato等位基因，在所有肿瘤细胞中产生红色荧光，包括来源的CTCs。小细胞肺癌TBMs存活约6个月后肿瘤开始，可检测的原发(肺)和转移(肝)肿瘤开始大约5个月后肿瘤开始。本研究中使用的PDAC模型包括一种通过胰管逆行输送cre表达病毒来启动的小鼠模型，该病毒能激活克拉斯G12D突变，删除Trp53，并激活tdtomato等位基因。27，和两种基于器官的原位模型(一种有定义的新抗原表达，另一种没有表达)。非小细胞肺癌模型是通过病毒cre介导的删除Trp53，激活克拉斯G12D突变与tdTomato等位基因激活28,29,30.

在我们的实验装置中。1A)，含ctc的血液在TBM(图中所示的例子描述了小细胞肺癌启动后5至6个月的TBM)和相同性别和基因型以及相似年龄和体重的HM对应者之间交换。交换的血液是通过两个ctc计数器实时监测的，因为它以60 L/min的流量以闭环方式泵出(补充图)。1和2A)。在每个ctc计数器内，荧光ctc使用532 nm的双波长激发。-激发激光束结构聚焦于微流控装置入口附近的血流通道(附图)。1和3)。为离线峰值分析和验证目的，记录了光电倍增管(Pmt)产生的双发射峰。31(无花果)1B)。虽然我们的ctc计数器目前没有区分单细胞和簇的能力，但对晚期小细胞肺癌小鼠的最终血液样本进行的荧光显微镜分析表明，血液中的大多数荧光(tdtomato+)细胞事件是由单细胞引起的。

为了继续进入循环系统，小鼠接受插管手术，将左颈动脉和右颈静脉的两根导管外化。两只未麻醉小鼠之间的持续血液流动由两个蠕动泵控制，可持续数小时执行，直到测定稳态ctc交换率为止。小鼠心率相对较高(每分钟400−600次，心脏排量约为20 mL/min)32)和低总循环血容量(约1.5−2mL)使我们可以假设CTCs在每只小鼠的血液中均匀分布，当两只小鼠之间的体积流速为60L/min时，连续采样。通过观察四只小细胞肺癌动物的实时扫描和心脏穿刺采集的最终血样中类似的ctc浓度，验证了这一假设(补充表)。1).

更详细的是，从TBM的颈动脉导管中提取的CTC通过第一个在线的CTC计数器(图中标记为“CTC计数器#1”)。1A和补充图。2A)在进入HM的颈静脉导管前进行实时计数。在60 L/min流量下，单个CTCs在管道内从一个循环系统到另一个循环系统的总输送时间约为2 min，在此过程中损失最小(见“方法”和附图)。2B)。残留在HM循环中的CTC由第二个CTC计数器(图2中的“CTC计数器#2”)检测和计数。1A和补充图。2A)，在他们返回TBM的右颈静脉之前。一旦原始pmt数据被处理，以便验证ctcount(如图所示)。1B)，然后绘制每个ctc计数器的累积计数，以提取计算半衰期时间和原发性肿瘤CTC生成率所需的ctc汇率。图形1C演示了这些血液交换实验之一的累积ctc计数随时间变化的例子，其中HM在4小时内接收了大约7,000个SCLC ctc，并在这段时间内将大约500个ctc送回TBM。实验的最后90分钟作为一个稳态间隔，在此期间，小鼠之间的汇率(r1和r2)进行实时动力学计算。

血液交换动力学模型

通过分析荷瘤小鼠和健康小鼠之间交换的CTC数量(双向)，我们可以监测每只小鼠体内CTCs的瞬时浓度，这反过来使我们能够估计CTCs从肿瘤中脱落的速度，以及它们随后从循环中清除的速度。为了估计ctc的产生率和半衰期，我们将我们的数据拟合成一个简单的模型，其中CTCS(以图中的红色球体表示)。2A)是由肿瘤微环境以恒定速率产生的。({{r}}{})在TBM中，通过在不同器官间倒入毛细血管或通过细胞死亡(以图中坦克底部的孔为代表)清除两只小鼠的循环。2A).

a用可视化的方法表示血液交换技术的相关参数，以解决CTCS的生成速率和半衰期问题。每只老鼠的循环系统被表示为一个红色球(CTCS)的混合容器。在tbm(左罐)中，ctcs以相当于肿瘤微环境的速率进入循环。r将军。Ctc循环外的间隙由每个容器底部的一个孔表示，其清除率为K清澈 × N.带有计数器的泵代表ctc计数器系统及其蠕动泵，它们以相等的速率传输含ctc的血液。C×Q. r反恐委员会的转移率。C*集中注意力。Q流量。K清澈一阶间隙系数。N每只小鼠的CTCs总数。b计算小细胞肺癌(SCLC)、胰管腺癌(Pdac)和非小细胞肺癌(NSCLC)血液交换实验(*)的ctc生成率和半衰期的散点图。p < 0.05 (pKruskal−Wallis非参数检验采用Dunn样本对分析)。对于SCLC来说，n=5项生物独立实验。对于PDAC来说，n分别为8、5和1个生物独立实验。新的，还有汽车。对于非小细胞肺癌来说，n=5项生物独立实验。汽车本土。Org.器官。新抗原。NS无意义。

全尺寸图像

我们假设ctcs在半衰期内循环的一级动力学(T){1/2}，或者，等效地，用速率常数清除。\({K}_{\rm{clear}={\rm{ln}(2)/{t}_{1/2}\)。描述每个鼠标中的CTCS数量如何随时间变化的微分方程是：

哪里(Q)就是泵的恒定容积流量交换老鼠的血液，(V)是每只老鼠的总血容量，(左(T)={n}{1}(T)/V)和左(T)={n}{2}(T)/V分别是荷瘤小鼠和健康小鼠体内CTCs的浓度。

每个CTC计数器(每个用一个带有数字计数器的泵表示，如图所示。2A)测量率CTCs从一只老鼠传到另一只老鼠，我们认为这与血液中CTCs的浓度成正比：[(R)}(T)={C}{1}(T)q]和[(R)}(T)={C}2}(T)q]分别用于肿瘤对健康的ctc计数器#1和健康对肿瘤的ctc计数器#2。如上所述，这种“良好混合”循环系统假设是合理的，因为一只小鼠的心输出量和较小的总血容量会导致小鼠体内的血液流量比60μL/min的小鼠之间的血液交换速度高出大约50倍。

给出的测量(R){1}和(r2})，ctc通过两个ctc计数器的稳态速率，我们可以估计ctc产生率和在流通中的半衰期如下：

为了验证这一模型，我们进行了5对小细胞肺癌、14只PDAC和5只NSCLC配对荷瘤小鼠与健康的、免疫能力强的小鼠之间的血液交换实验。在每个实验开始时，我们进行了一次初次扫描(至少10分钟)，分别扫描每只小鼠的血液，以确保正确的CTC计数器功能，可靠的CTC检测和稳定的血液从颈动脉通过CTC计数器并回到颈静脉。之后，血液交换过程至少进行了两个小时，以便有足够的时间使反恐委员会的汇率稳定下来。在五次小细胞肺癌血液交换实验中，从TBMs转移到HMS的CTC总数从2,000到8,000个不等(补充图中的蓝色轨迹)。4A3−7%的CTC从HM返回到TBM(补充图中的橙色轨迹)。4A)。在PDAC血液交换实验中，150至18,000个CTC从TBMS转移到HMS，15至6,000个被归还。在非小细胞肺癌实验中，将60例−120细胞转移到非小细胞肺癌中，10例−20被传回。

为了从经验数据中提取稳态汇率，在血液交换实验的最后一段时间内，将一条最佳拟合线应用于累积计数轨迹。在此间隔期间，ctc的变化随时间在每个鼠标(\({\mathrm{d}n}/{\mathrm{d}t}\))大约为零(即，r1和r2基本不变)。从不同的稳态间隔(30、45、60、75和90分钟)对ctc汇率进行评估，以推断平均和不确定度(误差)值。r将军和t1/2SCLC，PDAC和NSCLC血液交换实验的参数(图)。2B；“方法”)。这些r1和r2预算列于补充表格内。2.

无论是在癌症模型内部还是在不同的癌症模型之间，四氯化碳的生成速率都有几个数量级的变化(图1)2B，及补充表3)，部分原因是肿瘤在血液交换发生时处于广泛的发育阶段。例如，在我们的研究中，晚期的SCLC TBMs(肿瘤开始后5到6个月)，具有良好的原发性肺和转移性肝负荷(补充图)。4B)，四千至二万七千吨/小时的四千至二万七千个四千至二在14只PDAC动物中，12只的ctc代率在65~6,000只/小时之间，两只PDAC荷瘤动物的产瘤率超过50,000只/小时。非小细胞肺癌细胞集落形成率在100至800 CTCS/小时之间。通过评估每个模型原发部位的肿瘤细胞总数(见“方法”)，可以估计每天脱落的肿瘤细胞总数的比例以及每克肿瘤组织每天脱落的细胞数。携带小细胞肺癌动物每天脱落细胞总数和肿瘤细胞脱落数分别为0.07%或70万个/g；含小细胞肺癌动物每天分别为0.004%或40万个细胞；非小细胞肺癌动物每天分别为0.002%或20000个/g细胞。与ctc产生率不同的是，从40到260秒之间的半衰期时间在癌症模型内部和整个癌症模型中都更为一致(图1)。2B和补充表3)。综上所述，这些结果证明了血液交换技术在各种临床前模型中测量ctc动力学的实用性，这些模型具有不同的ctc浓度范围。

模型细胞系循环动力学与CTCS不同

为了将我们观察到的ctc动力学与传统的研究进行比较。2,4对小细胞肺癌细胞系进行球囊注射。我们收集了25000个表达tdtomato的活细胞，这些细胞是从从trp5中分离出来的小鼠小细胞肺癌细胞中分离而来的。Fl/fl；Rb1Fl/fl；PtenFl/fl；rosa26Lsl-tdTomato/lsl-荧光素酶小鼠体外繁殖33。这些细胞被悬浮在40L的生理盐水或血液中，并通过插入的套管静脉注射，然后用ctc计数器对活小鼠的血液进行3小时扫描(图1)。3A)。与上述内源性CTCs的行为不同，我们观察到近98%的注射细胞在几秒钟内就从循环中清除了出来(如图所示)。3B，c)。此外，当我们使用刚从原发和转移性肿瘤分离的肿瘤细胞重复注射实验时，我们观察到这些细胞在体内循环中的快速清除，表明所观察到的现象不是使用体外培养的肿瘤细胞系的产物。尽管如此，在所有四次细胞注射实验中，我们观察到一小部分(1−2%)的注射细胞在血液中仍能检测到数小时(如图所示)。3B，c)。这些观察提供了一个初步的迹象，即直接向静脉循环注入肿瘤细胞可能会歪曲CTC在循环中持续存在的真实动态。

为了检查静脉注射后的清除动力学是否受到肿瘤细胞进入循环的速度的影响，我们模拟了连续的、基于血液交换的注射速率，采用缓慢的细胞线注射技术(图1)。三维空间)。在这些实验中，一小瓶含有新鲜准备好的悬浮细胞的小瓶，来自上述SCLC细胞系，使用T形适配器连接到静脉回流线，允许使用第二个蠕动泵缓慢注入预定数量的细胞。类似于上述的球细胞注射实验，慢注射实验也导致了细胞的快速清除，以检测到的细胞的零星轨迹为代表(如图所示)。3E和补充图。5A)。这些轨迹表明，虽然肿瘤细胞在每次实验期间不断地被引入，但大多数细胞迅速从循环中清除出来。随着时间的推移，只有一小部分注射细胞被检测到，与CTC检测率相比，随后检测到的细胞之间的时间间隔要长得多。事实上，与内源性ctcs相比，在估计的稳态间隔时间内，细胞注射实验检测到的细胞比内源性ctcs少7倍。p < 0.05, Fig. 3F和补充图。5B，c)。这些结果进一步验证了先前的静脉滴注结果，并再次证明了内源性CTCs与来自同一肿瘤的体外培养细胞在循环动力学上的明显差异。

接下来，我们想要评估本地肿瘤和静脉循环引入的小细胞肺癌细胞产生的不同半衰期是否是由于细胞大小的差异造成的，因为通过小毛细血管的时间对细胞大小有很强的依赖性。34,35,36。我们的小组先前证明，悬浮细胞的浮力质量的测量可以作为它们通过微流控收缩的时间的代名词。37,38。为了比较ctcs及其模型scc细胞的浮力质量，我们开始使用排序功能。31利用悬浮微通道谐振器(Smr)平台对ctc计数器进行分类和充实，以便在随后的浮力质量测量中从携带小细胞肺癌的晚期小鼠中分离和丰富ctc种群。39,40。作为对照，一个有活力的SCLC细胞系被注入健康小鼠的血液样本(每100升血液中有1,000 tdTomato表达细胞)，然后用我们的ctc计数器对单个细胞进行分类和富集(补充图1)。6A)。有趣的是，这两个细胞群具有相似的浮力质量分布(p=0.3，Mann−Whitney−Wilcoxon非参数检验，附图.6B)，表明这两个种群中不同的细胞大小不能用来解释它们在循环中的不同持续时间。这也表明，这两种细胞的固有生物学特性可能是每个种群独特的循环动力学的主要决定因素。

我们继续研究这两个细胞群是否确实表现出独特的生物学特性，从而导致它们在循环中的寿命不同。为此，我们采用单细胞RNA测序(scRNA-Seq)技术对小细胞肺癌细胞株进行了分析，并从一只本地小细胞肺癌小鼠的最终血样中分离出一组CTC。对高变异基因的主成分分析(PCA)揭示了这两个群体的显着差异，CTCs与PC1阳性和阴性PC2相关，细胞株与PC1阴性和PC2阳性相关(补充图2)。6C)。为了探讨这些差异的生物学动因，我们对基因本体基因集的主成分和表达进行了相关分析。结果表明，PC1与上皮间充质转换(EMT)和细胞骨架组织的基因集呈正相关，与翻译和细胞周期基因集呈负相关(补充图)。6d)。这表明，EMT和细胞骨架标记物与CTCs的相关性较强，而与细胞周期相关基因的表达相对较高。PC2基因与翻译基因组呈正相关，与细胞骨架组织和细胞应激基因组呈负相关。需要进一步的实验来验证这些发现，并探索这些转录变异如何影响循环中相应细胞的行为，以及它们形成的远处肿瘤的位置和表型。

血液交换作为健康小鼠转移瘤的一种方法

在两个单独的实验中，我们观察到通过几小时的血液交换直接导入4,000−7,000小细胞肺癌CTC(仅占每天平均脱落CTCs的1−2%)能够在2至3个月内在健康的受体小鼠体内产生肝和肠转移(补充图1)。7A)。有趣的是，新开发的肝转移灶也能够脱落CTC，这一点通过在这些小鼠的最终血液中检测到tdTomato表达的CTCs而得到证实(补充图)。7b).

接下来，我们将进一步研究我们的研究方法的能力，通过血液交换将CTCS导入健康小鼠体内。两只健康的、免疫能力强的小鼠(ID：HM1和HM2)依次连接到晚期的小细胞肺癌GEMM，每只健康小鼠在2小时的血液交换过程中大约有8,000个CTC被引入(图1)。4A)。使用活体生物发光成像(BLI)技术，对健康受体小鼠进行了连续几周的肿瘤发育监测。两只受体小鼠在血液交换后大约两个月出现肝大转移(如图所示)。4B)。有趣的是，在肝脏而不是肺中可以观察到大转移，尽管CTCs起源于肺肿瘤，并通过右颈静脉进入，但在健康小鼠中遇到了肺微血管，这是第一个阻碍其留在循环中的主要障碍。这一观察结果与小细胞肺癌的传播模式相一致，也与报告肝转移为SCLC患者常见播散部位的临床表现相一致。41。为了进一步证实HMS中发育的肿瘤与供体小鼠相似，在肿瘤检测后处死HM1进行组织学分析。其中一个HM病灶的苏木精和伊红(H&E)染色的肝切片显示了一个小细胞肺癌转移性肝癌的组织学特征。4C)。综上所述，这些发现证实了血液交换技术可以用来在健康的受体小鼠身上制造转移性病变。未来的实验将需要有力地验证这些发现，并彻底探讨供体和受体肿瘤之间的差异。

在此，我们展示了一种研究CTCs在小鼠体内循环动力学的血液交换方法.通过在SCLC、PDAC和NSCLC小鼠模型上的实验，证明了我们的方法对不同的临床前模型的通用性，这些模型表现出很大的不同的转移模式。近45年前，用一种人造大鼠模型进行了最后一次对产生率的检查，当时据报道，乳腺腺癌ctcs以每天每克组织几百万个细胞的速度从实体肿瘤中脱落。42，这大约比我们的SCLC估计值高出5倍(大约每克SCLC肿瘤组织每天约有70万个细胞)，比我们的PDAC估计值大约高出90倍(大约每克PDAC肿瘤组织每天约有40000个细胞)，比我们的NSCLC估计值高出大约183倍(大约每克NSCLC肿瘤组织每天大约有2万个细胞)。以前关于ctc在鼠标循环中半衰期的估计数从秒到秒不等。2,43敬分钟13至小时44，使用多种检测技术。在临床上，ctc半衰期的研究依赖于肿瘤切除术后数小时的ctc检测。44，而临床前动物模型主要采用体内流式细胞仪追踪的荧光肿瘤细胞系。45,46。虽然较长的半衰期为30−60分钟，但这些测量仅基于注入细胞的一小部分，因为这些大量注入的细胞大多数在几秒钟内就被清除了。2,3。我们将这一早期工作与我们从血液交换技术获得的半衰期估计数分钟进行了对比，该技术涉及自然脱落、内源性ctcs，并依赖于从两只连接的小鼠的循环系统中实时检测到它们的实时进出速度。与CTCS不同的是，当我们以慢注入的方式模拟这些实验时，我们观察到的动力学与先前报道的细胞注射实验是一致的，在这些实验中，大多数细胞在几秒钟内就被清除了。我们的结果提出了这样一个问题，即先前对CTC在循环中停留时间的估计是否受到所采用的实验程序的强烈影响。

本文所讨论的血液交换技术还介绍了一种利用内源性CTCS产生转移瘤的方法.传统的方法要么使用细胞株，要么要求在接种动物模型之前，对具有转移潜能的CTCs的特定亚群进行分离、体外扩增和鉴定。13,20,21,22,47。在我们的方法中，来自原发灶和转移灶的小鼠的CTCs保留在其原始血液中，直接进入健康免疫能力受体小鼠的循环系统，而不需要进行富集或干预培养步骤，这些步骤可能会影响它们的生存能力，并深刻改变它们的生物学特性。重要的是，我们的方法可以延长研究转移性疾病的时间窗，特别是在肿瘤模型中，在完全发展的转移瘤分析之前，宿主小鼠会屈服于原发负担。41。需要进一步的研究来验证这项技术在其他癌症类型中的应用。

总之，报告的血液交换技术和由此产生的ctc动力学数据可以准确地识别转移级联的血液传输阶段的限速步骤。我们还设想，我们的血液交换技术可以直接和控制地交换其他血液成分，并在免疫学、癌症生物学和衰老等不同的生物学背景下研究免疫细胞的迁移动态。因为我们的血液交换技术可以连续地和纵向地使用，它可以潜在地揭示在分钟、小时或天之间发生的时间动力学，因此可能有助于建立适当的时间窗，以最大限度地提高治疗效果。