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靶向肌动蛋白成核促进因子黄蜂为造血恶性肿瘤的治疗提供了一种途径

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发表时间:2021-09-28 12:33作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

癌细胞依赖于肌动蛋白细胞骨架重排来实现活化、增殖、迁移和侵袭等特征性恶性功能。Wiskott-Aldrich综合征蛋白(Wasp)是一种肌动蛋白成核促进因子,是造血细胞肌动蛋白聚合的关键调节因子。黄蜂与恶性肿瘤的关系尚不完全清楚。由于黄蜂只在造血细胞中表达,所以我们进行了硅中筛选鉴定结合黄蜂并促进其降解的小分子化合物(SMCs)。我们在这里描述了这样一种鉴定的分子:这种针对黄蜂的SMC在体外和体内抑制几种造血恶性肿瘤中关键的黄蜂依赖性肌动蛋白过程,而不影响幼稚的健康细胞。这种小分子具有有限的毒性和免疫原性,因此,可以作为一种安全而精确的靶向治疗特定造血恶性肿瘤的有效策略。

导言

造血恶性肿瘤是癌症发病率和死亡的主要原因,2018年全世界估计有690 000人死亡,1 186 590例新病例。1。造血恶性肿瘤是淋巴增殖或骨髓增生疾病的一种异质集合,可在骨髓、血液、淋巴结和淋巴或非淋巴器官中发生。2。这些恶性肿瘤的主要特点是细胞增殖失控,运动能力增强,侵袭邻近或远端组织,使细胞能够扩散和侵袭身体内的其他组织。在本研究中,我们重点研究了常见的淋巴增殖性造血恶性肿瘤、白血病和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。3,4。造血细胞恶性肿瘤占2018年所有癌症相关死亡的10%,其中NHL和白血病是主要的血液病。1.

目前治疗恶性血液病的方法主要是化疗和放射治疗,白血病患者的造血干细胞移植通常紧随其后。5。这些治疗是非特异性的,伴随着严重的副作用,包括对感染的敏感性,脱发,慢性疲劳,心脏紊乱,不孕和继发性癌症。6。免疫疗法,如单克隆抗体、双特异性抗体、免疫检查点抑制剂、免疫调节剂和过继细胞转移(Act),已显示出显著的临床疗效,尽管许多患者仍因原发性、适应性和获得性耐药性而对这些治疗无效。7。在检查点抑制剂方面,Nivolumab(抗PD-1)治疗霍奇金淋巴瘤有很好的临床效果。8但NHL患者的完全缓解率很低9。此外,联合抗ctla-4和抗pd-1抗体治疗也取得了较好的效果。9,10,11。此外,抗CD 19嵌合抗原受体修饰T(car-T)细胞治疗复发性急性淋巴细胞白血病(ALL)或难治性B细胞淋巴瘤的疗效有限。12,13。虽然这些新的免疫疗法可能有助于减少化疗和放射治疗的严重副作用,但有许多报告称,由于对健康的旁观者细胞的损害、肾损害、细胞因子释放综合症和移植物抗宿主病(Gvhd),患者仍有严重的副作用。14,15,16。因此,开发治疗恶性血液病的新药物,副作用小,疗效高,仍是一项尚未满足的关键需求。

造血恶性肿瘤因肿瘤细胞的起源而不同,而且由于病毒感染或基因组不稳定引起的随机突变和染色体易位事件,在基因上也是多种多样的。17。肿瘤的形成是一个多步骤的过程,在这个过程中,细胞获得了被称为癌症特征的生物学能力,最终将其转化为恶性细胞。18。细胞骨架,特别是肌动蛋白网络,对于实现这些新获得的增强的细胞能力至关重要。19,20,21。癌症的这些特征使恶性细胞能够自动激活。22,23,24,以独立和无法控制的方式扩散,并越来越多地迁移。19,25、侵入及转移至邻近及远端组织。26。这些活动被定义为肌动蛋白依赖的过程。21.

Wiskott-Aldrich综合征蛋白(Wasp)属于肌动蛋白成核促进因子家族,通过激活肌动蛋白相关蛋白2/3(Arp 2/3),调节肌动蛋白-细胞骨架网络重排。黄蜂只在造血细胞中表达。27,因此在它们的细胞活动中具有独特的作用。28,29,30。黄蜂的这一重要作用可以在Wiskott-Aldrich综合征(WIS)或X-连锁血小板减少症(XLT)患者身上看到。由于黄蜂表达的缺失或减少,患者是否表现出广泛的免疫缺陷?31。虽然黄蜂本身在健康的造血细胞功能中起着关键的作用。32,33,34,35其在恶性造血细胞中的作用尚不清楚。来自黄蜂npf家族的其它黄蜂同源蛋白,如神经Wiskott-aldrich综合征蛋白(N-wasp)、黄蜂科verprolin同源蛋白(Wave)1-3、Wiskott-aldrich综合征蛋白和瘢痕同源蛋白(WASH)、与肌动蛋白、膜和微管相关的黄蜂同源基因(wasp同源性)和连接中介调节蛋白(Jmy)等,在大多数健康细胞类型中都有广泛表达,并在各种类型的肿瘤中扮演着重要角色。26,36,37,38,39.

在前人的研究中,我们建立了黄蜂降解的分子机制。40。细胞活化后,黄蜂在赖氨酸残基76和81上发生泛素化,位于黄蜂1(WH1)结构域,导致黄蜂发生蛋白酶体降解。此外,我们还证明了黄蜂相互作用蛋白(wasp-interaction protein,wip)掩盖了黄蜂在WH1结构域的泛素化位点,从而保护了其不41。细胞活化后,黄蜂被吸收到细胞膜上,并被小G蛋白Cdc 42激活,该蛋白与GTPase结合域(GBD)结合;同时,黄蜂在酪氨酸291上被磷酸化。这种激活释放了黄蜂的自抑制状态,在黄蜂的N‘端WH1结构域与WIP的C’端部分解离,同时保持了黄蜂C‘端与WIP N’端的相互作用。结果,黄蜂随后被cbl e3泛素连接酶降解。40,41,42,43。由于癌细胞的不断活化和黄蜂活性的诱导,黄蜂是肌动蛋白依赖过程的关键调节者,包括细胞的增殖、迁移和侵袭性。32,33,34,35黄蜂可能在介导癌症的这些特征中起着至关重要的作用。值得注意的是,患者是否在所有的造血细胞室中都有缺陷?33,44。因此,虽然黄蜂在癌症中的作用仍然是个谜,但它可能是治疗多种造血恶性肿瘤的一个有吸引力的靶点,相对于健康的非活化造血细胞而言。

在此,我们使用机器学习训练的预测器进行硅筛选,以识别可能干扰WH1域WIP-黄蜂相互作用的SMCs,从而使黄蜂处于降解状态。在数十个高分预测分子中,SMC,8-(2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)-1-isobutyl-3-(4-methoxybenzyl)-1,3,8-triazaspiro[4.5]decane-2,4-dione,称为黄蜂靶向SMC#13被选中。我们发现,该试剂能特异结合黄蜂而不是其同源物,诱导黄蜂降解,并抑制多种恶性造血细胞的活化、增殖、迁移和侵袭等细胞依赖性的过程,而不影响非造血细胞或造血细胞群。此外,我们还证明,这种针对黄蜂的SMC在小鼠体内可消除人NHL的生长。

结果

黄蜂结合细胞的硅筛选

为了确定可能与黄蜂结合并干扰其与WIP的相互作用的SMCs,我们对类似药物的候选化合物进行了机器学习增强的虚拟筛选(补充图)。1A).

由于黄蜂WH1结构域的结构模型目前不可用,利用已发表的N-黄蜂重组WH1结构域的NMR模型建立了一个替代模型,该模型通过连接片段稳定并融合到一个短WIP肽(PDB ID:2 IFS)上。45。由于N-黄蜂是黄蜂最接近的同源体,因此利用虚拟诱变工具对N-黄蜂-wip模型进行了修正。46以获得对黄蜂的相关预测。

随后,该结构模型被用于虚拟筛选从ChemBridge公司的“核心库化合物集合”和NIHMLSMR(分子库小分子库)获得的32万种药物类化合物的二维结构库。使用“快速”算法(如材料和方法中所述),为每种药物类化合物生成了多达10种不同的三维构象。47,48.

用替代黄蜂模型对每个药物样SMC候选体的每个构象模型进行了推测的结合评价。首先,通过PatchDock进行对接(参数在“材料与方法”一节中指定)49,50。然后利用基于机器学习的分类器对交互进行评分。简单地说,使用的分类器被训练来区分蛋白质-小分子对相互结合和不结合,根据对接结果。根据每对假定的蛋白质-配体模型的特征,将对接模型分别转化为数值表示(即特征向量)。通过将已知的蛋白质-SMC对(阳性标记样本)与SMC和蛋白质的随机配对(假设不发生,因此被标记为负数)进行对比,利用区分出现的和不存在的蛋白质-SMC对的对接模型来训练分类器。使用相同的对接模型结合训练分类器对载体管道进行特征化处理,对假定的结合对进行类似的评分(分数为0表示一个小分子与给定蛋白质结合的可能性最小,分数为1表示预测最有可能与该蛋白质结合的分子)。筛选出SMC-黄蜂的主要结合对。结果经进一步过滤后,剔除了与黄蜂降解位点不接近(>5)的任何结构,该结构由赖氨酸残基76和81组成。通过德林样力场结构优化,进一步评价了主要类药物分子。51重坞52候选人和蛋白质。虚拟筛选显示,在几十个高分预测分子中,smc、8-(2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)-1-isobutyl-3-(4-methoxybenzyl)-1,3,8-triazaspiro[4.5]decane-2,4-dione(补充图)。1B),被称为黄蜂靶向SMC#13,具有所需的特性,被选中用于进一步的特异性和生物学相关性的鉴定。我们使用Swissadme在线工具对药物相似潜力进行了分析。53并对SMC#13的理化性质进行了表征(表)1)。根据SMC#13的预测特征,在生物利用度雷达图中总结了其作为一种可行药物的药动学潜力(补充图)。1C)。作为补充图提供了SMC#13的质谱和核磁共振数据。13A和13B分别。此外,我们用高效液相色谱法(HPLC)测定了SMC#13的分布常数(logD~3.3)。1D).

表1使用SwissADME在线工具表征SMC#13的理化性质和药物相似势。

SMC 13与黄蜂的特异性结合

为了验证硅结合预测,我们用微尺度热电泳(Mst)技术确定了smc 13在全细胞裂解物中与黄蜂WH1结构域的特异性结合。54。我们在HEK 293 T细胞中表达YFP-黄蜂,它们是非造血细胞,内源性黄蜂缺乏表达,但表达WIP。制备了质量分数YFP-黄蜂的全细胞裂解液(WCL),并对其进行了MST荧光质量验证.测定了SMC~(13)与YFP-黄蜂的结合曲线,Kd为30.8±13.6nm。1A)。此外,我们还测试了SMC#13中预测的黄蜂WH1结构域结合位点。MST分析表明,SMC#13与YFP-黄蜂ΔWH1突变体的结合被消除,支持WH1结构域被认为是SMC#13的结合位点(图1)。1B).

图1:MST和BLI分析发现SMC 13与黄蜂的结合。
figure1

MST:稀释的细胞裂解液aYFP-黄蜂(n=5),以及b黄蜂ΔWH1(n从HEK的293个T细胞被连续稀释(1.5nm-200μM)smc#13孵育,然后将混合裂解物和smc装入标准处理的Monolith中。在高MST功率下,在NT.115单片机上用50%的蓝光LED功率测量了样品的荧光。用NanoTemperAnalysis2.2.31软件绘制了结合曲线,并将归一化荧光绘制成SMC浓度的函数。Kd为30.8±13.6nm。数据显示为平均±SD。生物素化GFP抗体超链霉亲和素生物传感器的BLI生物层干涉测量显示SMC#13与SMC_(13)结合cYFP-黄蜂,d黄蜂ΔWH1,eN-黄蜂-yfp,或fYFP-WAVE 2用串联稀释的SMC#13(50~200μM)分析所述蛋白的特异性结合。

采用生物层干涉法(BLAI)作为正交试验方法,验证SMC 13与黄蜂WH1结构域的特异性结合。如图所示。1CSMC~(13)与YFP-黄蜂(WH_1)之间存在明显的浓度依赖性结合,而SMC#13与YFP-黄蜂(ΔWH1)之间不存在浓度依赖性结合(图1)。1D)。在MST实验中,未发现SMC#13与黄蜂同源物如N-黄蜂或WAVE 2(补充图2)之间的结合。2A和b分别)。与N-黄蜂相比,WAVE 2缺乏WH1域。42,55它不可能与SMC#13结合,而是被用来控制对其他黄蜂家族成员可能产生的影响。此外,MST分析显示SMC#13与YFP标记没有非特异性结合(补充图)。2C)或不相关的SMC结合(岩石抑制-27632)与YFP-WASPwt(补充图.二维空间)。同样,BLI分析显示SMC#13与N-WASP缺乏非目标结合。1E),WAVE 2(图2)。1F),以及作为BLI实验减去参考的YFP标签。所有的结合实验都是在质量检查后进行的,采用westernblot分析(附图)。3A)。这些数据表明,SMC#13在WH1结构域与黄蜂特异结合,不与其他NPF同源基因结合,从而支持该化合物对造血细胞的选择性靶向作用。

以黄蜂为靶标的smc#13通过上调其泛素化而下调黄蜂细胞水平。

为验证所选SMC的生物学效应,将T-all Jurkat细胞随SMC#13浓度的增加而孵育24h,并与同等浓度DMSO(Vehicle)处理的对照细胞进行比较。2A,补充图。11)。不同浓度的SMC#13对白血病细胞的孵育导致黄蜂的相应下调,与对照相比具有剂量依赖性(图一)。2A,补充图。11)。在40M SMC#13培养24h后,黄蜂细胞浓度明显降低,因此我们选择该浓度作为进一步的体外实验。

图2:SMC#13促进黄蜂降解并下调其细胞功能。
figure2

aSMC 13对黄蜂水平的影响。T-所有Jurkat细胞随浓度增加而孵育,10μM(对照),20μM(对照),40μM(pSMC#13或载体(阴性对照)0.04值为阴性对照,细胞裂解,用免疫印迹法测定黄蜂细胞浓度(~65 kDa),以GAPDH~37 kDa作为负载对照。用ImageJ对各带进行密度测量分析。将相对黄蜂水平与车辆处理的对照细胞进行比较,并在图中显示。三个独立实验的平均(SEM)误差为均值±标准差。这个P采用单向ANOVA和Dunnetts多重比较试验计算数值.不是很重要。b泛素化试验活化T细胞用40μMsMC#13(+)或不加(−)MG 132蛋白酶体抑制剂孵育。用细胞裂解物免疫沉淀黄蜂,用抗Ub抗体对黄蜂泛素化反应进行免疫印迹分析。泛素化黄蜂带出现在~81 kDa以上。cWIP/黄蜂的FRET效率。将表达CFP-黄蜂和YFP-WIP的Jurkat细胞分别与40μM SMC#13或载体孵育,用抗CD3 Ab包被刺激腔的细胞,固定前刺激2 min。用Zeiss LSM 510共聚焦显微镜对活化的固定细胞进行成像,用供体敏化受体发射技术测定FRET效率。图表总结了平均百分比的FRET效率。(P值<0.0001)。数值显示为均值±扫描电镜(车辆,n=32个细胞;SMC#13,n=20个细胞)。这个P值是使用未配对计算的。t-测试。注:不显著。d用YFP-黄蜂(Wt)或YFP-黄蜂(YFP-wasp)ΔWH1转染Jurkat细胞。转染后24h,细胞与40μM SMC#13共孵育24h,然后裂解细胞,用免疫印迹法检测YFP-黄蜂水平,并与GAPDH负载对照进行比较。e用40μM SMC#13或载体孵育12 h后,用0.1mg/ml的环己酮处理Jurkat细胞。在指定的时间点采集细胞样本并溶解。以抗黄蜂和抗GAPDH作为负载对照(上板)免疫裂解液。在CHX(下面板)存在下,与车辆或SMC#13孵育后的黄蜂相对细胞浓度汇总图P≤0.0 5)。数值表示为均值(SEM)的平均±标准误差。(DMSO,n=6;SMC#13,n=3)。这个P数值是用双尾计算的。t-测试。f用40 mSMC#13或载体处理t-所有Jurkat细胞24 h,用XTT法测定细胞增殖情况。P价值=0.0371)。三个独立实验的平均值为±SEM。这个P数值是用双尾配对计算的。t-测试。g用40μM sMC#13或对照细胞孵育24 h,用抗活性LFA-1整合素抗体(KIM 127)染色,再用Alexa Fluor 488结合羊抗鼠IgG 1次级抗体染色,用流式细胞仪进行分析。有代表性的流式细胞仪图(P≤0.0 1)。

接下来我们将研究黄蜂水平的降低是否是由于其增强的泛素化和随后的降解所致。T-all细胞用SMC#13孵育,再用蛋白酶体抑制剂MG 132处理。细胞裂解后,用抗黄蜂抗体免疫沉淀,用抗泛素或抗黄蜂抗体免疫。正如预测的那样,用SMC#13处理几乎完全消灭了细胞黄蜂。然而,MG 132处理细胞可抑制黄蜂降解,恢复泛素化黄蜂的水平。2B,补充图。11)。这些结果与黄蜂通过增强泛素化和蛋白酶体依赖性降解而产生的SMC依赖性降解是一致的.

WIP与黄蜂结合,保护其降解位点不受泛素化的影响。40。因此,我们用荧光共振能量转移(Fret)来评估。41,56,57,58,59,60,61,62与SMC#13孵育后,黄蜂的泛素化作用是否增强,是干扰WIP-黄蜂相互作用的直接结果。T-所有表达cfp-wasp和yfp-wip的Jurkat细胞被镀在包被抗CD3抗体的刺激细胞上,2分钟后被固定。62。WIP与WASP之间的紧密联系有望通过CFP发射光谱的激发使YFP具有较高的FRET效率。在对照组细胞中,WIP和黄蜂的聚集率平均为37.7±3.1%,而CFP-黄蜂和YFP-WIP在SMC#13细胞中的FRET效率不明显(图1)。2C).

为了证实SMC#13通过与造血细胞WH1结构域的相互作用而诱导黄蜂的下调,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了一株黄蜂缺失的Jurkat细胞系(Jurkat Wasp KO)。将YFP-黄蜂(YFP-wasp wt)或YFP-黄蜂ΔWH1转染Ko细胞。细胞用40M的SMC#13或DMSO载体(对照组)处理。与SMC#13孵育可降低YFP-黄蜂的细胞浓度,但不降低YFP-黄蜂ΔWH1的浓度(图1)。二维空间,补充图。11)。这一结果进一步验证了SMC 13对黄蜂WH1结构域调控黄蜂降解的特异性。此外,为了证实黄蜂的降解不受肌动蛋白-细胞骨架聚合的影响,我们将Jurkat细胞与smc#13或肌动蛋白解聚药物细胞松弛素D共同孵育。63。细胞松弛素D或DMSO(阴性对照)对黄蜂的稳定性无明显影响,而SMC#13(补充图13)处理的黄蜂水平明显降低。3B)。为了进一步证实SMC#13对黄蜂翻译后修饰而不是其转录的影响,在健康供体PBMCs中测定了黄蜂RNA水平(补充图)。3C)。SMC#13与载体处理细胞(天真或激活)之间的mRNA表达水平无明显变化。因此,这些数据表明,黄蜂的下调是由于蛋白体降解增强,而不是由于黄蜂mRNA水平的改变或肌动蛋白骨架动力学的改变。

最后,我们进一步研究了SMC#13对黄蜂蛋白质稳定性的影响。64...SMC#13的短时间孵育表明,黄蜂在孵育8h后明显降解(附图)。三维空间)。因此,用SMC#13或载体预处理T细胞12h后,用CHX孵育细胞,8h以上测定黄蜂细胞浓度。2E,补充图。11)。在车辆处理过的细胞(NEG)中。(续)黄蜂水平相对稳定,与CHX孵育8h后黄蜂水平明显下降。相比之下,在SMC#13细胞中,黄蜂降解速度较快,前4 h后明显下降,4、6、8h后黄蜂水平下降43.2±12.3%。(P≤0.04),50.9±10.5%(P(≤0.02),增加75.7±4.3%。(P≤0.008)。这些数据表明,SMC#13通过一种促进降解的机制在蛋白水平上下调了黄蜂的表达。

SMC#13处理后黄蜂细胞浓度的下调抑制癌细胞增殖和整合素活化

Wis患者及缺乏症小鼠T细胞增殖能力明显降低。65。因此,我们用XTT法检测了SMC#13降解黄蜂对癌细胞增殖的影响。与对照组相比,SMC#13处理可使T-ALL细胞增殖显著降低40±8%(P<0.01)。P≤0.0 5)(图1.2F).

利用was患者或小鼠模型中的细胞进行的研究表明,黄蜂是肌动蛋白依赖过程的关键调节因子,包括细胞的激活、迁移和侵袭性。66,67,68,69,70。用抗CD3单抗刺激原发性T细胞时激活功能受损。24,71,72,整合素激活66,73。因此,我们研究了smc#13下调黄蜂对细胞活化的功能影响,如淋巴细胞功能相关抗原1(lfa-1)的亲和力成熟所证明的那样。74,75,76,77。恶性造血细胞经常被构成性激活。23。这种激活是从lfa-1的低亲和力构象向中间结合亲和力构象的转变来表现出来的,这是内-外信号的结果。78,主要依赖于F-actin结合到细胞膜上的适配蛋白,如文素或距骨素。79,80。Kim 127抗体可识别lfa-1的中、高亲和力构象。81,82。用SMC#13(红色曲线)处理T-all细胞,流式细胞术检测KIM 127染色,并与载体处理的细胞(蓝色曲线)进行比较。SMC#13处理可使LFA-1亲和力成熟率显著降低62.6±9.9%(P<0.01)。P≤0.0 1)(图1.2G,补充图。12A).

SMC#13治疗后,黄蜂依赖性迁移在造血细胞中被下调。

如上所述,黄蜂是支持造血细胞定向迁移的关键因素。33,70,83。为探讨SMC 13对肿瘤细胞迁移的影响,从新近诊断的、未治疗的边缘B细胞淋巴瘤患者中获得了恶性原发CLL细胞和原发NHL细胞。淋巴细胞从血样中分离出来,与SMC#13孵育,或以载体作为阴性对照。用Westernblot法测定原代CLL细胞的黄蜂细胞浓度。3A,补充图。11)和原发NHL细胞。3B,补充图。11)相对于车辆控制而言。SMC 13降低60±10.9%(P≤0.032)和54±12%(P≤0.0 5)在黄蜂原代细胞和NHL细胞中的浓度。淋巴瘤细胞具有高度迁移能力的特点,这使得其分布到远处的组织更容易。84。由于黄蜂是细胞运动的关键因素,我们研究了以黄蜂为靶标的SMC是否能抑制原代CLL和NHL细胞的迁移。细胞经iAM-1和sdf-1α预处理后,在玻片上播种。85,86。在SMC#13治疗后,细胞的运动被自动跟踪和分析。87。显著的是,经SMC 13处理的原代CLL细胞迁移到23.4±4.4μm,而对照组细胞迁移到75.7±6.7μm时,细胞迁移受到明显抑制(P<0.01)。P≤0.001)(图1.3C和电影沙一-S2)。这种作用在原发性边缘B细胞淋巴瘤细胞中也很明显,其中SMC#13治疗后细胞运动功能明显降低,与对照组相比,细胞运动能力下降到24±2.5μm,迁移距离为48.1±2.6μm(P<0.01)。P≤0.001)(图1.三维空间和补充电影3-4)。这些结果也证实了T-所有表达的黄蜂或黄蜂KO细胞的迁移分析,以确保SMC#13的目标效应。如图所示。S3E,黄蜂ko细胞的细胞位移明显减少,类似于描述良好的WAS患者细胞的表型,类似于smc#13的治疗。33。由于黄蜂只在造血细胞中表达,我们证实SMC#13不影响旁观者非造血细胞中的其他黄蜂家族蛋白(如N-黄蜂和波形)。因此,我们用划痕法证明SMC#13对非造血黑色素瘤细胞MEL 1106的迁移没有任何影响。如补充图所示。4当细胞松弛素D抑制细胞迁移时,SMC#13相对于载体处理的细胞没有任何影响(补充图)。4A-C).

图3:SMC#13下调黄蜂细胞浓度对原代癌细胞活性的影响。
figure3

a对黄蜂水平的影响:初级CLL细胞(P=0.0320)或b原代NHL细胞用40μM SMC#13或载体孵育24h(P=0.0469)。以抗黄蜂和抗GAPDH为负载对照,用免疫印迹法对细胞进行裂解和分析。用ImageJ对这些带进行了密度计分析,并在下面的印迹图中作了介绍。将相对黄蜂水平归一化为GAPDH,并与对照进行比较。三个独立实验的平均值为±SEM。这个p数值是用双尾配对计算的。t-测试。C,d40μM SMC#13孵育后的迁移试验c初级CLL(P < 0.0001), or d原代NHL细胞(P < 0.0001). Following 24 h incubation, cells were seeded on a chambered coverslip precoated with ICAM-1, and the random movement of the cells was assessed using Zeiss Observer Z1 inverted microscope and automatically tracked and analyzed. Left panel: Cell tracking analysis of five cells from a representative movie of each group. Each line represents the pathway of a single cell. Right panel: Graph summarizing the mean cell displacement (Neg Cont.: n=104个CLL细胞,467个NHL细胞;SMC#13n=58个CLL细胞,541个NHL细胞)。值显示为平均值±扫描电镜。P双尾未配对值t-测试显示。

SMC#13不影响天真健康的原代细胞

由于WIP的C端区与黄蜂的N端区发生分离,导致黄蜂降解位点的暴露。40因此,SMC#13结合可能影响WIP-黄蜂复合体的平衡,使其偏向于非束缚的开放构象。为了验证这一可能性,我们确定了SMC#13是否选择性地影响活化的造血细胞,包括恶性细胞。为此目的,从健康献血者的血液中分离出PBMC。56。PBMCs要么不经处理,要么用PMA和离子霉素激活。天真的细胞和活化的细胞要么用SMC#13处理,要么用载体处理。采用Westernblot法测定黄蜂细胞浓度。标准化黄蜂水平的天真和活化的SMC#13处理细胞计算相对于车辆处理的细胞(图一)。4A,补充图。11)。黄蜂水平的下调(72.8±7.3%)仅见于活化的SMC#13处理的PBMCs,而不存在于从健康供者获得的幼稚PBMCs中(72.8±7.3%)。P≤0.04)。

图4:SMC#13不影响黄蜂细胞浓度和黄蜂依赖性细胞功能。

aPBMCs与40 mSMC#13或载体孵育,未受刺激,或用1g/ml离体霉素和2.5ng/ml PMA刺激24h。P < 0.0001) and (P=0.0140(车辆未受刺激与SMC#13受刺激))。以抗黄蜂抗体和抗GAPDH作为负载对照,用免疫印迹法对细胞进行裂解和分析。用ImageJ对这些带进行了密度计分析,其数值如下所示。黄蜂细胞浓度水平归一化为GAPDH,并与未受刺激的载体细胞进行比较。三个独立实验的平均值为±SEM。这个P采用单向Anova和Tukey的多重比较检验计算值.注:不显著。b在40 mSMC#13孵育和(或)刺激PBMC后进行XTT增殖试验,如a。该图表总结了细胞相对于对照组的平均增殖百分比(P=0.0003对模拟车辆与SMC#13)。三个独立实验的平均值为±SEM。这个P采用单向Anova和Tukey的多重比较检验计算值.注:不显著。cPBMCs与40 mSMC#13或对照组孵育,不受刺激或刺激24h后,接种于预先包被ICAM-1的前房盖上。Z1倒置显微镜观察细胞迁移情况。左面板:对每组具有代表性的电影中的五个细胞进行细胞追踪分析。每条线代表单个细胞的通路。右边的图表总结了平均细胞位移(Neg Cont)。(−):n=301;SMC#13(−):n=255;Neg Cont.(+):n=301;SMC#13(+):n=264)(P < 0.0001 for Stimulated vehicle control vs SMC#13). Values are shown as mean ± SEM of three independent experiments. The P采用单向Anova和Tukey的多重比较检验计算值.注:不显著。

为了进一步研究SMC#13对活化PBMC的影响,我们用XTT法检测了这些细胞的增殖能力。为此目的,从健康献血者血液样本中分离出PBMCs,经SMC#13或载体作为对照治疗后,用PMA和离体霉素灭活或激活PBMCs(图1)。4B)。用SMC#13处理的幼稚PBMC在增殖方面没有任何明显变化。活化后,PBMC的增殖率比幼稚细胞提高了33.2±5.2%。P≤0.02)。值得注意的是,当活化的PBMC与SMC#13共同孵育时,其增殖率比载体处理的PBMC降低了73±10.2%。P≤0.0 1)。这些数据清楚地表明,SMC#13选择性地影响活化的细胞。

接下来,我们研究了SMC#13是否会影响从健康献血者那里分离出来的PBMC的迁移。细胞经PMA、离体霉素或左旋肌注灭活后,再用SMC#13或载体处理。值得注意的是,当使用SMC#13与载体相比,单纯的PBMCs在趋化性位移方面没有任何明显的变化。然而,细胞经SMC 13预处理后,其定向迁移能力减弱,细胞位移明显减少,与未活化细胞相比,迁移距离为36.4±2.7μm,迁移距离为76.1±3.2μm。P(≤0.00004),(图1.4C和补充电影5-8)。这些结果表明,SMC#13只影响活化的PBMC。此外,载体处理的活化pbmc表达的黄蜂水平明显高于黄蜂,这可能与恶性细胞中较高的黄蜂依赖性细胞活性有关,类似于其它黄蜂同系物,如N-黄蜂和波。88,89.

SMC#13缺乏细胞毒副作用

为了评估smc#13的潜在安全性,我们检测了中位毒性剂量(Td)。50)用碘化丙啶(PI)法测定细胞活力(补充图)。5)。新鲜分离的健康供体PBMCs与SMC 13浓度在18.75~600 M范围内孵育24h后,与阴性对照细胞比较,测定细胞活力。使用线性趋势线公式,TD50计算为171帕米。

其次,我们评估了SMC#13诱导溶血的可能性。在最低检测浓度下,SMC#13浓度为0.3125 mm,比体外(40M)浓度高7.8倍,溶血水平(0.7±0.07%)微乎其微。最高浓度为5mm,比体外浓度(40M)高125倍,溶血率仅为21.9±1.1%(附图)。6A).

我们进一步研究了SMC#13刺激免疫反应和细胞因子分泌的可能倾向。将SMC#13与正常人外周血单个核细胞孵育后,用ELISA法检测IL-6、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ等关键炎症细胞因子的分泌。SMC#13孵育细胞与阴性对照组比较,这些炎性细胞因子浓度无显着性差异(补充图)。6B)。这些发现表明,免疫系统在很大程度上不受SMC#13的影响,而且这种药物不会诱导细胞因子的释放。

全身SMC#13体内给药的安全性

为了确定SMC#13作为体内研究的铅化合物的适用性,我们检查了它是否对小鼠产生毒性作用。糖尿病/严重联合免疫缺陷(SCID/NOD)小鼠单次腹腔注射SMC#13 100 mg/kg或作为对照组。没有减肥的证据(补充图)。7A治疗后21天内发病率或压力的其他生理指标。为了进一步检查SMC#13作为一种用于延长治疗的药物是否可以耐受,我们测试了100 mg/kg的多次注射的安全性。(补充图。7b)。未检测到对心脏、肺、肝、肾、肠或脾脏(宏观或微观)的毒性效应或其他发病率或组织损害指标。这些研究支持了SMC#13在体内临床前疗效研究的安全性。

SMC#13体内药代动力学及血浆耐久性研究

采用高效液相色谱法(HPLC)对荷人Burkitt淋巴瘤(Raji)小鼠体内和血浆中的药代动力学进行了测定,进一步研究了SMC#13在体内的稳定性和分布。SCID/NOD小鼠在肩部皮下植入Raji细胞。一旦肿瘤发展,其体积平均达到300毫米。3给小鼠注射100 mg/kg的SMC~(13),在指定的时间点处死小鼠,并对血液和肿瘤标本进行分析。5A和补充图。8)。SMC#13在不同时间点的浓度如图所示。5A。值得注意的是马克斯肿瘤在30 min时为97.2±14.5M。5A,红色曲线)。这些数据表明,SMC#13可以通过血液系统地给药,并在前30分钟内达到肿瘤内40M的体外治疗浓度。

图5:SMC#13在体内的有效性研究。人NHL移植小鼠的给药。
figure5

a药动学I.P.后样品的高效液相色谱分析。在SCID/NOD小鼠体内注射SMC#13。小鼠腹腔注射SMC#13 100 mg/kg,在指定时间点取血和肿瘤标本,用高效液相色谱法(HPLC)检测SMC#13。该图给出了SMC#13的浓度动力学。数值为均值±扫描电镜。b用100 mg/kg SMC#13处理SCID/NOD小鼠,每日测定肿瘤体积。n=13)或管制(n=15)。箭头代表治疗的日子。(P≤0.001)。数值为均值±扫描电镜。这个P数值是用双尾配对计算的。t-每个点的测试。c肿瘤从第一次治疗到终点的平均增长率(从第0天到第16天)(P < 0.0001, n=13)。数值为均值±扫描电镜。这个P数值是用双尾配对计算的。t-测试。d实验结束时,小鼠(上面板)和肿瘤(下面板)的代表图像。e从肿瘤中提取的细胞数。(P=0.0322,阴性对照与smc#13)值为均值±扫描电镜(Dmso),n=14;SMC#13,n=11)。这个P数值是用双尾未配对计算的。t-测试。fRaji NHL细胞移植和载体处理NRG小鼠Kaplan-Meier存活曲线n=30)或SMC#13(n=31)。统计分析采用对数秩检验(P≤0.001)。

此外,我们还进行了SMC#13的血浆蛋白结合(PPB)测定,评价了其与全血浆蛋白的结合,以及附加血清的体外培养培养基。将SMC#13与全血浆、培养基或PBS孵育30 min后,用分子量为10 kD的方法从蛋白结合的SMC#13复合物中分离出未结合的SMC,用高效液相色谱法测定。SMC 13的PPB值为85.9%,添加胎牛血清(FCS)的体外培养基结合率为78%(附图)。9)。此外,我们还使用虚拟预测器preadmet预测smc#13的PPb值为85%。90.

SMC#13对全身给药后人NHL细胞体内肿瘤生长的抑制作用

为了确定SMC 13是否能抑制体内肿瘤生长,我们测定了SMC 13体内对人NHL细胞的抑制作用。我们在SCID小鼠皮下植入Raji细胞。一旦肿瘤平均达到100毫米3在体积上,将小鼠随机分为两组,每隔72h接受100 mg/kg SMC~(13)腹腔注射或每隔72h注射一次,共6次。每天测量肿瘤体积,以确定SMC#13对肿瘤生长的影响。5B)和肿瘤的平均生长速度从第一次治疗(图一。5C)。经smc 13处理的小鼠肿瘤体积明显缩小,平均为457.7±83 mm。3生长速度为23.8±5.3mm3/天,与平均肿瘤体积为1826.1±233.7 mm的载体处理的小鼠相比3生长速率为106.7±14 mm3/日(P≤0.001和P≤0.0001)(图1.5B-d)。此外,与对照组相比,经SMC 13处理的小鼠肿瘤细胞数量明显减少(P≤0.0 5)(图1.5E)。此外,SMC#13能显著延长荷瘤小鼠的存活时间。5F).

SMC#13抑制人NHL肿瘤细胞经治疗后恢复的黄蜂依赖性细胞功能

最后一次腹腔注射黄蜂24 h后,对NHL瘤进行细胞浓度的体外分析及其对NHL的调节。与以前的结果一致,与对照组相比,SMC 13处理小鼠细胞中的黄蜂水平降低了46.3±6.4%。P≤0.0 1)(图1.6A,补充图。11)。经SMC 13处理的肿瘤细胞增殖率降低80±3%(P<0.01)。P≤0.0001)相对于对照组小鼠的细胞(如图所示)。6B)。与对照组相比,治疗组整合素活性降低了30.8±3.4%(P<0.01)。P≤0.02)(图1.6C,补充图。12b)。此外,全身给药导致淋巴瘤细胞的体内外迁移能力降低,平均位移为20.5±2.6m,而在载体处理的细胞中平均位移为80.7±8.5m。P≤0.0001)。SMC#13下调黄蜂对B-NHL细胞迁移的影响,平均下降74.6%。6d)。其次,我们通过检测ECM降解量来确定肿瘤细胞的侵袭能力。从SMC#13和载体处理的小鼠体内分离出相同数量的肿瘤细胞,在荧光明胶上孵育24h。用明胶降解法测定细胞侵袭能力,用phalloidin F-actin染色法计算细胞面积。引人注目的是,与SMC#13处理的肿瘤细胞相比,对照组小鼠的肿瘤细胞平均明胶降解面积为92.2±2.9%,平均明胶面积为31.5±3.3%(P<0.05)。P≤0.0001)(图1.6E).

图6:SMC#13体外抑制小鼠肿瘤细胞在体内的黄蜂依赖性细胞功能。行政管理。
figure6

aWesternblot检测黄蜂水平。对SMC 13或对照组小鼠肿瘤细胞进行裂解,免疫印迹法分析黄蜂的表达,并将其归一化为GAPDH作为负载对照。用ImageJ对各带进行密度测量分析。相对黄蜂水平与车辆处理的小鼠进行了比较,如下图所示(n=6,P=0.0030)。数值为均值±扫描电镜。这个p数值是用双尾配对计算的。t-测试。b用XTT法检测SMC#13或载体处理小鼠肿瘤细胞增殖试验n=6,P≤0.0001)。数值为均值±扫描电镜。这个P数值是用双尾配对计算的。t-测试。c流式细胞仪(FACS)分析SMC#13或载体处理小鼠肿瘤细胞活性LFA-1的表面染色n=8)。d从SMC#13或载体处理的小鼠肿瘤中提取的细胞接种在预包被ICAM-1的前角果皮上。Z1倒置显微镜观察细胞迁移情况。左面板:对每组具有代表性的电影中的五个细胞进行细胞追踪分析。每条线代表单个细胞的通路。右边的图表总结了细胞的平均位移。(Neg Cont.)n=87;SMC#13:n=58)。(P≤0.0001)。数值为均值±扫描电镜。这个P数值是用双尾未配对计算的。t-测试。e从SMC#13或载体处理的小鼠中提取的细胞在荧光凝胶上孵育一夜。培养后,细胞被固定,渗透,用phalloidin 594染色。用Zeiss共焦激光扫描显微镜(LSM 510 META)获取图像。利用ImageJ软件对图像进行分析,用[(降解面积)/(细胞面积)]×100方程确定降解率。(尼格。续:n=31个细胞;SMC#13n=46个细胞,3个独立实验)。(P≤0.0001)。数值为均值±扫描电镜。这个p数值是用双尾未配对计算的。t-测试。fSMC#13或对照组小鼠的肿瘤切片(I.P.)注射用DAPI和抗Ki-67 Ab染色,其次为Alexa Fluor 594-共轭山羊抗兔次级抗体。P≤0.0001),或与g抗裂解Caspase-3 Ab,其次为Alexa Fluor 594-共轭山羊抗兔次级抗体.用雷卡共聚焦激光扫描显微镜(LeicaSP 8)获得亮场和荧光图像。(P≤0.0001)。数值为均值±扫描电镜。这个p数值是用双尾未配对计算的。t-测试。

为了进一步阐明SMC 13对肿瘤细胞的影响,我们采用免疫组织化学(IHC)技术检测了小鼠肿瘤切片中增殖标志物Ki-67和Caspase-3作为凋亡标记物的表达水平。组织学分析显示,Ki-67染色检测细胞增殖有显着性差异(图1)。6f)。与对照组相比,经SMC 13处理的小鼠肿瘤切片中Ki-67减少了2倍。肿瘤切片用一种能识别Caspase-3活性切割形式的抗体染色,以检测凋亡细胞。我们观察到,与对照组相比,SMC#13处理的小鼠切片凋亡细胞增加了2.45±0.01倍(图1)。6g).

综上所述,我们的数据表明,SMC#13与肌动蛋白-细胞骨架的关键调节因子黄蜂特异结合,促进其降解,并下调基于肌动蛋白的过程,包括整合素激活、细胞增殖、迁移和侵袭性。本研究表明,以黄蜂为靶标的SMC对人白血病/淋巴瘤细胞有较强的抑制作用,并有可能成为临床试验的靶标。

讨论

目前对某些类型造血恶性肿瘤的治疗大大提高了总体生存率(例如,侵袭性NHL),而对其他类型的造血恶性肿瘤(如AML)的现有治疗则远远不够。此外,标准化疗仍面临相当大的挑战,包括缺乏特异性、高毒性和多重副作用。91,92,93,94,95,96。因此,需要新的治疗策略,以提高疗效和减少目前的缺点,无论是替代单一疗法或组合疗法。

到目前为止,黄蜂在恶性细胞中的作用与其同系物N-黄蜂和非造血细胞波的已知性质相比,尚不清楚。在本研究中,我们利用黄蜂泛素化和降解的自然机制作为一种专门针对造血癌细胞的策略。WASP作为肌动蛋白细胞骨架的关键调节因子在WASS/XLT患者中起着重要的作用。从这些病人身上获得的细胞表现出不良的激活、增殖和迁移能力。71,73。这些肌动蛋白依赖的过程21是癌症发展的标志18。因此,阻断黄蜂的信号和活性可望在造血恶性肿瘤中破坏这些功能。为了开发这种抑制剂,我们首先利用机器学习平台进行硅筛选,并确定SMC#13是黄蜂降解的潜在诱导剂,从而阻断了血液病中黄蜂依赖的细胞骨架动力学。

由于黄蜂的稳定性在很大程度上依赖于wip,到目前为止还没有得到完全的纯化。97。因此,传统的结合方法,如等温滴定量热法(ITC)或表面等离子共振法(SPR),不适合与全长蛋白质结合,而且对碎片的使用也具有挑战性。98。因此,我们测定了SMC#13结合荧光标记黄蜂的MST和干涉分析。

SMC 13对黄蜂的亲和力估计值与诱导黄蜂降解所需的有效浓度(Kd分别为30.8nm相对于40M)之间的差异,可能是由于SMC具有较高的亲脂性和中等的溶解度,配以logD~3.3(附图)。1D)99或者是由于WIP的强度,黄蜂在生理条件下相互作用,只有在较高浓度的SMC#13下才可能被破坏。

黄蜂只在所有造血系中表达,红细胞除外。100。黄蜂表达的组织特异性使其成为造血细胞靶向的靶点,限制了对旁观者非造血细胞的潜在离靶效应。Torres等人以前的研究表明,黄蜂在开闭构象之间保持着动态平衡。101。当造血细胞处于静止状态(未受刺激)时,黄蜂的优势细胞形态是封闭构象,这种构象被gbd与vca结构域的分子内相互作用所自抑制。101。我们和其他人证明WIP是黄蜂的伴侣,这种相互作用通过泛素化保护黄蜂不被降解。40,62,102,103,104。利用三色FRET技术,我们先前发现pkcθ在丝氨酸488残基上的wip磷酸化使其C-端从与黄蜂N-端的相互作用中释放出来,使黄蜂的泛素化位点暴露于E3连接酶cbl-b和c-cbl。40。我们提出的SMC 13的作用机制包括改变WIP-黄蜂的结合动力学,从而促进黄蜂的降解。7).

图7:SMC#13下调黄蜂的建议模型。
figure7

细胞活化后,黄蜂在位于WH1结构域的赖氨酸残基76和81上发生泛素化反应,导致黄蜂发生蛋白酶体降解。WIP掩蔽黄蜂泛素化位点,从而防止其降解。细胞活化后,黄蜂从自身抑制状态释放,在黄蜂N‘端WH1结构域与WIP的C’端发生部分解离,同时保持黄蜂C‘端与WIP N’端的相互作用。结果,黄蜂随后被E3泛素连接酶Cbls降解。SMC#13通过进一步干扰WIP,促进黄蜂在活化细胞中的降解,从而促进黄蜂泛素化。

我们的治疗策略的额外选择性在于观察到恶性细胞经常被高度激活,因为它们经常获得体细胞突变,诱发激活信号通路或破坏反馈机制。18,23,105。因此,高活性细胞比幼稚细胞更容易受到SMC#13的处理。恶性细胞中一个相对常见的突变发生在RAS gtp酶超家族,诱导细胞活化。106,107,108。Rho家族的几个成员经常在多种癌症中发生突变。具体来说,参与黄蜂活化的cdc 42及其全球环境基金vAV经常在造血系统中发生突变。109,导致这个信号轴的本构激活。黄蜂活化影响黄蜂与WIP的关系40,41。证明黄蜂激活与WIP的关联的证据来自Murga-Zamalloa等人的发现。NPM-ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤(Alcl)细胞110。本研究表明,黄蜂在Y 102上的磷酸化诱导其激活,导致WIP的断裂和黄蜂的降解。有趣的是,在ALCL中,通过敲除或表达黄蜂突变体(Y102F)而损害黄蜂的活性,会损害黄蜂的恶性表型。最后,一个构成性磷酸化的黄蜂突变体(Y102E)与WIP的相关性降低,从而降低了黄蜂的稳定性。这些发现支持了这样的观点:干扰WIP-黄蜂的相互作用,使用SMCs可以通过促进黄蜂的降解来减轻多种造血癌症。

我们检索了癌症基因组图谱(TCGA)数据库,以评估黄蜂在人类造血恶性肿瘤患者中的作用。为此,我们使用了UALCAN门户。111探讨造血恶性肿瘤患者生存统计与黄蜂或N-黄蜂表达的相关性(附图)。10)。如图所示。S9a淋巴母细胞急性髓系白血病(LAML)的黄蜂表达水平较低/中蜂表达者寿命短(P<0.05)。P=0.032)。相反,当患者的生存曲线与N-黄蜂的表达相关时,高表达或低表达/中表达之间没有显着性差异(补充图)。10b)。弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)与黄蜂的表达有相似的相关性,但由于TCGA数据库中样本数较少,差异无显着性(补充图)。10C-d)。TCGA数据库仅包括这两种类型的造血恶性肿瘤。

现代治疗方法主要集中在上游受体或中枢异常信号通路。这些方法可能是无效的,因为其他途径可能导致患者的原发性、获得性或适应性耐药性,导致复发。然而,黄蜂是一种重要的全球效应蛋白,它的直接降解应该是一个敏感的靶点,而不管特定的淋巴癌或病人的突变谱如何。黄蜂的活性是使癌细胞具有细胞功能所必需的,因此,即使在没有特定突变的细胞中,干扰黄蜂的功能也会产生强大的抗肿瘤作用。

总之,SMC可以作为一种针对黄蜂和额外造血特异性细胞骨架蛋白的原型策略。在体内以黄蜂为靶标的SMC的安全性和有效性,以及干扰淋巴癌细胞关键细胞效应蛋白的策略所固有的优势,突出了这种治疗的巨大前景,以及进一步发展其在临床研究中的重要性。


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