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一种具有干细胞特征、去分化锥状和神经元/神经节细胞基因表达的高风险视网膜母细胞瘤亚型

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发表时间:2021-09-28 12:09作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

视网膜母细胞瘤是儿童眼内恶性肿瘤中最常见的一种,起源于发育中的视网膜成熟锥体前驱物。对于这种癌症的生物学和临床行为的分子基础知之甚少。在这里,我们用多组学数据证明了两种视网膜母细胞瘤亚型的存在.亚型1,早期发病,包括大多数可遗传形式。它除了引发基因改变外,几乎没有其他的基因改变。Rb1失活并对应于表达成熟锥体标记的分化肿瘤。相反,2亚型肿瘤有频繁复发的基因改变,包括MYCN-放大。它们表达低分化锥的标记物和具有明显的肿瘤间和肿瘤内异质性的神经元/神经节细胞标记物。2亚型锥体脱分化与低免疫和干扰素反应、E2F和MYC/MYCN活化以及较高的转移倾向有关。这两种亚型的识别,一种是维持锥体分化状态,另一种是与锥体去分化和神经元标记的表达相关的更具侵略性的亚型,为视网膜母细胞瘤开辟了重要的生物学和临床前景。

导言

视网膜母细胞瘤是一种罕见的儿童生长中视网膜癌,发病率约为17,000例活产婴儿中的1例。1,2,3,但却是最常见的儿童眼内恶性肿瘤。视网膜母细胞瘤的主要治疗目标首先是通过早期发现、治疗和预防转移扩散来挽救儿童的生命。次要目标是保持眼睛和最大限度地发挥视觉潜力。4。在低收入国家,视网膜母细胞瘤由于诊断延迟、缺乏多学科视网膜母细胞瘤特有的医疗保健和社会经济因素而导致患者存活率低。在高收入国家,95%以上的病例获得了肿瘤缓解,但仍有部分患者发生转移。5。转移可以通过视神经传播到中枢神经系统(CNS),并通过巩膜传播到轨道。视网膜母细胞瘤也会引起全身转移。6。一些组织病理学特征被认为是肿瘤进展和转移的高危因素。7.

视网膜母细胞瘤通常是由双等位基因失活引起的。Rb1抑癌基因少数非遗传性视网膜母细胞瘤(<2%)是由MYCN-放大Rb1失活8。在大多数情况下,遗传性视网膜母细胞瘤是双侧的,而非遗传性的病例总是单侧的.

视网膜包括六种类型的神经元(棒和锥光感受器、双极细胞、无长突细胞、水平细胞和神经节细胞)和Müller胶质细胞,所有这些神经元都是由多功能视网膜前体细胞产生的。9,10。人视网膜母细胞瘤的研究表明,视网膜母细胞瘤的起源细胞是锥体前体细胞。11,12,13,14,15.

三项基于基因表达谱的研究在视网膜母细胞瘤分子亚型和视网膜母细胞瘤中表达的视网膜细胞特异性标记的可能存在的问题上得出了相互矛盾的结论。16,17,18。超越Rb1,视网膜母细胞瘤中唯一反复突变的基因(7-13%)是表观遗传修饰基因。BCOR19,20,21。已确定了重复的基因组改变:在1q,2p上的增益和扩增(目标)MYCN)和6P,13q上的损失(瞄准目标)Rb1)和16Q22,23,24,25。一些研究报告了高拷贝数改变、诊断年龄以及其他临床和组织病理学变量(包括单边性、非遗传状态和低分化程度)之间的正相关关系。24,26,27,28,29,30。尽管有大量的发现,但是缺乏一个理解视网膜母细胞瘤生物学和临床行为的分子框架。

本文通过对102例视网膜母细胞瘤的转录组、甲基组和DNA拷贝数改变数据的综合分析,确定了两种与不同临床和病理特征相关的视网膜母细胞瘤亚型(年龄、侧方、遗传和生长模式)。进一步的特性为这两种亚型的相关性提供了证据,以了解视网膜母细胞瘤的生物学,并为这种疾病的临床治疗提供证据。除RB1失活外,少数基因改变与1亚型肿瘤有关。相反,除了RB1失活外,几乎所有2亚型肿瘤都有其他复发的基因改变,包括MYCN放大。与作为视网膜母细胞瘤起源细胞的成熟锥前体相一致,我们发现这两种亚型都表达锥标记。通过对锥体分化包括免疫组织化学、视网膜细胞器和单细胞的详细分析,我们发现亚型2型肿瘤的分化程度低于1型肿瘤,并且表达的神经元/神经节细胞标记物具有明显的瘤间和瘤内异质性。这种2亚型的下锥体分化与干细胞特征有关,包括转移倾向较高,如对112例视网膜母细胞瘤(包括转移性肿瘤)的研究所示。

结果

两种具有不同临床和病理特征的视网膜母细胞瘤分子亚型的鉴定

我们分析了102例视网膜母细胞瘤(补充资料)。1)。为了研究不同的视网膜母细胞瘤分子亚型的存在,在102例视网膜母细胞瘤中,我们结合了三种方法:mRNA表达、DNA甲基化和体细胞拷贝数改变(SCNAs)。72种肿瘤中的53种都有这三种数据集,而所有72种肿瘤中至少有2种数据集是可用的(补充数据)1)。在这三个组学数据集中,我们计算了k集群(k-分区),对于k的各种值,通过无监督的分层聚类,使用不同数量的特征和不同的链接(参见“方法”一节)。然后,对于每个组学和k的每个值,我们进行了一个共识聚类分析,得到一个一致的k-划分。这样,基于转录组和基于甲基组的分析都在两个集群中产生了稳定的一致性分区,而基于SCNA的分析在五个集群中产生了稳定的一致性分区(图1)。1A、上面板和附图。1A)。采用聚类聚类方法对三个分区的聚类成员关系进行了分析,简单地建立了样本共分类矩阵,然后利用完全连锁进行层次聚类。结果显示,两种分子亚型周围的三个分区聚集了89%(64/72)的病例(图)。1A、中间面板和附图。1B)。最接近的质心分类属于64个分类样本中的63个亚型。此外,8个未分类样本中有6个属于亚型,最终得到69个分类样本(69/72,96%):31个属于亚型1,38个属于亚型2(图2)。1A下面板和补充图。1C,补充数据1).

图1:基于多组学的视网膜母细胞瘤分子亚型及临床特征。
figure1

a视网膜母细胞瘤基于转录、DNA甲基化和拷贝数改变数据的一致聚类(上面板)。无监督聚类分析(中间面板)。基于质心的监督分类(底部面板)。最终组学亚型:亚型1,n=31(黄金);第2亚型,n=38(蓝色);未分类,n=3(灰色)。b显示基于9-CpG分类器的甲基化值的热图(左面板)。17例肿瘤(中面板)焦测序和甲基化体阵列检测甲基化值之间的相关性。采用双面皮尔逊相关检验。基于9-CpG的分类器应用于初始序列中的17个肿瘤的子集,在16例病例中得到了与组学方法相同的分类(一例未被基于9-CpG的分类器分类)。基于9-CpG分类器的30个额外肿瘤的亚型分配(右面板)。c96例视网膜母细胞瘤的分子分型及其主要临床和病理特征。p≥0.05(Ns)p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), p < 0.001 (***), p < 0.0001 (****). For comparisons of Rb1两个亚型的生殖细胞突变、横向、生长方式、肿瘤直径和坏死。2进行了测试。为比较两种亚型的诊断年龄和肿瘤直径,采用双侧Kruskal-Wallis秩检验。为比较两种亚型的视神经侵犯、脉络膜和巩膜侵犯情况,采用了双侧Fisher‘s精确试验。精确性p-表中提供了数值1.

为了将我们102个肿瘤系列中剩下的30个肿瘤划分为一个亚型,我们建立了一个基于9-CpG的分类器,该分类器基于全基因组CpG甲基化阵列分析(见“方法”部分)(见图)。1B、左面板和补充数据1)。我们证实,在定量CpG甲基化水平的DNA甲基化阵列和焦测序分析有高度的一致性(图一)。1B、中间面板)。该9-CpG分类器将其余30份样本中的7份归于1亚型,20份归属于2亚型,而3份仍未分类(图1)。1B,右面板)。全部肿瘤(96/102,94%)可分为两种亚型之一(38例为1亚型,58例为2型)。

然后我们比较了这两种亚型的临床和病理特征。1C1,补充数据1)。1型肿瘤患者在诊断时明显年轻(中位年龄为11.0vs23.9个月;Wilcoxon秩和检验,p=8.9×10−11)。此亚型包括75%的双边(p=1.51×10−3)和70%的遗传病例(p=7.68×10−4)。出乎意料的是,在1型肿瘤患者中,诊断年龄在遗传型(中位数=10.2个月)和非遗传型(中位数=11.2个月)之间没有显着性差异(Wilcoxon秩和检验),p=0.451)。同样,对于遗传性和非遗传性2型肿瘤的诊断年龄也没有显着性差异(中位数分别为19.8和24.7个月,Wilcoxon秩和检验,p=0.320)。视网膜母细胞瘤一般表现为外生生长(进入视网膜下间隙)、内生生长(朝向玻璃体),或较少出现混合生长模式(内生和外生)。1亚型肿瘤更有可能是外生肿瘤,而2亚型肿瘤大多为内生肿瘤(p=7.33×10−4)。坏死区在2亚型肿瘤中比在1亚型肿瘤中多见(p=0.020)。肿瘤直径和组织学危险特征(视神经侵犯、脉络膜或巩膜侵犯)在两种亚型之间没有显着性差异。

表1按分子亚型分层的患者的临床和组织病理学特征。

亚型2显示出比亚型1更多的基因改变,并包括MYCN-扩增肿瘤

我们通过确定两种肿瘤亚型的SCNA谱(补充数据),研究了两种肿瘤亚型的基因组特征。2)。第一季,第二季收益(MYCN),6p,13q,以及13q的损失/LOH(Rb116Q是最常见的改变,与报道的视网膜母细胞瘤的结果一致。22,23,24,25。6p增益和13q丢失/LOH在肿瘤亚型之间分布均匀,而1q增益、2p增益和16q丢失/LOH在第2亚型样本中更为常见(p=5.5×10−11, p=0.0037,以及p=1.8×10−7)(图1.2A). MYCN放大范围从14份到246份不等(补充数据)2仅见于2亚型肿瘤(10/58)(p=0.013)。

图2:两种视网膜母细胞瘤亚型的基因组特征、体细胞突变情况和DNA甲基化特征。
figure2

a第1亚型体细胞拷贝数改变的模式(顶部,n=38)和亚型2(底部,n=58)视网膜母细胞瘤。b比较1亚型肿瘤基因组不稳定性的盒形图(n=38)和2亚型肿瘤(n=58)。在2型肿瘤中,非-MYCN-放大(n=48)和MYCN-放大(n10)肿瘤也显示。对第1亚型和第2亚型进行双边Wilcoxon检验,结果有显着性差异:p=3.3×10−7;第1亚型与第2亚型非-MYCN: p=1.2×10−7;第1亚型与第2亚型MYCN-放大:p=0.147;及第2亚类非-MYCN-扩增的VS 2亚型MYCN-放大:p=0.014。c比较1亚型肿瘤间体细胞突变数目的盒形图(n=25)和2亚型肿瘤(n=41)。在2型肿瘤中,非-MYCN-放大(n=33)和MYCN-放大(n8)肿瘤也可显示。用双面Wilcoxon检验1亚型与2亚型的显着性差异:p=8.1×10−7;第1亚型与第2亚型非-MYCN扩增: p=3.5×10−6;第1亚型与第2亚型MYCN-放大:p=0.001;及第2亚类非-MYCN-扩增的VS 2亚型MYCN-放大:p=0.775。b, c在方格图中,中间标记表示框的中位数以及底部和顶部的边缘,为第25和75百分位数。晶须的长度是25百分位数到最小数据点的1.5倍或最大数据点的75百分位数的长度的1.5倍。晶须外的数据点是离群点。注:p≥0.05(Ns)p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), p < 0.001 (***), p < 0.0001 (****). d三种基因的体细胞突变被肿瘤亚型反复改变。为Rb1都表明了种系突变。MYCN放大、1Q增益和16Q损失也显示出来。e6607差异甲基化CPGS的热图(甲基化水平差异>0.2,调整后)p < 0.05, two-sided Wilcoxon test and BH correction) between subtype 1 and subtype 2. f根据CpG含量和邻域背景,将低甲基化CPGS(上面板)和超甲基化CPGS(下面板)的分布按CpG含量和邻域环境进行了比较,在亚型2中与亚型1相比较。g密度图显示不同甲基化CPGS在CpG岛(上面板)和CpG岛外(下面板)的甲基化水平的分布。

总基因组不稳定性评分(估计为基因组拷贝数改变的比例)显著高于(p=3.3×10−7)第2亚型比第1亚型肿瘤(图1所示)。2B),当肿瘤MYCN扩增被排除在分析之外。相比之下,基因组不稳定性评分在第2亚型肿瘤之间并无差异。MYCN1型肿瘤的扩增和亚型。

然后我们描述了视网膜母细胞瘤亚型的突变情况。我们对来自102个视网膜母细胞瘤系列(亚型1)的71例患者的基因组肿瘤和正常DNA进行了全外显子捕获,然后进行了配对的末端大规模平行测序(Wes)。n=25;第2亚类,n=41;未分类,n=5)。我们鉴定了186个基因中的242个体细胞突变(补充数据)2)。这些肿瘤含有两个突变的中间值。WES发现的体细胞突变数明显高于(p=1.2×10−7)第2亚型比第1亚型肿瘤(图1所示)。2C)。限制2亚型肿瘤MYCN-放大或MYCN-非扩增肿瘤产生同样的结果。

三个基因,Rb1, BCOR,和ARID1A,被发现是反复变异的。我们对这三个基因在缺乏WES数据的31份样本中的23份进行了靶向测序。分布Rb1, BCOR, ARID1A突变,MYCN放大、1q增益和16Q损失如图所示。二维空间。为Rb1已发现的生发点和体细胞点突变,以及缺失、复制中性LOH和启动子甲基化。Rb1在大多数肿瘤中,无论是哪种亚型,都有突变,两种肿瘤亚型之间的突变类型无明显差异。值得注意的是,我们发现了一个没有Rb1它属于第2亚型,并表现出较高的水平。MYCN放大(141份)。BCOR突变(n=9)仅见于第2亚型(p=0.02),以及这两种情况。ARID1A突变。大多数2亚型肿瘤MYCN扩增(46/48,96%)表现为增加1Q和(或)损失16Q。相反,没有一个MYCN-扩增肿瘤,除1例增加1倍或16 Q丢失外(p=0.005)(图1。二维空间).

2亚型肿瘤存在CpG岛内甲基化和CpG岛外的低甲基化。

我们比较了1亚型肿瘤的甲基化体(n=27)和2亚型肿瘤(n=36,包括4MYCN-扩增肿瘤)。表示6607个CPGS甲基化水平的热图,这两个亚型之间甲基化程度有显着性差异(补充数据)2)如图所示。2E。2亚型肿瘤在CpG岛内表现出更频繁的甲基化,在CpG岛外的低甲基化频率高于1亚型肿瘤(图1)。2F,g和补充图。2)。四MYCN-扩增的2型肿瘤在CpG岛外表现为低甲基化,在CpG岛内不存在甲基化现象(图1)。2G).

这两种亚型在锥体和神经节/神经元标记物的表达和干细胞表达上表现出差异。

我们比较了这两种亚型的转录组。近三分之一的基因在这两种亚型之间有差异表达(6207/20408,经调整后)。p-数值<0.05)(补充数据3).

锥形标记(如GUCA1C, GNAT2, ARR 3, GUCA1A, GUCA1B, GNGT 2, PDE6C, PDE6H, OPN1SW)和神经元/神经节标记物(如EBF 3, DCX, Robo1, Sox 11, GAP 43, PCDHB 10, STMN 2,NEFM,POU4F2, EBF 1)是差异表达基因之一。锥体标记在1亚型肿瘤中高表达,而神经元/神经节标记在2亚型肿瘤中高表达(图1)。3A)。在已知的与视网膜母细胞瘤有关的基因中1,31,发现有几个在这两个亚型之间有不同的表达(KIF 14, MDM 4, MIR17HG, MYCN, Skp 22亚型上调;RBL 2第2亚类下调(补充数据)3)。其中一些基因位于增益/扩增区(KIF 14MDM 41q32.1和MYCN在2p24.3),或丢失(RBL 2在16q12.2)染色体区,而其他区域则参与MYC/MYCN途径(MIR17HG, Skp 2)。对6207个基因进行了层次聚类,确定了三个主要的基因簇:第1亚型上调的两个(1201个基因簇1.1和1788个基因的基因簇1.2)和第2亚型(3112个基因;基因簇2)中所有上调基因的一个(图2)。3B)。我们使用基因本体论生物过程(GOBP)和MSigDB特征(标志)(图)的基因集进行了富集分析。3C和补充数据3)。1.1.1基因主要表达于1型肿瘤的一部分,与肿瘤微环境(免疫反应、炎症、干扰素反应、补体、胶质细胞)及杆状细胞标记有关。簇1.2在脂肪酸代谢、氧化磷酸化和光感受器/锥细胞相关基因中富集。与细胞周期、E2F靶基因、RNA加工、MYC通路和神经元形态发生相关的基因丰富。

图3:两种视网膜母细胞瘤亚型的转录差异。
figure3

a火山图的基因在亚型1中显著上调(n=26)(黄金)及第2亚类(n=31)(蓝色)。与锥体细胞和神经元/神经节细胞分化相关的基因(分别以金和蓝色表示),以及每种亚型中差异表达最高的基因。b对显着差异表达的基因进行层次聚类,确定了三个主要的基因聚类。c上面板:在超几何学测试中,GOBP集合中富集了1.1、1.2、2簇的基因集。结果表示为基于重叠基因(边)连接的丰富基因集(节点)网络。节点大小与相关基因集中的基因总数成正比。各GOBP术语的名称见补充数据3。底部面板:聚集在1.1,1.2,2中的标记集合中的前5种基因集。d上面板:马耳他等国确定的树干指数的方格图。32,在视网膜母细胞瘤的两种亚型中(1亚型肿瘤:n=26,2亚型肿瘤:n=31)。在方格图中,中间标记表示框的中位数以及底部和顶部的边缘,为第25和75百分位数。晶须的长度是25百分位数到最小数据点的1.5倍或最大数据点的第75百分位数的长度的1.5倍。晶须外的数据点是离群点。意义通过一个双边的Wilcoxon检验,p=1.9×10−7。下面板:最相关和反相关标记(HM)通路的干细胞指数和Meta评分的热图,以及最相关免疫细胞的MCP-评分。斯皮尔曼的Rho和p-数值如图所示。p < 0.0001 (****). e代表视网膜母细胞瘤两种亚型锥体和神经节相关基因表达模式的热图。2亚型和1亚型之间的表达也有统计学意义和log 2倍变化。调整后。p≥0.05(Ns),调整。p < 0.05 (*), adjusted.p < 0.01 (**), adjusted.p < 0.001 (***), adjusted.p < 0.0001 (****). Limma moderated two-sided t-试验和BH校正。精确性p-数值在补充数据中提供3.

缺乏炎症/免疫信号以及MYC和E2F基因在第2亚型中的富集是引起干细胞特征的原因之一。32,33。此外,CD 24,其中两个在2亚型肿瘤中高表达的基因之一(如图所示)。3A和补充数据3),已被证明是一种神经干细胞标记物,也是多种肿瘤类型的肿瘤干细胞标记物。34。干细胞指数,根据转录数据,允许相对评估肿瘤标本的干细胞程度。我们使用了四种不同的树干特征。32,33,35,36有转录数据的59例视网膜母细胞瘤标本。2亚型的茎度指数显著高于1亚型(图1)。三维空间、上面板和附图。3A)。此外,不同特征的树干指数具有高度的相关性(附图)。3B)。我们寻找与干细胞相关的标志基因集(补充数据)。3)。E2F靶点、MYC靶点V2、MYC靶点V1、G2/M检查点与干度呈正相关。三维空间、下面板和补充数据3)。这些标记与第2组(2亚型中过度表达的基因簇)中的标记相同。与干度呈负相关的特征包括干扰素-α反应、干扰素-γ反应和补体(图1)。三维空间、下面板和补充数据3),与群1.1(1亚型高表达并与肿瘤微环境相关的基因簇)相同。我们还评估了干细胞与各种免疫细胞的丰度之间的关系,用微环境细胞群体(Mcp)计数器评分来估算。37。干细胞指数与单核细胞系、B系和细胞毒淋巴细胞MCP评分呈负相关(图一)。三维空间、下面板和补充数据3)。总之,我们发现亚型2与高茎率有关。

1亚型锥体相关基因和2亚型神经元/神经节细胞相关基因表达上调(图1)。3A)引导我们详细分析与不同视网膜细胞类型(棒和锥光感受器、神经节、无长突、双极和水平细胞以及Müller胶质细胞)相关的基因的表达。从系统的文献检索和在不同时间点获得的单细胞rna-seq(scrna-seq)数据中筛选出视网膜细胞类型标记列表。38。来自Lu等人定义的带注释的单元格类型。38,我们确定了与每种视网膜细胞类型相关的候选标记列表(补充数据)。3)。为了选择最具体的标记,我们开发了一个工具来可视化不同视网膜细胞类型中的基因表达谱(见“方法”部分)。Https://retinoblastoma-retina-markers.curie.fr/)。在分析Lu等人的数据和文献中所发现的候选标记的表达谱的基础上,我们提出了不同视网膜细胞类型的标记(见补充数据)。3).

圆锥标记在1和2型视网膜母细胞瘤中均有表达,不同亚型间的表达水平取决于标记物(图1)。3E、上面板)。在分析的24个神经节细胞标记中,一个小子集(EBF 3, EBF 1,GAP 43, POU4F2, NEFM, 铝凸轮, NRN 1, CNTN 2)在2亚型肿瘤中持续高表达(补充图1)。4A还有无花果。3E,下面板)。

使用从Lu等人的数据中获得的与每个视网膜细胞类型相关的候选标记列表。38,我们提供了进一步的证据,以丰富与2亚型肿瘤中神经节细胞相关的标记物(补充数据)。3)。这些基因在2亚型肿瘤中过表达,既可视为神经节基因,也可视为神经元基因。的确,虽然特定于视网膜内的神经节细胞(补充图)。4B),它们在大脑中都有表达,在中枢神经系统中发挥着不同的功能39,40,41,42,43,44,45,46,47.

其他视网膜细胞类型的标记物(棒、无分泌、双极、水平和Müller胶质细胞)在视网膜母细胞瘤中不表达,或仅在一部分肿瘤中表达(补充图1)。4A)。这些标记物的表达可能是由于某些视网膜母细胞瘤中存在正常的视网膜细胞所致。事实上,非肿瘤性棒和Müller胶质细胞已被证明存在于一些视网膜母细胞瘤中。13.

锥体分化状态和神经元/神经节细胞标记物的表达区分了这两种亚型

在视网膜母细胞瘤的两种亚型中所观察到的锥体标记的表达与视网膜母细胞瘤细胞是一个承诺的锥细胞是一致的。两种亚型间的锥体标记表达存在差异,这就提出了这些差异是否能与不同时期的球果分化相对应的问题。视网膜器官是由人诱导的多能干细胞(Ips)细胞衍生而来的三维结构,它能再现视网膜的时空分化,为人视网膜的体外发育提供了强有力的模型。48,49。我们检测了人ips细胞分化为视网膜后不同时间点(d35、d49、d56、d84、d112、d175)和1亚型视网膜内早期和晚期视锥标记的表达水平。n=23)和第2亚类(n=44)视网膜母细胞瘤,使用NanoString技术(图1)。4A和补充数据4)。如所料,在ips细胞衍生的视网膜细胞器中,早期光感受器/锥体标记物的表达(OTX2, CRX, THRB,RXRG)出现的时间早于晚锥标记(PDE6H, GNAT2, ARR 3, GUCA1C). GUCA1C是最后表达的标记,与以前的体外和体内观察一致。50,51。早期锥体标记在两种肿瘤亚型中均有表达,表达水平非常相似。相反,晚期锥体标记在2亚型肿瘤中平均表达水平较低,是最下调的标记物。GUCA1C是最新的锥形标记。这些结果表明,与第2亚型肿瘤相比,1亚型肿瘤更符合锥体发育的分化期。

图4:视锥和神经元/神经节细胞标记物在视网膜母细胞瘤和视网膜细胞器中的表达。
figure4

a热图显示视锥和神经节标记物在不同分化时间点视网膜细胞器中的表达,以及用NanoString技术检测1、2亚型肿瘤中的表达。两种亚型的基因表达差异用双面法评估。t-BH校正测试。精确性p-数值在补充数据中提供4. b2种视网膜母细胞瘤亚型与视网膜细胞器在不同分化时间点间8个锥状标记表达的Pearson‘s相关性。C1:亚型1的质心;C2:亚型2的质心。c基于锥标记表达的系统发育树,不同分化时间点的视网膜细胞器和视网膜母细胞瘤样本。d正常视网膜和视网膜母细胞瘤组织中CRX、ARR 3、EBF 3和Ki-67的免疫组化染色。对于RB 617,黑色箭头表示ARR 3和EBF 3的相互排斥模式。对34例标本进行免疫组织化学实验(亚型1,n=9;第2亚类,n=25)。每个子类型显示两个有代表性的图像。e免疫组织化学分析中使用的分化标记物的快速评分(QS):CRX、ARR 3和EBF 3。在方格图中,中间标记表示框的中位数以及底部和顶部的边缘,为第25和75百分位数。晶须的长度是25百分位数到最小数据点的1.5倍或最大数据点的75百分位数的长度的1.5倍。晶须外的数据点是离群点。采用双面Wilcoxon试验。

作为几个神经元/神经节细胞谱系相关基因被证明是在肿瘤亚型之间的差异表达(如图所示)。3我们还比较了它们在视网膜器官和两种亚型肿瘤组织中的表达水平。4A和补充数据4)。神经节细胞标记物在视网膜分化早期(从d49)表达,其表达水平在d84后下降,与晚期视网膜细胞器神经节细胞的丢失相一致。52。与1亚型肿瘤相比,这些神经节标记物在2亚型中被上调(图1)。4A)。其中两个EBF 3GAP 43,在D49和D84之间的视网膜细胞器中表达水平相当的2型肿瘤。

为了更准确地确定与第1亚型和第2亚型肿瘤细胞对应的锥体发育阶段,我们在诱导视网膜分化后的每个时间点,用锥形标记表达法计算了各肿瘤亚型的质心与细胞器的中心体之间的相关系数(图1)。4B)。1亚型肿瘤最接近后锥分化(在D 173时观察到最高相关),2亚型肿瘤最接近早期锥分化(D84和d 112之间的相关性最高)。

为了说明各亚型视网膜母细胞瘤的视锥分化程度,我们利用光感受器/锥标记表达,在诱导分化后的不同时间点将视网膜细胞器样本与视网膜母细胞瘤样本相结合,构建了一个系统发育树(图)。4C)。在分化晚期(D 173),所有1型肿瘤均接近iPS细胞源性视网膜器官。2亚型肿瘤从D84向D 173视网膜器官扩散。

为了进一步探讨视网膜母细胞瘤视锥分化的异质性,我们采用免疫组织化学方法研究了早期光感受器标记(CRX)和视锥系特异的后继标记(ARR 3)在视网膜母细胞瘤中的分布。我们还检测了一个神经节细胞标记物(EBF 3)的表达。应用免疫组织化学方法对1亚型石蜡包埋标本进行免疫组织化学染色。n=9)及第2亚类(n=25)视网膜母细胞瘤(补充数据)4)。每种肿瘤亚型的两个例子如图所示。4D。在瘤周正常视网膜中,转录因子CRX在外核层(ONL)的所有细胞中均有表达,而ARR 3在ONL的一部分细胞中表达。正如以前报道的那样,EBF 3在神经节细胞中表达,但在内核层的一些无长突细胞中也有表达。51,53,54,55。所有肿瘤,不论其亚型,均表达感光标记物CRX,与视网膜母细胞瘤来源于锥状细胞一致。ARR 3+/EBF 3模式是唯一的模式观察到的亚型1肿瘤(图)。4D,e和补充数据4)。这些肿瘤的增殖标志Ki-67呈阳性。4D,以及补充数据4)。ARR 3和EBF 3在2亚型肿瘤中有两种类型的表达(图2)。4D)。大多数2型肿瘤(16/25,64%)同时表达ARR 3和EBF 3(ARR 3)。+/EBF 3+),如图所示的肿瘤RB659所示。4D。其他2型肿瘤(8/25,32%)显示ARR 3和EBF 3(ARR 3)相互排斥表达。/EBF 3+或ARR 3+/EBF 3),如图所示的肿瘤RB617所示。4D。1个肿瘤(1/25)表达EBF 3,而不表达ARR 3。ARR 3与EBF 3共表达的2亚型肿瘤(ARR 3)+/EBF 3+)对Ki-67一直呈阳性反应。在ARR 3和EBF 3相互排斥表达的2亚型肿瘤中,ARR 3/EBF 3+区域对Ki-67总是积极的,而ARR 3则是积极的。+/EBF 37例患者中有6例KI-67阳性(如图所示)。4D和补充数据4)。这些Ki-67阴性ARR 3的组织学检查+/EBF 3在这6例病例中,有3例出现跳蚤(光感受器分化灶)和有丝分裂。肿瘤内这些不同区域的存在可以反映一系列肿瘤细胞类型的分期,从干细胞到祖细胞再到分化到终末分化,后者中有许多是有丝分裂后的。另外,Ki-67负ARR 3。+/EBF 3区域可与视网膜瘤相对应,视网膜母细胞瘤是一种与视网膜母细胞瘤相邻的良性非增殖性病变。56,57,58.

2亚型肿瘤瘤内异质性的单细胞分析

为了进一步探讨2亚型肿瘤的瘤内异质性,我们在一个2亚型肿瘤(RBSC 11)上进行了基于液滴的单细胞RNA测序。免疫组化分析显示ARR 3和EBF 3相互排斥表达,可区分两种类型的区域(Crx)。+/ARR 3+/EBF 3和CRX+/ARR 3/EBF 3+)(附图。5A),在大约30%的2型亚型肿瘤中观察到。

在最初的质量控制后,我们保留了1198个细胞的转录(补充图)。5B)。为了识别肿瘤中不同的细胞群,我们进行了共享最近邻(SNN)聚类,并确定了七个聚类(图)。5A).

图5:2型视网膜母细胞瘤(RBSC 11)单细胞水平的瘤内异质性。
figure5

a1例视网膜母细胞瘤细胞2D-t-SNE图。每个点代表一个单元格。b顶级聚类标记的热图(根据折叠变化,每个聚类中最上调的基因前20位)。有代表性的聚类标记和丰富的基因集。聚类标记p-超几何学检验,经BH校正后计算。c2D t-SNE图中所选基因的表达(早期感光标记:CRX, OTX2;晚锥标记:ARR 3, GUCA1C;神经元/神经节标记物:EBF 3, GAP 43, DCX;扩散标志:MKI 67;促进凋亡标记物:BNIP 3;巨噬细胞标记物:CD 14T细胞标记物:CD3D). d从单细胞基因表达推断CNV的分布。每一行表示单个单元格的配置文件。6p染色体上的基因在非恶性细胞中过表达,单核/小胶质细胞与HLA复杂基因相对应,不应解释为第5组中的CNV。e上面板:总结二维t-SNE图的不同簇的解释的图表。下面板:一种基于基因组改变的视网膜母细胞瘤进展模型。

为了对不同的聚类进行表征,我们使用了(1)已知的细胞类型特异性标记,(2)聚类标记(与所有其他簇相比,簇内最上调的基因),(3)簇标记的途径分析,(4)与纯化细胞类型的大量mRNA表达谱的相关性(图1)。5B,c和补充图。5C,d,补充数据5)。簇0-4,占所有分析细胞的89.2%,表达早期光感受器/锥标记(例如,OTX2, CRX, THRB,和RXRG)。簇0和2表达神经元/神经节细胞标记(例如,GAP 43, Sox 11, UCHL 1, DCX, EBF 3),而第1组和第4组表示晚锥标记(例如,ARR 3GUCA1C)。第2组和第4组表达增殖标记,例如MKI 67。第3组有一个低氧基因表达程序,包括促凋亡基因的表达。BNIP 3。第5群和第6群,占全部分析细胞表达造血标记物的10.8%(129/1198),可能与基质细胞群体相对应。第5组表达单核/小胶质细胞标记(例如,CD 14AIF 1),而第6组则表达T淋巴细胞标记,包括T细胞活化的标记(例如,CD3D特拉克)。每个簇的标记表达的可视化显示在补充图中。5E以及这些标记物在正常发育视网膜中的表达。

为了分析该肿瘤的基因组异质性,我们从单细胞转录组数据(见“方法”部分)推断了每个细胞的拷贝数变异(CNVS)。5D)。分析表明,簇0-4对应于肿瘤细胞(存在基因组改变),而簇5和6对应于正常细胞(没有基因组改变)。基因组改变模式将恶性细胞细分为三个不同的细胞群:多个基因组改变的细胞(增益1q、2q、9p、13q,丢失8q)、2p和10q增益的细胞和仅增加10q的细胞。簇0和2的所有细胞(CRX+/EBF 3+/GAP 43+肿瘤细胞),和一些团簇3细胞,对应的第一个轮廓(多个改变)。第1组和第4组的细胞(CRX+/ARR 3+/GUCA1C+肿瘤细胞)与后两条曲线相对应(10q增益±2p增益)。最后,一些簇3细胞对应于第二个轮廓(2p和10q增益)。

通过表型分析和从单个细胞RNA-seq数据推断的拷贝数改变,我们得出结论:被分析的第2亚型肿瘤的恶性细胞由两个群体组成,一个表达早期光受体/锥标记和神经元/神经节细胞标记(簇0和2),另一个表达早期光受体/锥标记和晚期锥体标记(第1和第4组)。这两个细胞群以G1/S(簇0和1)、G2/M(簇2和4)和低氧(簇3)三种状态存在。图中显示了一个总结不同集群的解释的模式。5E(上面板)。这个CRX+/EBF 3+/GAP 43+肿瘤群(簇0和2),呈现出大量的基因组改变,似乎在基因组上是均一的。这个CRX+/ARR 3+/GUCA1C+肿瘤群(簇1和4)不稳定,由两个基因组不同的亚群体组成。从肿瘤不同细胞群中发现的基因组变化构建了一个肿瘤进展树,如图所示。5E(底部面板)。共表达CRX/EBF 3/GAP 43(早期光感受器/锥体标记物和神经元/神经节细胞标记物)对于肿瘤细胞来说是独一无二的,因为它在正常视网膜发育过程中不存在或非常罕见(补充图1)。5F).

仅对1例视网膜母细胞瘤进行了单细胞RNA-seq分析。为了进一步评估视网膜母细胞瘤的异质性,并利用轨迹推断方法(如估算rna速度的方法),研究视网膜发育与肿瘤发生的关系,有必要对这两种亚型的附加肿瘤进行单细胞分析。59,60.

2亚型肿瘤有较高的转移风险。

然后,我们研究了视网膜母细胞瘤的发展转移是否属于特定的分子亚型。在我们最初的102例视网膜母细胞瘤病例中,没有患者发生转移。因此,我们研究了112个原发于诊断的高风险病理特征(HRPFs)的肿瘤,其中19个肿瘤随后发生了转移。所有这些病人都在Garrahan医院(阿根廷布宜诺斯艾利斯)接受治疗。其临床病理特征,包括HRPFs,载于补充资料中。6并在表中作了总结2.

表2另有112例原发性肿瘤的临床和病理特征。

TFF 1属于一类参与胃肠道保护和修复的小分子分泌分子。61. TFF 1在正常发育的视网膜中不表达(补充图)。6A)。与1亚型肿瘤相比,它是第2亚型肿瘤中最高的上调基因(折叠变化=55,经调整后)。p-数值<10−12、图1.3A,补充数据3),在大多数2亚型肿瘤中有表达,但在1亚型肿瘤中很少或没有表达(补充图1)。6B,c)。这些结果是根据另外两个肿瘤序列的转录组来证实的。16,18(补充图。6B,c7).

我们用免疫组织化学方法检测了102例视网膜母细胞瘤(18例1亚型和37例2亚型肿瘤)中55例视网膜母细胞瘤中TFF 1蛋白的表达。TFF 1、CRX和ARR 3在典型的1型和2型肿瘤中的表达如图所示。6A。1亚型肿瘤显示很少或没有TFF 1表达(QS≤50;QS,快速评分),而大多数2亚型肿瘤表现出高表达水平(QS>50;图1)。6a,b,补充数据6)。我们分析了另外112例原发于HRPF的肿瘤中TFF 1的表达,其中19例为转移性肿瘤(Garrahan系列)。在随后发生转移的19例原发肿瘤中,有18例表达TFF 1。18例TFF 1阳性(qs>50),与未转移病例比较(P<0.05)。p=0.00033)(图1。6B和补充数据616例转移病例中有15例EBF 3阳性(QS>270)(补充数据)。6一种与亚型2(图2)特别相关的神经节标记物。3A, 4D,e和补充图。6)。在19例转移病例中,有7例来自原发肿瘤和转移灶。除1例外,所有病例中TFF 1的转移位点均为阳性(QS范围为90~300)。EBF 3的6个转移位点均为阳性(QS>255),其中1例TFF 1阴性。6C和补充数据6)。以上结果提示2亚型肿瘤比1亚型肿瘤具有更强的侵袭性。这些发现需要更多的证据来证实亚型2的分配,并通过对其他一系列转移病例的研究。

图6:2亚型肿瘤有较高的转移风险。
figure6

a正常视网膜和视网膜母细胞瘤中CRX、ARR 3和TFF 1的免疫染色。对55例(1亚型)标本进行免疫组织化学实验。n=18;第2亚类,n=37)来自102例视网膜母细胞瘤。有代表性的图像为:1亚型肿瘤(RB1)和2亚型肿瘤(RB635,RBsjd 8)。2亚型肿瘤表现为ARR 3和TFF 1的共染色(RB 635)或镜像(RBsjd 8)。b显示TFF 1快速评分(QS)的55个初始系列肿瘤(亚型1,n=18;第2亚类,n37),在112例HRPF系列肿瘤中。在方格图中,中间标记表示框的中位数以及底部和顶部的边缘,为第25和75百分位数。晶须的长度是25百分位数到最小数据点的1.5倍或最大数据点的75百分位数的长度的1.5倍。晶须外的数据点是离群点。用双面Wilcoxon检验评价1亚型与2亚型QS的差异,p=1.1×10−7转移性和非转移性,p=0.007。c低、高倍镜下转移性视网膜母细胞瘤(左)及其转移部位(右)原发肿瘤TFF 1免疫组化染色。应用免疫组织化学方法检测7对有效原发转移瘤对中6对TFF 1的表达.图中显示了四幅具有代表性的图像。

讨论

多组学方法的使用使我们对两种主要的视网膜母细胞瘤分子亚型进行了可靠的鉴定。这两种亚型的不同分子、病理和临床特征突出了这种分类的相关性。为了支持这一点,我们可以验证在两个独立的视网膜母细胞瘤系列中区分这两个亚型的转录特征。16,18(补充图。7)。这两个亚型的特点为以前的生物学和临床观察提供了解释,对视网膜母细胞瘤的研究和治疗有潜在的意义。

这两种亚型均表达视锥标记,与人视网膜母细胞瘤的锥体起源一致。11,12,13,14,15。对于视网膜母细胞瘤两种亚型的存在有几种可能的非排他性解释.这两种亚型可能来源于位于不同视网膜位置的视锥前驱体。有几项研究报道,随着诊断年龄的增长,视网膜母细胞瘤的中心到外周的进展。62。由于2亚型肿瘤的诊断明显晚于1亚型肿瘤(中位年龄为23.9vs11个月),因此他们可能比1亚型肿瘤更容易被周围定位。这两个亚型可能来自不同的锥前驱体。它们也可能是从不同成熟阶段的圆锥前驱物中提取出来的。对最后一种解释提出异议,事实证明Rb1−/−来源于ARR 3的视网膜母细胞瘤+成熟锥前驱体15.

我们发现1亚型肿瘤出现了分化锥(Arr 3)的晚期标记物(Arr 3)。+、GUCA1C+2亚型肿瘤是早期分化的标志,在肿瘤之间和内部具有重要的异质性。这与老年视网膜母细胞瘤患者的低分化和异质性相一致。58。因为这两种子类型都很可能是从arr 3派生的。+Rb1失活的2亚型肿瘤成熟锥前驱、分化程度低、异质性差,可能是由于去分化过程所致。

我们发现亚型2与低免疫和干扰素反应、E2F和MYC/MYCN活化有关,并且有较高的转移倾向,这与最近报道的干细胞特征相对应。32,33,35,36。Rb 1和tp 53基因的改变和功能丧失也被证明与各种癌症的干细胞有关。32,36。Rb1在两种视网膜母细胞瘤亚型肿瘤中均有失活现象,但两种亚型间存在差异。第2亚型的高茎率可能与Rb家族另一个基因的表达降低有关,RBL 2,位于16Q,在大多数2亚型肿瘤中丢失。2亚型肿瘤的高干细胞性也可能与肿瘤的高表达有关。MDM 4,TP 53抑制剂位于1Q,在74%的2亚型肿瘤中获得/扩增。提示mdm 4和mdm 2均能阻断p5 3介导的视网膜母细胞瘤的肿瘤监测。63,64。我们的结果表明MDM 4可能参与了2型肿瘤的亚型。除了锥体标记物的表达外,第2亚型肿瘤过度表达标记物归因于视网膜背景下的神经节细胞标记物。然而,所有这些标记也可以看作是神经元标记物(它们对应于中枢神经系统中表达和参与的基因)。此外,在2亚型肿瘤中过度表达的基因中,我们发现了在视网膜神经节细胞发育过程中表达的神经元基因,也发现了其他类型的视网膜细胞(如Sox 11, DCX, STMN 2)。这些观察表明,亚型2可以被认为是锥体-神经元亚型.

神经元基因的表达现在不仅在大脑和神经内分泌肿瘤中被发现,而且在一些上皮性癌(乳腺癌、卵巢癌、结肠癌)中也被发现。65。近年来,肿瘤细胞利用神经元和神经发育途径与包括内皮细胞和神经元在内的正常细胞进行增殖、迁移和相互作用,这一点已变得越来越明显。65,66。因此,我们在2亚型肿瘤中发现的神经元基因的过度表达可能与这些肿瘤的侵袭性有关。

MYCN/MYC靶基因在2亚型肿瘤中的过度表达及11例中的10例MYCN-扩增肿瘤至2亚型肿瘤(其余MYCN扩增肿瘤未分类)提示MYCN/MYC在该亚型中起重要作用。MYC和MYCN与其他儿童肿瘤有牵连,包括神经母细胞瘤和髓母细胞瘤,它们通常存在于高危肿瘤的亚组中。在神经母细胞瘤中,MYCN在大约20%的病例中发现扩增,并与高危疾病和不良预后有关。67。最近的研究表明,MYC也可能是另一个高风险神经母细胞瘤的驱动因素。68,69。第三组髓母细胞瘤与MYC扩增(10-17%)和最糟糕的整体存活率70,71。MYC/MYCN在2亚型肿瘤中的活化可能被用于这些肿瘤的特异性治疗。事实上,MYC/MYCN可通过JQ 1和OTX015等药物靶向转录而间接抑制。72,或直接以MYC/MAX相互作用为目标73.

在102例视网膜母细胞瘤中,肿瘤MYCN扩增占2型肿瘤的17%。MYCN-转录组分析显示,扩增后的肿瘤与其他2亚型肿瘤并无明显差异,但有其特殊的特征。临床上,肿瘤MYCN扩增诊断早于其他2型亚型肿瘤(诊断中位年龄:15.9vs26.9个月)。分子上,肿瘤MYCN扩增可与2亚型肿瘤区分开来。MYCN放大的基础上,不常见的1Q增益和16Q损失。此外,肿瘤MYCN扩增在CpG岛外是低甲基化的,在其他2亚型肿瘤中也是如此,但与其他2亚型肿瘤相比,它们没有在CpG岛内表现出甲基化。

在高收入和中等收入国家,由于早期诊断和新的保守治疗的发展,视网膜母细胞瘤的摘除率正在下降。分析肿瘤dna甲基化和房水样本及无细胞dna血液中拷贝数变化的技术最近被开发出来。74,75。到目前为止,视网膜母细胞瘤的分子特征已经在从去核中获得的肿瘤标本上进行了研究。通过液体活检对视网膜母细胞瘤的分析应能提供更全面的疾病图像。此外,房水和血液样本有可能通过亚型分层来优化视网膜母细胞瘤的治疗。

总之,两种分子亚型--锥体型和锥体/神经元型的鉴定是视网膜母细胞瘤研究的重要进展。它应该重新定义这一儿童癌症的进一步研究,包括发展模型,改善诊断和预后,以及确定更具体的治疗方法。与2亚型肿瘤相关的高干细胞和神经元特征将视网膜母细胞瘤与新出现的癌症研究领域联系起来,并为治疗开辟了新的机会。


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