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正常眼压性青光眼患者房水微RNA的RNA序列分析

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发表时间:2021-09-26 15:01作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

我们的目的是鉴定和比较正常眼压性青光眼(NTG)患者和正常人房水标本中的microRNAs(MiRNAs)。白内障手术前收集房水(80~120升)。最后分析了6例稳定的NTG患者和7例年龄匹配的对照组。对13例房水标本进行RNA测序,并对miRNA靶点及相关途径进行生物信息学分析。在房水中检测到228个离散的miRNAs,并在所有标本中一致表达。与对照组相比,NTG患者中发现8种显著上调的miRNAs(折叠变化>2,p < 0.05). They were hsa-let-7a-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-375, and hsa-miR-143-3p. These miRNAs were predicted to be associated with the biological processes of apoptosis, autophagy, neurogenesis, and aging in the gene ontology categories. The related Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathways were extracellular matrix-receptor interaction, mucin-type O-glycan biosynthesis, biotin metabolism, and signaling pathways regulating the pluripotency of stem cells. The differentially expressed miRNA in the NTG samples compared to the controls suggest the possible roles of miRNA in the pathogenesis of NTG. The underlying miRNA-associated pathways further imply novel targets for the pathogenesis of NTG.

导言

青光眼是主要的公共健康问题之一,也是世界上导致失明的第二大视觉损害原因。1。据估计,到2020年,将有7 960万青光眼患者,目前亚洲人占青光眼患者的一半(47%)。1。青光眼的特征是视盘进行性损伤,随后视网膜神经纤维层(Rnfl)丢失和相应的视野缺陷。2。摘要青光眼是一种神经退行性疾病,其病理特征是视网膜神经节细胞死亡。2,3...青光眼被认为是一种多因素视神经病变,目前仍是一种病因不明的疾病。眼压升高是青光眼的主要危险因素。然而,眼压以外的危险因素,如血管损伤和缺氧,也与青光眼的发病有关。3,4,5。原发性血管调节异常(Pvd)已被认为是一个重要的危险因素,特别是对于正常眼压性青光眼(Ntg)。6,7,8。在亚洲人中,NTG的患病率高于其他种族,这是一个明显的特点。9.

种族间青光眼类型的差异表明遗传因素在青光眼的发生发展中起着重要作用。此外,青光眼家族史被广泛认为是青光眼的危险因素之一。因此,遗传背景被认为与青光眼的发生及其发病机制有关。10,11,12。有几个基因被证明与原发性青光眼有关,例如,视黄素(optineurin,optineurin)。OPTN)、肌球蛋白(多年期),视神经萎缩1,神经营养因子413,14,15,16,17。然而,这些基因只占原发性开角型青光眼(Poag)患者的5%。18对本病有不完全和低外显率。

MicroRNAs是一种非编码小的(~18~22 nt)寡核苷酸,通过对靶mRNAs中特定序列的感知来调节基因表达的转录后调控。19。这些microRNAs的作用主要是减少靶基因的表达。20。与mRNAs相反,miRNAs在生物流体中表现出显著的稳定性。21。房水已被认为具有潜在的分子生物标志物,具有重要的病理生理学相关性。22。以前的研究已经确定了正常人和POAG患者房水中的microRNAs。23,24,25,26。然而,以往的研究还没有评估NTG患者房水中微RNA的表达。NTG的发病机制尚不清楚。

初步研究汇集了房水样本,以获得足够的体积进行分析。然而,在本研究中,我们使用RNA测序来分析单个房水标本中微RNA的表达。据我们所知,目前还没有报道NTG患者房水中微RNA的分布和表达情况。在本研究中,我们用RNA测序方法对NTG患者房水中微RNA的表达进行了研究,并与正常对照组进行了比较。差异表达的microRNAs可能为NTG的发病机制提供线索,NTG的眼压在正常范围内,在亚洲人中尤为普遍。

结果

受试者的基线特征和人口学特征

经过文库准备和质量检查,6名NTG患者和7名年龄匹配的对照者被纳入最终的RNA测序。包括NTG和对照组受试者的基线特征见表。1。NTG组(n=6)和对照组(n=7)的平均年龄分别为65.5±10.6岁和63.9±9.9岁。NTG组和对照组的平均眼压分别为14.8±1.8 mmHg和15.43±2.3 mmHg。每个NTG患者只使用一种局部药物,包括固定的联合滴眼液。除单纯性白内障外,受试者没有其他眼部共病。

表1.受试者的基线特征和人口统计。

正常眼压性青光眼房水miRNA表达差异的RNA序列分析

根据miRwalk 2.0的数据分析miRNA靶点。用RNA测序法检测了2588个miRNAs。在NTG患者房水(AH)中共鉴定出228种成熟的miRNAs(图)。1a)。上调的miRNAs显示在小区的上部区域(红色),下调的miRNAs显示在地块的下部(绿色)。其中,8种miRNAs与对照组(折叠变化>2或<-2)相比明显上调,p < 0.05), in addition to the analysis of the fold-changes were selected based on the normalized array data (log2) > 4 (Fig. 1b)。这8个显著上调的miRNAs是hsa-let-7a-5p,hsa-let-7c-5p,hsa-let-7f-5p,hsa-miR-192-5p,hsa-miR-10a-5p,hsa-miR-10b-5p,hsa-mr-miR-375和hsa-miR-143-3p(表)。2)。根据同样的显着性标准,NTG患者与对照组相比,未发现明显下调的miRNAs。

图1
figure1figure1

NTG组与对照组房水miRNA表达比较的散点图和火山图。(A)上调的miRNAs显示在散点图的上部区域(红色),下调的miRNAs显示在散点图的下游区域(绿色)。在NTG患者房水中共检测到228种成熟miRNAs。与正常对照组相比,NTG组8种miRNAs、hsa-t-7a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-375和hsa-miR-143-3p明显上调。折叠变化>2(红色虚线),折叠变化<−2(绿色虚线),归一化数据(Log2)>4;p-值<0.05,与对照组比较。(B)在火山图中,高度调控的miRNAs显示在图的右侧(红色),并且只选择通过p < 0.05 (horizontal black dotted line) and fold change > 2 (red vertical dotted line). Down-regulated miRNAs are shown to the left of the plot (green) and were only selected which passed the thresholds of p < 0.05 (horizontal black dotted line) and fold change < 2 (green vertical dotted line). After selecting only those with Normalized data (log2) > 4, the volcano plot shows eight significantly upregulated miRNAs with fold change > 2, and p-数值<0.05。其中,8种miRNAs与对照组相比明显上调(折叠变化>2,p < 0.05), in addition to the analysis of the fold-changes were selected which only based on the normalized array data (log2) > 4. There was no significantly down-regulated miRNAs identified in NTG patients compared to control subjects according to the same significance criteria. Plots were presented by ExDEGA v1.2.1.0 software. NTG正常的眼压性青光眼。

表2正常眼压性青光眼患者房水中miRNA的差异表达。

微RNA验证与差异表达miRNAs的生物学解释

RNA序列分析显示NTG患者与对照组AH之间有8种差异表达的miRNAs。热图显示NTG患者AH中的8种miRNA(红色、高相对表达、Z-评分)明显高于对照组(蓝色、低相对表达、Z-评分)(图一)。2a)。为验证ntg患者aH的rna测序结果,采用定量PCR(QPCR)(n=7)对let-7c-5p进行了分析,得到了相似的结果(表)。2)。NTG患者AH中let-7c-5p的表达明显高于对照组(44.32±3.63)倍,差异有显着性(P<0.05)。p < 0.001) (Fig. 2b)。

图2
figure2

定量PCR检测NTG患者AH中miRNA与对照组比较。(A)热图显示了miRNAs表达的RNA测序结果。红色代表高相对表达,蓝色代表低相对表达(Z-得分)。数据由ExDEGA v1.2.1.0软件提供。(B通过定量PCR验证分析hsa-let-7c-5p在NTG患者AH中的表达。NTG患者AH中let-7c-5p的表达明显高于对照组(44.32±3.63)倍,差异有显着性(P<0.05)。p < 0.001). Data are represented as the mean ± S.E.M. and were analyzed using Unpaired Student’s t-test (n = 7). ***p < 0.001 versus Control. 房水,NTG正常的眼压性青光眼,S.E.M。平均值的标准误差。

为了探讨表达的miRNAs的影响,我们使用了基因本体论(GO)分类。在众多的GO通路中随机选取了15个主要的GO类别。图中显示了每个GO相关基因在总显着性基因和表达差异基因数量中所占的百分比。3。这一比例指的是NTG患者AH中微RNA修饰的比例,与对照相比,在每一GO类别的研究中所鉴定的总miRNAs所占的比例。凋亡(3.27%)和自噬(4.63%)是与细胞死亡相关的主要类型.与神经发生有关的类别(5.88%)和炎症反应(4.47%)也占显著比例。与细胞功能相关的类别,包括增殖、迁移和分化,可能发生在任何病理状态下,占7.83%。所有与凋亡、自噬和神经发生等生物学过程相关的基因本体论类别中的microRNAs是hsa-let-7c-5p和hsa-miR-375。作为显着性,下调的miRNAs没有按照与上调相同的显着性标准来识别(见图)。1(B)在图中没有显示作为下调的GO类别的绿色图.3.

图3
figure3

基因本体论范畴相关微RNA中表达显著变化的微RNA的百分比和数量。基因本体论(GO)是一类表达变化较大的微RNA。上调的miRNAs显示为红色图,而下调的miRNAs显示为绿色图.凋亡(3.27%)和自噬(4.63%)是细胞死亡相关的主要类型。与神经发生有关的类别(5.88%)和炎症反应(4.47%)也占主要比例。这一比例指的是NTG患者AH中微RNA修饰的比例,与对照相比,在每一GO类别的研究中所鉴定的总miRNAs所占的比例。由于下调的miRNAs没有按照同样的上调显着性标准被识别,因此在此图中没有显示出与下调的GO类别相同的绿色图。用ExDEGA v1.2.1.0软件绘制了图形。

主要的基因和基因组(Kegg)途径的京都百科全书(Kegg)路径,其中包括预测的每个miRNA基因靶,在表中列出。3。基因注释丰富的分析是用数据库进行注释、可视化和集成发现(David)。与细胞外基质-受体相互作用相关的途径(17.03,富集评分,−log 10)p-值)、粘蛋白型O-甘氨酸生物合成(5.40)、生物素代谢(3.73)和调节干细胞多能性的信号通路(2.39)与NTG患者AH中miRNAs增加显著相关。其中,ECM受体相互作用在NTG中表现出最显著的KEGG通路。4)。蛋白质消化吸收(1.62)、PI3K-Akt信号传导(1.50)等途径也与上调的miRNAs有关。

表3正常眼压青光眼患者房水中微RNA对KEGG通路的潜在影响。
图4
figure4

KEGG通路浓缩分数表示为−log 10(p-价值)。富集分值越高,路径越显着。与ECM受体相互作用(hsa04512;17.03)、粘蛋白型O-糖基生物合成(hsa00512;5.40)、生物素代谢(hsa00780;3.73)和调节干细胞多能性的信号通路(hsa04550;2.39)有关的KEGG通路与NTG患者房水中miRNAs的增加密切相关。注意,与ECM受体相互作用相关的通路与NTG患者中上调的miRNAs有最显著的关联。数据用DianaTools进行分析。KEGG京都百科全书基因和基因组,ECM细胞外基质。

由于hsa-let-7c-5p和hsa-miR-375都参与了与凋亡、自噬和神经发生等生物学过程相关的所有基因本体论范畴,我们重点研究了这两种微RNA,并考察了每个微RNA的KEGG通路。Hsa-let-7c-5p的增加与ECM受体相互作用的相关性最大(18.1),如NTG患者AH的KEGG通路分析结果所示。此外,阿米巴虫病(3.19)和粘蛋白型O-糖基生物合成(2.97)等途径也与hsa-let-7c-5p有关。4)。Hsa-miR-375的增加与生物素代谢(8.34)、甲状腺激素信号通路(2.39)和谷氨酸能突触(1.20)有关。5).

表4正常眼压青光眼患者房水中上调的let-7c-5p可能影响KEGG通路。
表5正常眼压青光眼患者房水中上调的miR-375可能影响KEGG通路。

讨论

据我们所知,本研究首次报道了NTG患者在单个房水标本中表达的microRNAs与一个亚洲人的对照组相比有显着性差异。本研究没有汇集房水样本,尽管每个样本的体积很少。用RNA测序法检测房水标本中的微RNA。RNA测序在所有房水样品中共鉴定了228个微RNA。与对照组相比,我们在NTG患者中检测到8个显著上调的microRNAs。它们是hsa-let-7a-5p,hsa-let-7c-5p,hsa-let-7f-5p,hsa-miR-192-5p,hsa-miR-10a-5p,hsa-miR-10b-5p,hsa-miR-10b-5p,hsa-miR-375和hsa-miR-143-3p。其中,hsa-let-7c-5p和hsa-miR-375是所有与凋亡、自噬和神经发生等生物学过程相关的基因本体论范畴中的微RNA。在本研究中,虽然我们也分析了RNA测序过程中的下调,但在本研究中没有按照同样的上调的显着性标准来确定微RNA的明显下调。

MiRNAs在基因表达的转录后调控中起着重要的作用,并与细胞的分化、生长和死亡等功能有关。27。人类基因组大约有2500个miRNAs,可以调节所有编码蛋白质的基因的>60%的表达水平。19,28.

HSA-let7c-5pmiRNA位于LINC 00478基因上,位于人类染色体21q21.1上。它在结直肠癌、前列腺和急性髓系白血病等恶性肿瘤中的表达降低,并作为抑癌基因发挥作用。29,30.

据报道,let-7在几种恶性肿瘤中被下调,并通过直接靶向癌基因myc、ras、hmga 2、ck 6和cc25a来调控细胞凋亡。31。据报道,microrna let-7c通过抑制抗凋亡蛋白bcl-xl对内皮细胞具有凋亡作用。32。作为lt-7家族成员之一的let-7a-5p被报道与bcl-xl相互干扰,通过激活PI3k信号通路,使a 549肺癌细胞死亡和自噬,而不依赖于凋亡。33。RGCs的损伤导致青光眼及随后的视盘拔罐和视野丧失的特征性临床表现。我们的研究结果提示hsa-let-7c-5p可能在NTG的凋亡和自噬的发病机制中起作用,这在以前还未见报道。

HSA-miR-375是NTG患者中表达最显著的微RNA,与对照组比较,13例房水标本中HSA-miR-375表达差异最大(折叠变化(Log 2)=8.19,P<0.01)。p=0.000)。Hsa-mir-375最初被检测到在胰岛中大量表达,在调节葡萄糖刺激的胰岛素胞吐中具有实际作用。34,35。在一项关于小鼠海马的研究中,hsa-miR-375被证明会影响树突的形成。36.

在先前的一项研究中,hsa-mir-375被证明可以调节乙醇诱导的神经细胞死亡。37。研究还发现,miR-375上调与慢性酒精中毒患者脑萎缩和认知缺陷有关。37。在另一项工作中,氯胺酮诱导hesc衍生神经元hsa-miR-375上调,并呈浓度依赖性。38。这些研究的综合结果37,38提示miR-375上调与病理皮层神经元环境有关。已有几项研究表明hsa-miR-375的神经元功能,包括对树突形成的影响。36与神经元凋亡的调控39。先前的研究表明hsa-miR-375抑制对氯胺酮诱导的神经毒性的hESC源性神经元具有表观遗传保护作用,可能是通过脑源性神经营养因子的正向和反向调节。BDNF)基因38.

在先前的一项研究中,11%的老年猴出现了视盘的NTG样变性,这与青光眼患者相似。在视网膜、视神经头和脑脊液中未见眼压升高,但表现为氧化应激水平升高,BDNF和TrkB表达降低,脑脊液(CSF)压力降低。40。青光眼大鼠视神经和视网膜中BDNF和TrkB的表达降低,与青光眼患者的观察结果一致。41。神经营养因子是治疗青光眼的候选药物之一,多项研究表明BDNF滴眼液对高眼压小鼠青光眼模型(DBA/2J小鼠)的视觉功能有保护作用。42,43。考虑hsa-miR-375对BDNF基因,我们的研究结果也可能支持BDNF基因是青光眼基因治疗的潜在靶点,尤其是NTG。

RGC树突被认为是在损伤后作出反应并表现出代偿性变化,例如,扩展树突知觉场和产生新的分支。44,45,46。Park等人最近的一项研究。报道BDNF应用于慢性眼压升高大鼠模型后,双极细胞和RGCs的突触囊泡蛋白增强。47。此外,BDNF还改善了青光眼视网膜中连接双极细胞和RGCs的突触数目。作者的结论是,这些关于BDNF促进有用突触改变的能力的发现可能有助于开发神经增强治疗青光眼突触功能紊乱的方法。我们的结果也提示树突的形成和相关的BDNF参与可能成为青光眼,特别是NTG的新的治疗靶点,有关hsa-miR-375的神经元功能。此外,RGC树突的形成和与神经发生相关的基因本体论范畴BDNF的作用可能与NTG的发病机制有关。

炎症反应是NTG患者房水中可能受microRNAs影响的基因本体论生物学过程类别之一。3)。用双荧光素酶报告基因法证实hsa-miR-375与Toll样受体4(TLR 4)的结合。48。TLR 4通过MyD 88激活核因子-κB(NF-κB),促进下游炎性细胞因子的分泌。49。对青光眼患者和青光眼实验模型的研究表明,炎症反应部分是由Toll样受体(TLRs)介导的。50。解剖研究报告了青光眼患者视网膜小胶质细胞和星形胶质细胞中TLR 2、TLR 3和TLR 4水平的升高。51。另一项先前的研究表明,抑制星形胶质细胞NF-kB可降低视网膜缺血后的炎症状态,并增强RGCs的存活。52。Hsa-miR-375与TLR的相关性及炎症反应可能部分解释了我们在NTG患者中的研究结果。

衰老也是NTG患者房水中可能受microRNAs影响的基因本体论生物学过程类别之一。3)。由于青光眼是一种年龄依赖性疾病,青光眼的患病率随着年龄的增长而增加,这在世界上许多基于人口的研究中都有报道,在亚洲也有报道。9,我们的研究结果似乎是合理的。

与对照组相比,NTG患者房水中受微RNA影响的生物过程的其他基因本体论范畴为细胞增殖、迁移、分化和循环、DNA修复、分泌和血管生成。这些类别可能在任何病理条件下共同作用,不可能仅发生在青光眼。在这方面,本研究报告没有详细讨论这类类别。

摘要视神经纤维变性最初发生在青光眼的筛板部位。53。筛板由ECM和不活跃的星形胶质细胞组成,是一种纤维弹性结构,为视神经头的轴突提供生物和机械的支持。54,55。青光眼可引起ECM的重塑和星形胶质细胞的活化。因此,反应性星形胶质细胞表达新的ECM蛋白,这些蛋白被认为改变了它的结构或对RGCs具有神经毒性。56。一项利用生物信息学分析来检测差异表达的青光眼基因的研究发现,最显著的富集途径之一是ecm受体的相互作用。57。这一发现与目前的研究结果相一致。研究结果表明,在NTG患者中,最重要的相关KEGG通路是ECM受体相互作用(p-值(−log 10)=17.027)。与ECM受体相互作用相比,其他kegg通路显示p-值(−log 10)小于5.402,至少三个值为1.378(表)3还有无花果。4).

当我们分析不同上调的let-7c-5p和miR-375的KEGG通路时,在let-7c-5p中,最相关的KEGG通路是ECM受体相互作用。p-值(−log 10)=18.109)(表4),这与所有差异表达的microRNAs的结果一致。我们还证实了lt-7c-5p与对照组相比有显著的相对表达(图一)。2b)。这些验证结果表明,我们的RNA测序结果的可靠性和有效性。

NTG的发病机制仍有争议,这是一个特殊的问题,因为NTG的发展,甚至在正常范围内眼压。使用OCT成像设备的研究报告了NTG患者在筛板厚度和曲率方面的差异。58,59,60。在NTG患者中,筛板厚度较POAG患者薄。58。此外,vf感染的单侧ntg患者的眶板厚度也比正常人或正常人的眼薄。59。在单侧NTG患者中,伴有青光眼损害的眼睛比健康者更多地表现出严重弯曲的卷曲板。60。这些发现提示,在NTG眼中,嵴板经历了明显的重塑。鉴于脑板是青光眼性损伤的主要部位,而NTG导致由ECM组织的面层的重塑,我们的微RNA分析结果表明ECM的改变在NTG的发病中起着重要的作用。

在我们的研究中,NTG患者房水中其他可能受microRNAs影响的KEGG通路包括粘蛋白型O-糖基生物合成、生物素代谢和调节干细胞多能性的信号通路。在目前的研究中,几种基因本体论生物学过程类别和相关的KEGG通路与NTG患者房水中差异表达的microRNAs有关。与NTG相关的单个生物过程或KEGG通路的确认需要进一步的临床和实验研究。然而,我们的研究是独一无二的,在NTG患者的房水单个样本中,与一个亚洲人的对照组相比,发现了显著差异表达的microRNAs。

由于我们的研究是第一次报告差异表达的微RNA在NTG患者,因此,还没有以前的研究比较的结果。但是我们可以比较以前POAG患者的眼压升高的结果。近年来,关于微RNA在POAG中的作用机制的研究综述了微RNA参与了眼压的调控,并与机械应激、缺氧和炎症等视神经损伤因素有关。61。在poag中的microRNAs是miR-29b。62,63、miR-143/14564,65,miR-18266,67,miR-200家族68,69,miR-20470,71,miR-15572,73和miR-146 a74,75。目前在正常眼压范围的NTG患者中还没有发现在POAG发病过程中所研究的这些微RNA,提示NTG发病过程中差异表达的microRNAs与高眼压的POAG不同。这也在一定程度上表明了本研究的信度和效度。

目前的探索性研究由于样本量相对较小,房水样本体积较小而存在局限性,但对于亚洲人普遍存在的NTG微RNA的进一步研究具有重要意义。由于房水样本的体积不足以使所有miRNAs进行qPCR验证,只有hsa-let-7c-5p进行了qPCR,显示出与RNA测序结果明显一致的相对表达模式。考虑到hsa-let-7c-5p在NTG患者中的变化(折叠变化(Log 2)=2.92)比hsa-miR-375(折叠变化(Log 2)=8.19)小得多。2),qPCR结果一致。2(B)hsa-let-7c-5p可能表明我们的RNA测序结果的可靠性。降压局部用药对NTG患者房水中微RNA表达的影响尚未确定。使用不同的降压局部药物对我们的结果的影响还不清楚。有大量样本的未来研究将受益于控制降压局部药物的使用。

总之,我们发现NTG患者的单个房水中的microRNAs表达与对照组相比有显着性差异,这在以前还没有被研究过。本研究结果提示了微RNA在NTG发病机制中的作用。应进行更多案例的进一步研究,以得出更明确的结论。此外,单个房水中的微RNA可能作为NTG的生物学标志和新靶点具有进一步的潜力。


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