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葡萄糖抑制斑马鱼幼虫的止血和加速饲料诱导的高脂血症

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发表时间:2021-09-26 14:54作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

高血糖部分通过减少免疫细胞的聚集和对血小板信号的干扰而损害微血管,导致哺乳动物伤口愈合不良和脂质沉积加速。以斑马鱼幼虫为模型,研究了外源葡萄糖对尾创中性粒细胞和巨噬细胞的影响,创伤诱导的止血作用,以及用浸泡或注射外源葡萄糖对鸡蛋黄饲料诱导的高脂血症的影响。两种补糖方法均不影响尾横断后中性粒细胞和巨噬细胞的生成。葡萄糖注射可减少血栓细胞的滞留和纤维蛋白塞的形成,而尾切后只有葡萄糖浸泡可减少血栓细胞的滞留。我们观察了高脂鸡蛋黄饲料对注射葡萄糖的幼虫脂质积累的促进作用。与哺乳动物相比,我们的研究确定了高糖对斑马鱼幼虫炎症、止血和高脂血症的保守和差异效应。

导言

对微血管的高血糖损害被认为是哺乳动物糖尿病相关病理的基础,包括对白细胞生物学、止血和血管壁脂质巨噬细胞积聚的干扰。1,2,3,4。以往哺乳动物的研究表明,高血糖会损伤微血管,导致内皮细胞粘附分子表达减少,以促进免疫细胞的再生。2,4。结果,较少的中性粒细胞和巨噬细胞被吸收到糖尿病的伤口。1,2,5。在最终到达的巨噬细胞和中性粒细胞中,由于糖尿病伤口微环境的炎症性质,导致向炎症表型分化的倾向。6,7.

患有高血糖症的哺乳动物表现出混乱的凝血和血小板信号,导致止血中断。3,8。止血效率的降低导致糖尿病足溃疡中不稳定和无效的血块。3,9。糖尿病足溃疡的治疗包括血小板和纤维蛋白治疗,这表明在溃疡性溃疡过程中纤维蛋白凝块的生成不足起着重要作用。10,11.

高血糖所致的微血管损伤也会增加血管脂质的积聚,并伴有高脂血症。12。高脂血症和高血糖是2型糖尿病发展的复合危险因素,与脂肪和糖构成的“西方饮食”以及有限的运动有关。13,14。高血糖损害微血管有多种机制:通过形成晚期糖基化产物。3,氧化应激的诱导15,干扰一氧化氮的产生16,并诱导巨噬细胞形成载脂泡沫细胞。17。内皮结构完整性的降解增加了脂质沉积的速率,为脂质浸润提供了一个物理生态位。12。这最终会导致动脉粥样硬化的发展,这在糖尿病患者中很常见。17.

这些表型以前在鱼类中还没有被研究过。本研究采用斑马鱼模型研究外源性葡萄糖对炎症、血栓形成和高脂血症的影响。斑马鱼是建立模型,以研究这些过程中的每一个孤立。18,19,20,21,22。与本研究相关,文献中报道了几种斑马鱼高血糖模型,包括基于浸泡或注射外源葡萄糖的技术简单模型、毒素或高热量饮食挑战的环境模型、胰腺消融术以及高血糖的遗传模型(Salehpour和Rezaei等人最近的一项Meta分析中介绍了这些模型)。.22)。此外,斑马鱼与哺乳动物有相似的凝血、代谢和免疫系统,这些系统被用来洞察这些系统在脊椎动物中的共同功能。19,20,23。在这里,我们结合这些模型来研究外源性葡萄糖补充在斑马鱼幼虫体内干扰血栓形成和脂质积累的作用,但不包括免疫细胞对伤口的吸收作用。

结果

外源葡萄糖暴露增加斑马鱼幼虫葡萄糖

为了建立提高5种DPF斑马鱼幼虫葡萄糖浓度的注射和浸泡技术,我们采用Sigma Amplex红葡萄糖氧化酶试剂盒对5种DPF斑马鱼幼虫进行了葡萄糖氧化酶测定。与过去的文献一致,我们观察到注射葡萄糖和浸泡的幼虫体内的葡萄糖浓度与对照组相比有所增加(图1)。1A,B)24,25.

图1
figure1

注射和浸泡方法提高斑马鱼幼虫的葡萄糖水平。(A5只以15 nmol葡萄糖为卵的DPF幼虫中葡萄糖的相对浓度。统计检验t试验中,每个数据点代表一组10~30只幼虫.(B5 DPF幼虫中葡萄糖的相对浓度在2 DPF的5%葡萄糖或甘露醇溶液中。用方差分析进行统计检验,每个数据点代表一组10~30只幼虫.(C用5只DPF注射葡萄糖幼虫的侧位图像计算体总面积。统计检验t测试一下。数据代表了两个生物复制。(D5只DPF幼虫在2 DPF 5%葡萄糖溶液或甘露醇溶液中浸泡后的体总面积。方差分析统计检验。数据代表了两个生物复制。(E)用5只DPF注射葡萄糖幼虫的侧位图像计算眼面积。统计检验t测试一下。数据代表了两个生物复制。(F5只DPF幼虫浸泡在5%葡萄糖或甘露醇溶液中的眼面积。方差分析统计检验。数据代表了两个生物复制。(G5 DPF葡萄糖注射幼虫侧位图像中巨噬细胞总数的定量。统计检验t测试一下。数据代表了两个生物复制。(H5只DPF幼虫在2 DPF 5%葡萄糖或甘露醇溶液中浸泡的侧位图像中巨噬细胞总数的定量。方差分析统计检验。数据代表了两个生物复制。(I葡萄糖注射5只DPF幼虫侧位图像中中性粒细胞总数的定量。统计检验t测试一下。数据代表了两个生物复制。(J5只DPF幼虫在2 DPF 5%葡萄糖或甘露醇溶液中浸泡的侧位图像中中性粒细胞总数的定量。方差分析统计检验。数据代表了两个生物复制。

葡萄糖浸泡会引起散发性微生物过度生长,我们观察到浸泡在葡萄糖或甘露醇中的幼虫生长速度减慢,但以全身面积衡量,却不能在注射葡萄糖的幼虫中生长(见图)。1C,D)或眼区(图1)。1E、f)。

接下来我们分析了葡萄糖补充对关键天然免疫细胞发育的影响。我们估计了转基因细胞中巨噬细胞的数量。TG(mfap 4:绿松石)Xt 27在幼虫中,巨噬细胞以绿松石荧光蛋白标记,并在注射葡萄糖或浸泡在葡萄糖中的幼虫中发现类似数量的巨噬细胞(图1)。1G,H)。我们估计中性粒细胞的数量TG(LyzC:DsRed)NZ 50幼虫用DsRed荧光蛋白标记中性粒细胞,发现注射葡萄糖的幼虫中性粒细胞数量减少,而葡萄糖浸泡的幼虫中性粒细胞数量相似(图1)。1I,J)。

葡萄糖不影响斑马鱼幼虫中性粒细胞和巨噬细胞的吸收。

改变伤口天然免疫细胞吸收是哺乳动物高血糖的一个保守特征。4,5,26,27,28。为了确定这种现象在斑马鱼幼虫中是否保守,我们采用了造成再生白细胞再生的尾部横断伤模型。29(无花果)2a)。我们首先用转基因技术进行了检测。TG(mfap 4:绿松石)Xt 27幼虫要量化巨噬细胞对尾部伤口的吸收(图一)。2b)。令人惊讶的是,在伤后6h,我们观察到注射葡萄糖的幼虫和对照幼虫巨噬细胞的吸收没有差别(图)。2c)。在葡萄糖浸泡模型中,我们也观察到巨噬细胞的吸收没有差别(见图)。2d)。

图2
figure2

外源性葡萄糖不影响中性粒细胞和巨噬细胞向尾部伤口的吸收。(A)测量尾部伤口免疫细胞吸收情况的实验原理图。(B在注射葡萄糖的幼虫中,巨噬细胞(红色)征集到尾部伤口的典型图像。(C葡萄糖注射模型尾横断后巨噬细胞募集的定量。(D)葡萄糖浸泡模型断尾后巨噬细胞募集的定量。(E中性粒细胞(红色)在注射葡萄糖的幼虫尾部伤口的典型征象。(F葡萄糖注射模型尾横断后中性粒细胞募集的定量。每个配对数据点代表每个条件下n>10个胚胎的生物复制的平均数。(G)葡萄糖浸泡模型断尾后中性粒细胞募集的定量。标尺表示100μm。t测试一下。数据代表了3个生物复制体。

然后我们用TG(LyzC:DsRed)NZ 50幼虫对尾部伤口中性粒细胞的吸收进行量化(图一)。2e)。我们观察到实验之间有很大的差异,其中2/4的实验发现在6 hpw时,对照组和葡萄糖注射的幼虫之间中性粒细胞的吸收明显减少,2/4的实验发现中性粒细胞的吸收显著增加(图1)。2f)。始终如一地,我们没有观察到中性粒细胞在葡萄糖浸泡模型中的吸收有任何不同(如图所示)。2g)。

以上结果表明,外源葡萄糖对斑马鱼幼虫中性粒细胞和巨噬细胞的合成没有影响。

葡萄糖对斑马鱼幼虫止血的影响

哺乳动物高血糖引起凝血和血小板活化,导致止血效果不佳。3,8。为了观察外源葡萄糖对斑马鱼幼虫止血的影响,我们首先使用TG(itga2b:gfp)LA2观察断流血管中血小板塞的形成30,31。尾翼横断(图1)。3(A)葡萄糖注射TG(itga2b:gfp)LA2幼虫表现出血小板聚集减少(见图)。3B,C)。这一效应在葡萄糖浸泡胚胎中被复制,与对照胚胎相比(见图)。3d)。

图3
figure3

外源性葡萄糖能减少尾部血小板和纤维蛋白的积累。(A)观察尾横断后止血的实验原理图。(B葡萄糖注射幼虫尾切后2.5h有典型的血栓细胞覆盖(红色)。(C葡萄糖注射模型尾横断后血小板塞子大小的定量。(D)葡萄糖浸泡模型尾横断后血小板塞子大小的定量。(E注射葡萄糖的幼虫尾横断后2.5h纤维蛋白原沉积(红色)的典型图像。(F葡萄糖注射模型尾横断后纤维蛋白凝块大小的定量。(G)葡萄糖浸泡模型断尾后纤维蛋白凝块大小的定量。标尺表示100μm。t测试一下。数据代表了3个生物复制体。

为了确定血栓形成是否反映了血栓形成的减少,我们在TG(工厂10a:fgb-gfp)米4001幼虫(图1.3(E)表达荧光标记的纤维蛋白原,使凝块可视化。32。葡萄糖注射TG(工厂10a:fgb-gfp)米4001与注射PBS的幼虫相比,幼虫尾横断后纤维蛋白积累减少。3f)。我们没有观察到葡萄糖浸泡对荧光标记纤维蛋白原沉积的影响。3g)。

同时,这些结果表明外源性葡萄糖能抑制斑马鱼幼虫止血的血小板成分。

高脂饲料对斑马鱼幼体注射葡萄糖加速高脂血症的影响

高血糖和高脂血症在哺乳动物中是密切相关的。33。为了确定这种相互作用是否在斑马鱼幼虫中是保守的,我们给注射葡萄糖的幼虫一种由乳化鸡蛋黄组成的高脂肪饲料,从5到7 DPF(图1)。4a)。注射葡萄糖和PBS的幼虫在5 DPF开始投喂鸡蛋黄之前有相似的油红O血管染色(图5)。4B,C)。油红O染色的定量显示,注射葡萄糖的幼虫在喂养后一天和两天增加了血管脂含量(见图)。4D,E).

图4
figure4

高脂肪饮食后,注射葡萄糖的幼虫脂肪积累增加。(A)高脂喂养刺激法测定注射葡萄糖幼虫体内脂质积累的原理图。(B6只DPF油红O染幼虫的亮场图像,显示注射葡萄糖的幼虫血管较暗。方框表示嵌体的位置,箭头表示嵌段间血管的染色,星号表示被排除在分析范围之外的肠腔。(C5 DPF葡萄糖注射幼虫脂质积累的定量。(D6 DPF葡萄糖注射的幼虫在5 DPF的高脂饲料中脂肪积累的定量。(E5 DPF高脂饲料对7只DPF注射葡萄糖的仔鱼脂肪积累的定量研究。统计检验t测试一下。数据代表了两个生物复制。

这些结果概括了哺乳动物高血糖与高脂血症的相互作用。15证明斑马鱼幼虫是研究这种保守相互作用的稳健模型。

讨论

本研究探讨外源性葡萄糖对斑马鱼胚胎模型炎症、血栓形成和脂质积累的影响。我们发现外源性葡萄糖降低了伤口周围的止血能力。此外,我们还发现,当幼虫受到高脂肪食物的攻击时,葡萄糖的注射会加速脂肪的积累。

与对照幼虫相比,葡萄糖和甘露醇浸泡幼虫的体积减小是解释葡萄糖浸泡模型生成的数据集时的一个主要注意事项。因此,我们倾向于用注射法进行鸡蛋黄试验,并解释葡萄糖对斑马鱼幼虫免疫和止血的影响。尽管培养基每天都在变化,但我们在5%葡萄糖溶液中饲养斑马鱼幼虫时遇到了进一步的困难,这可能是由于微生物过度生长,可能是由于吸氧或破坏幼体粘膜表面而延缓了幼虫的发育。虽然葡萄糖注射模型在5 dpf时没有达到葡萄糖的高一倍变化,但我们没有观察到发育延迟,造血功能与注射pbs的对照幼虫大致相当。

哺乳动物的高血糖会导致血管功能障碍,从而限制大量免疫细胞进入伤口。16。因此,令人惊讶的是,在这项研究中,外源性葡萄糖似乎对尾部伤口中白细胞的吸收没有影响。外源葡萄糖补充斑马鱼幼虫可能不会影响白细胞沿血管的爬行,因为创伤反应的白细胞主要通过斑马鱼幼虫的间质组织移动。5,34。总之,我们的发现提示外源性葡萄糖供应给斑马鱼幼虫可能不是研究高血糖对白细胞生物学影响的合适平台。

高血糖与高脂血症的关系曾在多种哺乳动物中报道过。15,25,35,以及Wang等人最近的一项研究.结果表明,高胆固醇饮食与葡萄糖浸泡对斑马鱼摄食10天后血管脂积累的影响相似。25。我们的研究将鸡蛋黄作为一种高脂肪饮食挑战,结果表明,喂食一天后,脂肪的积累速度会显著加快。这种基于鸡蛋黄饲养的模型,因此为研究脂肪积累提供了一个更快速的模型.

总之,我们报告了添加葡萄糖的斑马鱼幼虫作为一个可操作的平台,以研究葡萄糖与止血、葡萄糖和饮食引起的高脂血症之间的保守相互作用。


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