您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!2008-2021
Wuhan Xinqidi Biotech Co.Ltd
本企业通过iso9001质量体系认证

合成水凝胶纳米粒用于脓毒症治疗

 二维码
发表时间:2021-09-22 10:12作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

脓毒症是一种威胁生命的疾病,它是由于炎症介质在血液中的极端释放而引起感染(如细菌感染,新冠肺炎),导致多器官功能障碍。目前,还没有对脓毒症的直接治疗。在此,我们报告了一种非生物水凝胶纳米粒子(HNP)作为治疗晚期脓毒症的潜在药物。HNP捕获并中和组织蛋白的所有变体,组织蛋白是脓毒症期间释放的主要炎症介质。高度优化的HNP具有较高的容量和长期的循环能力,可选择性地隔离和中和组蛋白。静脉注射HNP可通过抑制血小板聚集和向肺内迁移,保护小鼠免受致命剂量组蛋白的影响。在小鼠脓毒症模型小鼠体内给药可使其接近完全存活。这些结果为合成的、非生物的聚合物水凝胶隔离剂作为脓毒症治疗的新的干预策略提供了可能,并增加了我们对组蛋白对这种情况的重要性的理解。

导言

脓毒症是机体对感染(如细菌感染和新冠肺炎)的致命反应,通过释放多种炎症介质进入血液,导致多器官功能障碍。1。脓毒症病人表现出各种症状,例如发烧、全身低血压、尿量减少、凝血功能受损、血管通透性增加及血管平滑肌张力丧失。2,3。据报道,脓毒症的死亡率高于中风和心肌梗塞。4。此外,据报道,脓毒症与严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(sars-cov-2)引起的2019年(新冠肺炎)冠状病毒病密切相关。5。脓毒症的病理改变与多种因素有关。脓毒症期间,全身免疫反应的激活是由持续分泌alarmins(如高迁移率群盒1(Hmgb 1)、多种炎症介质(细胞因子)和来自受损宿主组织的阳离子毒性蛋白(组蛋白))驱动的。6进入血液。释放的有毒药物的复杂性会导致对宿主的致命影响,并对有效治疗措施的发展提出挑战。7,8,9.

目前的脓毒症治疗需要对症治疗(例如广谱抗生素、静脉输液和外科手术),但对脓毒症没有直接治疗。3,10。现在,中和特定的细胞因子,如HMGB 111、IL-312,以及IL-613提供治疗干预的潜在途径。一种更广泛的直接脓毒症治疗方法是使用巨噬细胞样纳米粒子(Nps),由可生物降解的聚合物np核心包被从人巨噬细胞中提取的细胞膜来捕获内毒素,如脂多糖(Lps)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(α)和干扰素-γ。14。虽然这些方法提供了希望,但每种方法都有其局限性,例如,毒素隔离剂是否有足够的容量仍有待确定。15如果在大规模生产方面的挑战,免疫原性和重现性可以得到控制。多种因素共同作用于脓毒症的病理,明确最重要的靶点,这对制定有效的治疗干预措施提出了战略挑战。组蛋白在脓毒症的致死性中起着重要的作用,但作为脓毒症的介导者,其重要性却没有得到足够的重视。针对他们的隔离和清除可能提供一个直接治疗脓毒症的额外机会。8。正常情况下,组蛋白被包裹在细胞核中,但由于细菌感染和大量炎性细胞因子的产生,组织蛋白被释放到细胞外空间。16。一旦释放出组蛋白,非特异性结合在细胞膜上,引发内皮细胞损伤、器官衰竭和死亡。8。此外,组蛋白与血小板结合并诱导凝血,通过减少血液中的血小板数量来延长出血时间。有五大类组蛋白(即h1,h2A,h2b,h3和h4),组蛋白h3和h4的中和,这两种富含精氨酸的组蛋白亚型已被证明可以降低脓毒症小鼠模型的死亡率。8,17。然而,其他组蛋白亚型,包括富含lysin的h1、h2A和h2b,具有相似的理化性质。18也会引起身体发炎8,19,20。因此,所有组蛋白亚型的广泛和非特异性中和为脓毒症治疗提供了一个新的机会。

在这篇文章中,我们报告了合成水凝胶NPs(HNPs)的发展,它可以中和所有组蛋白亚型作为脓毒症的潜在治疗剂(图一)。1)。这项工作是由先前的研究推动的,这些研究确定了合成的HNPs的物理化学性质可以被修改,以调节特定生物大分子靶点的亲和力和选择性。例子包括小分子的亲和试剂。21、肽22,23,24、酶25、多糖26、类脂大分子27和蛋白质28,29包括血管生成信号蛋白VEGF16530,31。与抗体相比,HNPs具有更高的靶向生物大分子能力,因为它们不仅在表面上而且在HNPs内部也被隔离。23。尽管有这些特点,基于hnp的治疗目前面临的一个挑战是它们在血液中的循环时间较短。23,31。一项改善这些的尝试包括将组蛋白捕获合成线性共聚物与脂质np(一种高度生物相容性的药物释放剂)结合,改善静脉注射后的血液循环时间。32。然而,这些脂质NPs具有较低的捕获能力,并倾向于聚集后的组蛋白收集。

图1:本研究的工作流程。
figure1

首先,我们开发了PEG修饰的HNPs,以优化其组蛋白亲和力、容量、低聚集度和血液循环时间,从而实现高效的脓毒症治疗。接下来,我们对PEGHNPs进行体外评价。最后,我们评价了PEGHNPs在活体小鼠体内的作用。

为了克服这些局限性,我们设计并优化了一种组蛋白亲和力高、聚集倾向低、血液循环时间长的HNP,实现了一种高效的脓毒症隔离剂。具体来说,我们证明了一个优化的HNP捕获和中和组蛋白的时间很长。此外,与抗体相比,HNPs具有极高的结合能力,在细胞表面粘附前后均能中和组蛋白。此外,HNP-组蛋白复合物具有极低的聚集倾向.最重要的是,HNPs通过捕获和中和血液中的组蛋白,显著影响了脓毒症模型小鼠的存活。非生物HNPs作为脓毒症直接治疗策略的一部分具有重要的前景。

结果

合成HNPs与组蛋白结合的评价

虽然有五大类组蛋白(即H1、H2A、H2B、H3和H4),但在生理pH条件下,所有亚型都是带正电荷的蛋白质。为了鉴定高组蛋白亲和力的候选基因,一个较小的(2%)交联文库。N采用改进的沉淀聚合法制备了异丙基丙烯酰胺基水凝胶聚合物NPs(HNPs)。33。HNPs结合了功能单体的组合和排列,其中包括N-TERT-丁基丙烯酰胺(TBAm,疏水单体),丙烯酸(AAC,负电单体)和/或N-(3-氨基丙基)-2-甲基丙烯酰胺盐酸盐(APM,正电单体)2A)。由于我们以前报道过,TBAm和AAC包含在NIPAm基HNP捕获正电荷的目标肽,甚至在血流中,我们选择了这些功能单体在本研究中。表中概述了单体进料比、粒径、zeta电位、多分散性指数(PDI)和产率。1。透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)结果表明,合成的HNPs是单分散的。2B)。用组蛋白修饰的石英晶体微天平(QCM)传感器对蛋白质(组蛋白)结合的小分子HNP文库进行了评价。2C)。筛选结果表明,HNP 4(AAC;5%,TBAm;40%)和HNP 5(AAC;40%,TBAm;40%)与组蛋白结合量较大。缺乏疏水组分(HNP 1)、含正电单体(HNP 2)或缺乏带电荷单体(HNP 3)的HNPs与HNP 3结合较少。总之,疏水基团和负电荷基团的结合对于诱导高组蛋白结合量是非常重要的。用纯化组蛋白H1、H2A、H2B、H3或H4固定化的QCM传感器细胞,测定各组蛋白亚型HNP 4和HNP 5的结合量。二维空间,补充图。1)。特别是组蛋白H3和H4具有很强的毒性。8,17,HNP 4和HNP 5对这些亚型的结合量都很大。组蛋白H3和H4在其序列中含有大量的Arg,并且具有较高的疏水含量(附图)。2)。Arg可以通过静电和氢键相互作用与羧酸相互作用。34加强了HNP-组蛋白结合需要荷电基团和疏水基团组合的HNP。据报道,组蛋白h4是最关键的败血症介质。8选择组蛋白H4结合量最大的HNP 4进行后续实验。表观离解平衡常数(Kd每个纯化组蛋白的HNP 4在250~880 NM之间(补充图)。32)。值得注意的是,HNP 4对每个纯化组蛋白的结合能力(mg蛋白/mg hnp)介于2到10之间。显著的是,hpp 4对组蛋白h3和h4具有极高的结合能力(见表)。2)。该值与抗体相比是有利的,因为一种抗体(M.W:150 kDa)只能捕获两个靶组蛋白(M.W:~10 kDa),其结合能力仅为(mg蛋白/mg抗体)~0.14。

图2:组蛋白亲和力HNPs的筛选。
figure2

a功能单体自由基共聚合合成HNPs的原理图。bHNPs的TEM图像。实验重复了三次。cHNPs对组蛋白的亲和力。用组蛋白对QCM传感器细胞进行功能化。BSA阻断后,加入各种HNPs,测定其结合量。dHNP 4对纯化组蛋白亚型的亲和力。用纯化的组蛋白亚型对QCM传感器细胞进行功能化。BSA阻断后,加入HNP 4,测定其结合量。数据表示独立重复测量的手段。

表1 HNPs的单体组成、大小、Zeta电位和PDI.
表2绑定亲和力(Kd)和HNP 4对纯化组蛋白亚型的能力。

PEG掺入对HNP体内循环时间及组蛋白亲和力和容量的影响

组蛋白通过静电作用与细胞表面相互作用,在一定条件下可在体外加入10 min内引起细胞死亡。35。因此,尽可能快地截取和清除血液中的组蛋白对于有效的脓毒症治疗是非常重要的。以前对聚(N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)的治疗性HNPs发现,静脉注射后很快就能从血流中清除出来。23,31。许多这些应用都是为了立即清除毒素,循环时间不是一个因素。23,36。改善HNP血液循环时间的最佳途径是改变HNP的化学成分。生物和合成NPs的聚乙二醇(PEG)修饰可以通过减少与血浆蛋白的相互作用和光化作用来改善体内血液循环时间。3。然而,由于目标的亲和力和选择性是基于HNP的化学成分,这种修饰有失去目标亲和力和选择性的风险。我们假设,虽然在HNPs中掺入大量过量的PEG可能会降低血浆和组蛋白的亲和力,但可能会微调PEG的长度,并在不严重降低亲和力和容量的情况下优化循环时间。在此情况下,以0.1,0.3,1,或3 mol%的比例加入聚甲基丙烯酸PEG(M.W:500,1500或4000 g/mol)的初始单体溶液中,合成了聚乙二醇(PEG)的HNPs(PEGHNPs,图1)。3A,补充图。4)。TEM图像显示单分散合成PEGHNPs。3B)。(表)概述了PEGHNPs的粒径和zeta电位。3)。通过溶液核磁共振证实了PEG在合成NPs中的掺入,并建立了PEG-甲基丙烯酸酯的进料比与最终掺入率之间的线性关系(附图)。56,补充表1)。随着PEG分子量的增加和HNPs中摩尔百分比的增加,HNP溶液的尺寸减小,透明度增加(附图)。7).

图3:在不降低组蛋白亲和力的情况下,将最佳PEG加入到HNPs中,以增加HNPs的循环时间。

a功能单体自由基共聚合合成PEGHNPs的原理图。bPEGHNPs的TEM图像实验重复了两次,每个实验拍摄了五张照片。c组蛋白-PEGHNP相互作用的QCM分析。用组蛋白对QCM细胞表面进行功能化,并在QCM细胞中加入PEGHNPs溶液。数据表示独立重复测量的手段。dPEGHNPs组蛋白捕获率组蛋白(600μg/ml)和PEGHNPs(3000μg/ml)孵育30 min后超离心。然后测定游离组蛋白。数据表示平均值±S.D。n=3。e静脉注射PEGHNPs后3h血浆中PEGHNPs的分布14标记的PEGHNPs。数据表示平均值±S.D。n=5.蓝色条形;PEG的M.W:500,黄色条;M.W,PEG;1500,和红色条形;M.W,PEG;4000。

表3 PEGHNPs的大小、Zeta电位和PDI。

据报道,在较低的临界溶液温度以上,聚乙二醇链主要位于p(Nipam)粒子表面。37。我们所有的研究都是在HNPs的LCST之上进行的。为了证明PEG链暴露在HNP表面,PEGHNPs被添加到组蛋白固定化的QCM细胞中(如图所示)。3C,补充图。8A)。与非聚乙二醇化HNPs比较,PEGHNPs与组蛋白固定化QCM细胞的结合量。减少平均而言,随着PEG分子量的增加和掺入量的增加。PEGylatedHNPs与组蛋白固定的QCM细胞结合量的降低支持了PEG链在表面积累的观点。然而,这项研究没有解决PEGylated HNPs的组蛋白容量问题,因为组蛋白必须穿透PEG链并与HNP核心结合。如果组蛋白仍与HNP核心结合,则PEGHNPs与非PEGylated HNP(裸HNP)的结合亲和力和容量可能不会显著降低。为了探索这一点,离解平衡常数(Kd通过在HNP固定化QCM细胞中添加组蛋白来测定组蛋白的PEGHNPs(补充图)。8B, 9,补充表2)。有趣的是,Kd用于组蛋白的PEGHNPs减少PEG掺入后。KdPEGHNP 12比裸HNPs小3倍以上。它的起源无疑是复杂的,但众所周知,pg结构与带正电的基片有内在的亲和力。38,这可能是增加与组蛋白亲和力的一个因素。总之,明智地引入PEG组增加了组蛋白亲和力。为确定HNPs与组蛋白的结合能力,将HNPs(3mg/ml)和组蛋白(600 mg/ml)分别孵育和超离心(图1)。三维空间)。与裸HNP相比,PEGHNP 11组蛋白结合能力略有下降,12(~18%),但组蛋白结合能力仍很高(mg蛋白/mg HNP=2~8)。与抗体(Mg蛋白/mg抗体=0.14)比较。

随后,我们研究了HNP-PEG化对血液循环时间和生物分布的影响。这些参数在静脉注射后3小时和24小时被测量。14C标记PEGHNPs进入BALB/c雄性小鼠(图1)。3E、补充图。1011)。裸HNPs在血液中停留时间短(约0.5%),腹腔注射3h后主要聚集在肝脏(~50%)和肾脏(~10%)。注射。PEGHNP 1-7、9、10的生物分布与裸HNPs无显着性差异,但PEGHNP 8、11、12在血液中的分布时间较长(分别为7.6%、5.3%和30.4%)。3F,补充图。10)。在静脉输液后24小时。注射~11%PEGHNP 12和~3%PEGHNP 8,11仍保留在血流中,但仅剩下0.07%的裸HNPs(附图)。11)。其余的PEGHNP 8、11在血液中的含量是裸HNP的30倍以上,PEGHNP 12是裸HNPs的150倍以上。结果表明,PEG掺入能显著延长HNP的循环时间,而不显著影响HNP与靶组蛋白的结合亲和力和固存能力。这一观察反映了治疗蛋白PEG化的类似发现。39。在此基础上,选择了循环时间较长的PEGHNP 8、11和12进行体内实验。

HNPs在细胞粘附后对组蛋白的中和作用

一旦组蛋白被引入血液中,它们就会与内皮细胞相互作用。9。组蛋白与细胞膜磷脂结合,具有致命毒性,如内皮功能障碍。组蛋白在PEGHNPs的存在下,组蛋白将在血流和细胞表面之间分离。为确定HNPs是否能中和细胞表面捕获后的组蛋白毒性,将预先孵育的HNPs(20g/mL)和组蛋白(45g/mL)添加到2H-11小鼠内皮细胞中。用WST-8法检测细胞存活情况。组蛋白毒性受裸露HNPs的剂量依赖性抑制(不含PEG,附图).12)。值得注意的是,所有PEGHNPs也能抑制毒性(附图)。13表明两种HNPs(PEGHNPs和裸HNPs)在此条件下均能有效中和组蛋白。随后,我们评估HNPs在与细胞结合后是否中和组蛋白。2H-11细胞与组蛋白共孵育1 min,用PBS洗涤细胞3次,去除组蛋白后,加入HNPs。4A)。组蛋白毒性被HNPs剂量依赖性地抑制,表明HNPs即使在与细胞结合后也能中和组蛋白。重要的是,单独的裸HNPs和PEGHNPs在HNP浓度为300μg/mL时并没有显示出体外细胞毒性(补充图)。14A)。另一方面,组蛋白在浓度低至30微克/毫升时具有细胞毒性(补充图)。14B)。HNPs和组蛋白都在细胞中被吸收,但在显著不同的速率下。荧光标记研究表明,HNPs本身几乎没有细胞摄取。为了证实hnp-组蛋白复合物的细胞摄取情况,在2H-11细胞中加入了预混合的Cy5-组蛋白(Cy5-组蛋白)和fITC标记的hnp(fITC-hnp),并孵育了24小时,荧光法测定了细胞对组蛋白的摄取。减少与裸HNPs或PEGHNPs进行预络合(图1)。4B)。另一方面,虽然细胞对裸HNPs和PEGHNPs(不含组蛋白)的摄取低于1%(裸HNPs;0.6%,PEGHNPs;0.2%),但组蛋白络合作用下,裸露HNP吸收量增加了15倍(~9%)。4C)。在组蛋白络合作用下,细胞对PEGHNPs的摄取仅占0.3%。这些结果表明,裸HNP表面结合组蛋白增强了细胞对裸HNPs的摄取,而PEGHNPs固存的组蛋白抑制了其与细胞表面的相互作用和细胞摄取。

图4:HNPs与细胞表面结合后对组蛋白的中和作用。
figure4

aPEGHNPs对细胞表面结合组蛋白的中和作用。2H-11细胞经组蛋白处理60s,PBS洗涤后加入PEGHNPs去除游离组蛋白。加入HNP后24h,用WST-8法测定细胞活力.数据表示平均值±S.D。n=4。b组蛋白的细胞摄取。2H-11细胞与Cy5-组蛋白和PEGHNPs共同孵育24h,裂解后测定Cy5-组蛋白的含量。显著差异;*p < 0.0001 vs. Histones alone, p=0.0012比赤裸的HNP+HIS,p=0.062诉PEGHNP 8+HIS,和p=0.0001 vs.和PEGHNP 11+HIS。数据表示平均值±S.D。n=3.采用单因素方差分析(ANOVA)和TUKEY后专案试验(4.5.3版)对各组间的差异进行评估。c细胞对HNPs的摄取。2H-11细胞与FITC-HNPs和/或组蛋白共同孵育24h,裂解后测定FITC-HNPs含量。显著差异;*p < 0.0001 vs. Naked HNP(+), p=0.0001 vs.PEGHNP 8(+),和p < 0.00012 vs. PEGHNP11 (+). Data represent the means ± s.d. n=4.用双尾学生的方法对数据进行分析。t测试。dPEGHNP洗涤去除细胞表面结合的组蛋白。2H-11细胞用Cy5标记的组蛋白作用10s,用PEGHNPs清洗1次或3次。然后裂解细胞,测定Cy5-组蛋白的荧光强度。差异显著;p=0.046组蛋白对裸HNP,p=0.046组蛋白对PEGHNP 8,p=0.046组蛋白对PEGHNP 11,以及p=0.026组蛋白对PEGHNP 12。数据表示平均值±S.D。n=3.用双尾学生的方法对数据进行分析。t测试。e, fCy5-组蛋白和FITC-PEGHNPs的定位。2H-11细胞用Cy5-组蛋白处理10s,然后用FITC-PEGHNPs洗涤细胞。30分钟(e)及24小时(f洗涤后,用激光扫描共聚焦显微镜观察Cy5-组蛋白和FITC-HNPs的定位。红色:组蛋白;绿色:HNPs;BAR:50μm。实验重复两次,每个实验拍摄三张照片。

HNPs中和组蛋白的效果评价

我们进一步研究了HNPs如何中和细胞表面结合的组蛋白。2H-11细胞用Cy5-组蛋白(100μg/ml)孵育10s,用HNPs(400μg/ml)洗涤两次(见图)。4D)。有趣的是,与单纯的PBS清洗相比,裸HNPs和PEGHNP 8、11、12洗涤后细胞结合的Cy5-组蛋白含量均降低,表明这两种HNPs均从细胞表面去除了55%的Cy5-组蛋白。由于PEGHNPs循环时间较长,结果表明,循环PEGHNPs在血液中循环时,通过结合和去除细胞表面结合的组蛋白,可以显着地提高其效率。为了解HNP洗涤后剩余细胞结合Cy5-组蛋白的去向,用FITC-HNPs(裸HNP和PEGHNP 8,11,12)洗涤一组细胞,用Cy5-组蛋白孵育10s,用共聚焦激光扫描显微镜观察Cy5-组蛋白和FITC-HNPs的定位。FITC-HNPs(裸HNP和PEGHNP 8,11,12)在HNP加入后30 min与Cy5-组蛋白共同定位于细胞表面(图5)。4E)。另一方面,FITC-HNPs在加入后24h与Cy5-组蛋白在细胞内共定位。4F)。这些结果表明HNPs与细胞表面结合的组蛋白结合。约有一半的HNP蛋白从细胞表面被去除,另一半的HNP组蛋白复合物留在细胞表面并内化到细胞中。为了解HNP-组蛋白复合物在细胞表面的去向,在共聚焦激光扫描显微镜下观察了FITC-HNPs(裸HNP,PEGHNP 12)和Cy5-组蛋白在细胞内的定位。(补充图。15)。细胞内Cy5-组蛋白在HNP未处理或裸露HNPs处理后10h内积累量呈时间依赖性增加。虽然PEGHNP 12处理6 h后细胞内Cy5-组蛋白的积累也随时间的延长而增加,但6h后细胞内Cy5-组蛋白的积累逐渐减少,提示PEGHNP 12捕获的组蛋白的正电荷在一定程度上被蒙蔽,减少了它们与细胞核和其他胞浆蛋白的相互作用,导致其从细胞中排出。这些结果表明,残留在细胞表面的hnp组蛋白复合物是通过细胞膜渗透进入细胞的。40(无花果)4F)。一旦进入细胞内,由hnp传播的组蛋白显然不会释放到胞浆中,也不会引起毒性。根据这些结果,我们得出结论:在HNPs存在下,组蛋白毒性通过HNPs从细胞表面分离和去除组蛋白以及HNPs与组蛋白的络合和内化来中和,尽管后者仅占细胞表面组蛋白分布的一小部分。

HNPs与血清组蛋白的选择性结合

由于组蛋白在脓毒症期间在血液中释放,隔离剂必须在复杂的生物环境中有选择地发挥作用。将PEGHNP 12分别在50%血浆(25 mg/ml蛋白浓度)和50%(25 mg/ml)组蛋白浓度(6mg/ml)中孵育1h,在37℃下纯化HNP,用BCA法测定HNP组分(22~27)中蛋白质含量。16)。PEGHNP 12在50%血浆中孵育后,HNP组分中仅检出少量蛋白。然而,在50%的血浆中加入组蛋白后,在HNP组分中检测到大量含有组蛋白的蛋白质。这些结果证实PEGHNP 12吸收的血浆蛋白质相对较少,因此具有选择性捕获血液中组蛋白的能力。据报道,一些疏水聚合物hnp与血浆蛋白如白蛋白和纤维蛋白原相互作用。41。由于PEGHNP 12既含有负电荷基团(AAC),又含有疏水官能团,这种官能团的组合或平衡导致PEGHNP 12在血浆中稳定,与血浆中常见的、丰富的蛋白质(包括白蛋白和纤维蛋白原)没有很强的亲和力。41.

HNPs在血清中的稳定性

一个有效的治疗不仅必须隔离组蛋白,而且组蛋白-hnp复合物也必须在血液中溶解。HNP-组蛋白复合物在血液中的聚集可能通过阻断血流而产生致命的副作用。裸HNPs或PEGHNP 12与组蛋白(100 mg/ml)或50%血浆溶液孵育,用DLS(补充表)测量HNP的大小。3)。裸HNP和PEGHNP 12在50%的血浆溶液中孵育后没有改变大小,但只有PEGHNP 12在组蛋白存在下保持初始尺寸(~50 nm)。此外,在37°C下与组蛋白(100 mg/ml)孵育1h后,PEGHNP 12的TEM图像表明,PEGHNP和组蛋白孵育后没有聚集(无粒径变化)(附图)。17),表明PEG-掺入抑制聚集,PEGHNP 12-组蛋白复合物在血液中稳定。

HNPs捕获活鼠血液中组蛋白的研究

接下来我们演示HNPs是否捕获活小鼠血液中的组蛋白。若罗丹明结合组蛋白与fITC标记的PEGylated(PEGHNP 12)和非PEGylated HNPs(裸HNPs)络合,则在570 nm处将发生荧光共振能量转移(Fret)。42。该诊断方法用于体内检测Rho-组蛋白-FITC-HNP复合物.小鼠腹腔注射FITC-HNPs后1h静脉注射Rho-组蛋白.用共聚焦激光扫描显微镜在FITC(Ex=488 nm,Em=520 nm)和FRET(HNP-组蛋白复合物)通道(Ex=488 nm,Em=570 nm)监测血流。5A,补充图。18)。注射HNP后30 min开始监测FITC和FRET信号。FITC标记的HNP裸鼠注射Rho组蛋白前后均未检测到FITC或FRET信号。这一结果来自于先前的结果,即静脉注射后(注射后30分钟只剩下几个百分点),类似成分的裸HNPs会迅速从血液中清除出来。35)。另一方面,在注射FITC-PEGHNP 12后1h,血液中检测到较强的FITC信号。重要的是,Rho组蛋白注射后FITC信号减少,FRET信号增加.这些结果与PEGHNP 12循环1h后仍活跃在血流中的结论是一致的。

图5:HNPs在血流中捕获组蛋白。
figure5

a用激光扫描共聚焦显微镜观察Rho-组蛋白和FITC-PEGHNPs在小鼠血流中的行为.组蛋白注射前后记录FITC(Ex=488 nm,Em=520 nm)和FRET(Ex=488 nm,Em=570 nm)通道。血流中FRET或FITC的荧光强度。零点对应于组蛋白注射的时间.数据表示平均值±S.D。n=4 Rho;罗丹明,异硫氰酸荧光素。b组蛋白预处理小鼠裸露HNPs和PEGHNP 12的生物分布。组蛋白治疗后20s,小鼠静脉注射放射性标记的裸HNPs或PEGHNP 12。注射后24小时,测定HNPs在血浆和各器官中的分布.数据表示平均值±S.D。n=5。c, dCy5-组蛋白的生物分布。PEGHNP 12注射后,小鼠静脉注射Cy5-组蛋白。然后,利用活体成像系统对cy5-组蛋白的生物分布进行监测。d组蛋白注射后1h的离体图像。心、肺、肝、脾、肾、肠。

接下来我们评估HNPs和组蛋白在血液中的生物分布变化。为了建立HNPs的生物分布变化,14C标记HNPs注射BALB/c雄性小鼠20 s后,静脉注射致死剂量的组蛋白(图1)。5B)。组蛋白注射后3h,测定血浆及各器官的HNP放射性。在没有组蛋白的情况下,组蛋白注射后肺内裸HNP的累积量是单纯裸HNP的10倍(补充图)。10)。结果表明,裸露的HNPs与组蛋白结合,并在血流中形成更大的聚集,最终聚集在肺(尾静脉注射后的第一通过器官)。然而,在相似的条件下,PEGHNP 12的生物分布与14C标记的PEGHNP 12在没有组蛋白的情况下(如图所示)。5B,补充图。10),表明组蛋白捕获后PEGHNP 12不聚集在血流中。其次,为评价组蛋白生物分布的变化,将Cy5-组蛋白(50 mg/kg)静脉注射到BALB/c雄性小鼠体内。然后在组蛋白注射后20s静脉注射裸HNPs(10 mg/kg)或PEGHNP 12,用体内成像系统监测Cy5-组蛋白的生物分布。5C,d)。Cy组蛋白治疗后,小鼠肺、肾、肠均有较强的Cy5-组蛋白信号。另一方面,与单纯注射Cy5-组蛋白相比,PEGHNP 12治疗后肺、肾、肠Cy组蛋白信号明显减弱,说明PEGHNP 12在血流中捕获组蛋白,并抑制其在肺、肾和肠中的积聚。这些生物分布研究支持以下结论:PEGHNP 12不仅捕获血液中的组蛋白,而且显著改变了它们的生物分布。

HNPs体内抑制血小板向肺迁移的实验研究

据报道,组蛋白与血液中的血小板结合,导致血小板聚集和凝固,导致血小板数量减少,出血时间延长。43。为证明HNPs对组蛋白和血小板相互作用的抑制作用,在血小板(1×10)中加入FITC-PEGHNP 12(1mg/ml)和Cy5-组蛋白(1mg/ml)。7)。虽然Cy5-组蛋白粘附并聚集于血小板(补充图)。19APEGHNP 12通过捕获组蛋白来抑制Cy5-组蛋白与血小板的相互作用(附图)。19b)。接下来我们评估静脉注射组蛋白后血液中血小板的数量。PEGHNP 12(10 mg/kg)后1h静脉注射组蛋白(40 mg/kg)。然后测定组蛋白注射后20 min血血小板数和尾出血时间。6a,b)。组蛋白注射明显减少了血中血小板数,延长了尾出血时间。而PEGHNP 12预处理可明显改善血液中血小板数量,抑制组蛋白注射后尾出血时间的延长。我们发现,静脉注射组蛋白在肺内累积(如图所示)。6d)并在肺内用血小板制造血栓。43。事实上,静脉注射Cy5-组蛋白(40 mg/kg,图1)后,在肺内观察到许多血小板与组蛋白合并。6C)。与此形成对照的是,PEGHNP 12(10 mg/kg)可抑制血小板向肺的迁移,肺组织蛋白与PEGHNP 12共定位。这些结果表明PEGHNP 12能有效地中和血液中的组蛋白,抑制血小板活化、血栓形成和炎症。

图6:HNPs在体内对小鼠感染性致死性的保护作用。
figure6

a注射组蛋白和/或HNPs后的血小板数。组织蛋白(40 mg/kg)注射HNPs后1h(10 mg/kg)。注射后20 min测定血小板数。显著差异;*p < 0.0001 vs. Histones alone. Data represent the means ± s.d. n数据表示平均值±S.D。n=4.用TUKEY后特设测验进行单因素方差分析,评价组内差异。b注射组蛋白和/或PEGHNPs后的尾出血时间。组织蛋白(40 mg/kg)注射HNPs后1h(10 mg/kg)。注射后20分钟,测量尾部出血时间。显著差异;*p < 0.0001 vs. Histones alone. Data represent the means ± s.d. n数据表示平均值±S.D。n=4.用TUKEY后特设测验进行单因素方差分析,评价组内差异。c注射组蛋白和/或HNPs后肺的免疫染色。FITC-PEGHNP注射液(10 mg/kg)后1h,将Cy5-组蛋白(40 mg/kg)静脉注入小鼠体内。组蛋白注射后20 min,肺冰冻切片CD 41染色。红色:组蛋白;蓝色:血小板;绿色:HNPs。酒吧:0.05毫米。d注射组蛋白(75 mg/kg)后20s,用PEGHNPs(10 mg/kg)静脉给药小鼠的存活率。e注射PEGHNPs(10 mg/kg)后1h,组蛋白(75 mg/kg)静滴小鼠存活率。f注射PEGHNP 12(10 mg/kg)可提高LPS所致脓毒症模型小鼠的存活率。脂多糖

HNPs对小鼠感染性致死性的体内保护作用

静脉注射组蛋白可引起脓毒症,如嗜中性粒细胞增多和肺泡微血管积聚,最终导致死亡。8。用致命剂量的组蛋白挑战标准脓毒症小鼠模型。8。我们以非PEGylatedHNP 12为对照,研究了PEG掺入对体内组蛋白中和能力的影响。为了研究HNPs对小鼠中和组蛋白的作用,在静脉注射组蛋白(75 mg/kg)后20s,将HNPs(10 mg/kg)静脉注射到小鼠体内,观察HNPs对小鼠的中和作用。PEGHNP 12用于这些体内研究。HNP治疗使所有小鼠(100%的存活率)免于组蛋白毒性(如图所示)。6d)。相反,50%的小鼠在注射组蛋白后死亡,这表明当致命剂量进入活小鼠的血液中时,HNPs的引入会中和组蛋白。由于组蛋白在脓毒症期间持续释放,持续的疗效受到血液中长循环时间的影响。然而,HNPs在血液中的长时间循环增加了与具有形成蛋白质电晕潜力的血浆蛋白相互作用的机会。41。蛋白质电晕的形成会降低HNPs对组蛋白的亲和力和容量。44。因此,在不降低组蛋白捕获能力的情况下,增加HNP在血流中的循环时间是影响HNP疗效的重要因素。在本研究中,我们比较了循环聚乙二醇(PEGHNP 12)和非聚乙二醇化HNPs(裸HNPs)的组蛋白中和效果。在静脉注射HNPs后1h,将组蛋白静脉注射到BALB/c雄性小鼠体内。6E)。与对照组相比,裸鼠组蛋白注射后裸鼠存活率无明显提高。相反,循环PEGHNP 12可显著提高静脉注射组蛋白的小鼠的存活率(2倍)。PEGHNP 12的循环时间也较长,与血浆蛋白形成复合物的倾向较小。结果表明,PEGHNP 12在血液循环1h后仍保持组蛋白中和能力。

最后,以静脉注射LPS所致脓毒症模型小鼠为实验对象,观察了PEGHNP 12对脓毒症的治疗作用。8(无花果)6f)。重要的是,我们先前已经证明,含有hnp的tbam与LPS没有结合。27。据了解,与单纯组蛋白注射相比,小鼠体内注射LPS可复制严重脓毒症的生理。8,45。由于血中炎性细胞因子如肿瘤坏死因子、阿尔法和白细胞介素-10的浓度在静脉注射LPS后1.5h显著升高。46,海地国家警察应在这段时间内注射。PBS(对照组)、裸HNPs或PEGHNP 12在LPS注射后2h内每隔30 min静脉注射4次。所有小鼠在LPS注射后20h内死亡,然后用PBS或裸HNP治疗。然而,在PEGHNP 12治疗下,存活率显著提高(90%)。这些结果证明PEGHNP 12可以通过中和血液和细胞表面的组蛋白来治疗脓毒症。

讨论

虽然脓毒症的死亡人数一直在增加,但最近的治疗没有显著改善存活率。由于多种因素导致脓毒症的病理,确定最重要的靶点是寻找有效的治疗干预措施的一个战略挑战。尽管在多个方面取得了进展,以抑制导致脓毒症病理的产生或隔离有毒因素,但死于脓毒症的人数一直在增加,但最近的治疗没有显著改善存活率。我们选择把重点放在组蛋白固存上。组蛋白是在败血症后期释放的致死性基本蛋白。在这里,我们展示了一种有可能影响晚期脓毒症患者生存的策略。这项创新是一种非生物合成共聚物,一种能中和体内所有组蛋白亚型的HNP。通过调整共聚物的阴离子和疏水单体组成,优化了HNP的理化性质。抗体、合成聚合物和NPs,它们能够隔离负责脓毒症病理的毒素,如巨噬细胞膜包被的NPs。14或合成共聚物32也显示了对脓毒症的治疗效果,证实了这一策略是一种潜在的治疗干预措施。这些策略的成功取决于许多变量的作用,包括它们对目标蛋白的能力取决于部分比表面积,这是对解毒效率的潜在限制。本报告中描述的HNPs可以在其表面和内部捕获毒素,并且与抗体和膜包膜NPs等微粒隔离剂相比具有更高的毒素能力。此外,本报告所述的优化HNPs捕获并中和了大量的组蛋白亚型(Mg蛋白/mg HNP=2-10),这与抗组蛋白抗体(Mg蛋白/Mg抗体=0.14)相比具有潜在的优势。

尽管hnp的物理化学性质可以被改变以达到高亲和力和选择性。47这些特性本身不足以达到治疗效果,循环时间也是一个重要因素。不幸的是,先前对hnp的研究已经显示出其固有的短循环时间。23,31。由于亲和力和选择性取决于HNP的化学成分,传统的利用PEG链提高循环时间的方法提出了独特的挑战。然而,我们在本报告中已经确定,在聚合步骤中加入优化的PEG链长度和数量会导致HNPs的循环时间增加,而目标结合亲和力和容量没有明显降低。这使得HNPs能够在静脉注射后的很长时间内捕获组蛋白。HNPs的高结合能力、广谱靶向性、低聚集性和长循环时间的特点,使其在寻找严重炎症和脓毒症的治疗中具有重要的临床意义。

在目前的形式中,组蛋白固存受到几个限制。首先,虽然我们设计了hnp来有效捕获组蛋白,但其他炎症细胞因子,如高迁移率群盒-1(Hmgb 1)和肿瘤坏死因子α,也对脓毒症的病理有贡献。48。HMGB 1的抑制作用11,选择性细胞因子12,和组蛋白8显示脓毒症的治疗效果,关闭细胞因子风暴和炎症由中和所有有毒和炎症剂可能会产生比单一蛋白中和更显着的治疗反应,提示联合治疗可能是最有效的途径。第二,尽管构成类似的hnp被证明是无毒和无免疫原性的。23,31,HNPs可能不会被体内的酶降解,从而使其具有长期积累的潜力。由于脓毒症治疗可能需要多次注射HNP,这种累积可能会导致体内下游的不良影响。因此,如果这成为问题,一种可生物降解的特性最终可以包括在HNP配方中。第三,在我们的研究中,我们选择了组蛋白和LPS注射。49作为小鼠脓毒症模型。然而,有许多小鼠脓毒症模型,其中一些包括细菌注射。本工作未涉及细菌成分,但HNPs的治疗效果应通过其他脓毒症模型动物来探讨。随着这项研究的进展,这项工作将继续进行。

HNPs适合于组蛋白固存的替代格式。例如,将体内外血液净化疗法作为脓毒症的辅助治疗方法,已取得临床前效果。50,51本报告中所述的HNPs也可能具有选择性地将组蛋白从循环中去除的能力。更广泛地说,在癌症、糖尿病、中风和新冠肺炎等疾病中可以观察到异常高浓度的分子。从理论上讲,通过优化功能单体的结构和用量,将HNPs应用于这些疾病是可能的。在我们未来的工作中,我们将使用我们先前报道的基于图像的血小板聚集分类器,探索基于hnp的对脓毒症所致血小板聚集的抑制作用。52,53,54。本研究建立了非生物合成高分子HNPs作为选择性蛋白质亲和剂治疗顽固性疾病的潜力。


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297