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抑制4.1R通过激活ERK信号通路增强NKG2D-car T细胞对胰腺癌的杀伤作用

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发表时间:2021-09-22 09:59作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

胰腺癌(PC)是最常见的恶性肿瘤之一。嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞在血液恶性肿瘤的治疗中取得了显著的疗效。然而,肿瘤特异性靶点的缺乏和抑制因子的存在限制了CAR T细胞治疗实体瘤的功能。4.1R抑制T细胞反应的抗肿瘤活性。本研究研究了天然杀伤组(NKG2D)-CAR T细胞4.1R缺失对PC的抗肿瘤活性。将携带NKG2D-CAR、NC-NKG2D-CAR或Kd2-NKG2D-CAR的慢病毒载体转染T细胞,获得CAR T细胞。在体外,NKG2D-CAR T细胞比Mock T细胞具有更高的细胞毒性.然而,与NKG2D-CAR T细胞相比,Kd2-NKG2D-CAR T细胞对PC细胞的杀伤作用更强。此外,Kd2-NKG2D-CAR T细胞的增殖率和细胞毒活性均显著高于NKG2D-CAR T细胞。此外,抑制性受体PD-1和Tim-3在Kd2-NKG2D-CAR T细胞上表达较低.在体内,Kd2-NKG2D-CAR T细胞比NKG2D-CAR T细胞在异种移植模型中更有效地抑制肿瘤生长。4.1R通过激活ERK信号通路调节CAR T细胞功能。因此,本研究为提高CART治疗的抗肿瘤效率提供了新的思路。

导言

胰腺癌(PC)是最具转移性和致命性的癌症之一,5年生存率不到5%。1, 2]。迄今为止,根治性手术是治疗PC的最佳选择之一,但在手术切除可行的情况下很难诊断。3]。因此,大多数患者最终会发展为局部和/或转移性复发,从而导致高死亡率和高发病率以及不良的预后。4].

随着肿瘤免疫治疗的迅速发展,嵌合抗原受体T细胞(CART)的过继转移可以长期缓解血液系统恶性肿瘤。5]。目前,CD 19 CAR T细胞治疗B细胞恶性肿瘤已获FDA批准[6]。然而,由于肿瘤特异性靶点的缺乏,固体肿瘤的治疗仍面临许多挑战。

NKG2D是一种在多种免疫效应细胞上表达的激活受体,在肿瘤监测中具有重要作用。NKG2D配体包括MHCⅠ链相关分子A和B(MICA和MICB)和6种巨细胞病毒UL16结合蛋白(ULBP 1-6)。众所周知,NKG2DLs主要在大多数肿瘤细胞上表达,包括血液学和实体肿瘤,但在健康组织中通常不表达或低水平表达。7, 8]。提示NKG2D受体可作为肿瘤免疫治疗的潜在靶点。到目前为止,NKG2D CAR T细胞已经在血液和实体肿瘤的治疗中得到了广泛的应用。对NKG2D-CAR T细胞的安全性和可行性进行了评价,发现NKG2D-CAR T细胞在体内的增殖和持久性受到限制。因此,虽然NKG2D-CAR T细胞在体外裂解肿瘤细胞方面表现出了惊人的效果,但仍需进一步改进以提高临床疗效。9,10,11].

细胞骨架蛋白4.1R(4.1R)属于4.1科,包括三个高度保守的结构域:N端膜结合区(Mbd)、内谱肌动蛋白结合区(SABD)和C末端结构域(Ctd)[12]。它首先在红细胞中被发现,在维持红细胞膜的机械稳定性方面起着重要的作用。13, 14]。目前已有研究表明,4.1R通过直接与LAT结合,从而抑制ZAP-70在T细胞中的磷酸化而发挥作用。15].

在本研究中,我们用NKG2D和shRNA-4.1R构建了CAR T来治疗PC。与NKG2D-CAR T细胞相比,Kd2-NKG2D-CAR T细胞的细胞增殖、细胞毒性和颗粒酶表达明显增强,耗竭标记物明显减少。Kd2-NKG2D-CAR T细胞在体内具有较强的抗肿瘤活性.这些发现为提高CAR T细胞治疗的效率提供了新的工具。

结果

用shRNA靶向4.1R导致NKG2D-CAR T细胞的4.1R基因敲除

采用第二代CAR主干构建CAR T细胞。CAR包括CD8α先导、NKG2D胞外区、α铰链和跨膜结构域(TM)、4-1BB胞浆区(CD 137)、CD3ζ细胞质尾和靶向蛋白4.1R(shRNA4.1R)的shRNA,命名为Kd1-NKG2D CAR或Kd2-NKG2D CAR。1A)。将表达NKG2D-CAR和NC-NKG2D-CAR或KD-NKG2D-CAR的慢病毒转导后,产生Mock T细胞。采用BD-LSRFortessa流式细胞术检测NKG2D在CAR T细胞中的表达水平,结果表明NKG2D在CAR T细胞中的表达水平显著高于Mock T细胞,表明NKG2D在T细胞中的表达成功。1B).

图1:NKG2D-CAR T细胞4.1R基因敲除的产生及特性。
figure1

aCD28和4-1BB共刺激结构域、CD3ζ结构域和shRNA4.1R的NKG2D靶向结构的图式表达。b流式细胞术分析其转导效率。用表达NKG2D-CAR的慢病毒转染T细胞,荧光标记抗NKG2D抗体染色后用流式细胞仪(FACS)分析转染效率。c定量实时PCR分析Mock T细胞、NC-NKG2D-CAR T细胞、Kd1-NKG2D-CAR T细胞和Kd2-NKG2D-CAR T细胞4.1R mRNA水平。提取转染细胞的总mRNA并进行反向转录,定量实时PCR检测4.1R的表达水平。dMock T细胞、NC-NKG2D-CAR T细胞、Kd1-NKG2D-CAR T细胞和Kd2-NKG2D-CAR T细胞4.1R蛋白水平的Western blot分析。数据代表了三个独立的实验。***P < 0.001, NS not significant.

为降低NKG2D-CAR T细胞中蛋白4.1R的表达,将shRNA-4.1R共同表达。用实时定量PCR和westernblot分析4.1R在转录和蛋白水平的表达。结果表明,Kd2-NKG2D-CAR T细胞中4.1R的表达明显低于NC-NKG2D-CAR T细胞,而Kd1-NKG2D-CAR T细胞与NC-NKG2D-CAR T细胞或Mock T细胞的表达无统计学差异(图5)。1C,d)。因此,Kd2-NKG2D-CAR T细胞被用于以下研究。

4.1R基因敲除增强NKG2D-CAR T细胞体外杀伤活性

NKG2DLs在肿瘤细胞表面的表达水平是影响NKG2D-CAR T细胞抗肿瘤活性的关键因素。因此,采用流式细胞仪检测MICA/B在SW 1990、CAPAN 2和PANC 28上的分布。我们的数据表明,许多PC细胞株表达的NKG2DLs水平较高。在这些细胞系中,PANC 28的表达最高,而SW 1990的表达最低,在随后的实验中作为阴性对照。2A)。为评价NKG2D-CAR T细胞的体外抗肿瘤活性,在1:1、3:1和9:1的比例下,将NKG2D-CAR T细胞与不同的PC细胞共孵育。所有类型的NKG2D-CAR T细胞对CAPAN 2和PANC 28均有明显的杀伤作用,而SW 1990则无明显的杀伤作用。Kd2-NKG2D-CAR T组比NKG2D-CAR T组和NC-NKG2D-CAR T组细胞毒活性高。NKG2D-CAR T组与NC-NKG2D-CAR T组比较无显着性差异(图1)。2B).

图2:NKG2DLs在胰腺癌细胞株中的表达及NKG2D-CAR T细胞的杀伤活性。
figure2

a流式细胞仪直方图显示NKG2DLs在SW 1990、CAPAN 2和PANC 28上表达。b细胞系图显示Mock T、NKG2D-CAR T、NC-NKG2D-CAR T和Kd2-NKG2D-car T对不同效应者的细胞毒性。E:T)16小时。CD 69的表达c),干扰素-γ(d)和Gzm B(e)以及CD107a的表达(f以9:1的比例与PANC 28共孵育16h(左)。对MFI和百分比进行了统计分析,并显示在列图(中、右)中(n=3)。数据代表了三个独立的实验。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, NS not significant.

4.1R基因敲除刺激NKG2D-CAR T细胞活化、脱颗粒和分泌细胞因子

CD 69是一种T细胞表面分子,被认为是活化标记物[16]。NKG2D-CAR T细胞与PANC 28和CAPAN 2共培养后,NKG2D-CAR T细胞中CD 69的表达明显高于Mock T细胞(图1)。2C和补充图。1A),但不是SW 1990(附图)。2A)。有趣的是,Kd2-NKG2D-CAR T组CD 69的表达明显高于NKG2D-CAR T组和NC-NKG2D-CAR T组。NKG2D-CAR T组与NC-NKG2D-CAR T组比较无显着性差异.

由于T细胞介导的细胞毒性在很大程度上依赖于干扰素-γ和GzmB[17]。与CD 69一致,与PANC 28和CAPAN 2共培养后,NKG2D-CAR T细胞中IFN-γ和GzmB的表达明显高于Mock T细胞。Kd2-NKG2D-CAR T组与NKG2D-CAR T组和NC-NKG2D-CAR T组相比,IFN-γ和Gzm B水平明显升高(图1)。2D,e和补充图。1B,c),但不是SW 1990(附图)。2B,c)。NKG2D-CAR T组与NC-NKG2D-CAR T组比较无显着性差异.

脱颗粒是T淋巴细胞溶解功能的指标,可通过检测CD107a[18]。与PANC 28和CAPAN 2共培养后,NKG2D-CAR T细胞中CD107a水平高于Mock T细胞。此外,CD107a在Kd2-NKG2D-CAR T组高于NKG2D-CAR T组和NC-NKG2D-CAR T组。2F和补充图。1D),但不是SW 1990(附图)。二维空间)。NKG2D-CAR T组与NC-NKG2D-CAR T组比较无显着性差异.

4.1R基因敲除促进细胞增殖,减少NKG2D-CAR T细胞的耗竭

为了研究NKG2D-CAR T细胞和Kd2-NKG2D-CAR T细胞的功能,本研究检测了与PANC 28共培养后的增殖能力。Kd2-NKG2D-CAR T组增殖速度明显快于其他各组,Mock T组、NKG2D-CAR T组和NC-NKG2D-CAR T组之间差异无显着性(图1)。3A).

图3:4.1R缺乏促进细胞增殖,减少CAR T细胞的耗竭。
figure3

a用CFSE标记的模拟T、NKG2D-CAR T、NC-NKG2D-CAR T和Kd2-NKG2D-CAR T以1:5的比例与PANC 28共同孵育7d。用CFSE稀释法作为细胞增殖的衡量指标(左),计算MFI(右)(n=3)。b, c模拟T、NKG2D-CAR T、NC-NKG2D-CAR T、Kd2-NKG2D-CAR T与PANC 28按1:5比例孵育3d。用抗CD3染色区分T细胞和靶细胞.流式细胞术(左)检测TIM-3和PD-1的表达.对MFI和百分比进行了统计分析,并显示在列图(中、右)中(n=3)。数据代表了三个独立的实验。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, NS not significant.

许多抑制性受体,包括pd-1和Tim-3在T淋巴细胞上表达,可能导致杀伤和分泌细胞因子的能力下降。19, 20]。与PANC 28共培养后,NKG2D-CAR T细胞中PD-1的表达较Mock T细胞显著增加,而Tim-3则无明显增加。有趣的是,Kd2-NKG2D-CAR T组与NKG2D-CAR T组和NC-NKG2D-CAR T组相比,PD-1和Tim-3的表达均较低.NKG2D-CAR T组与NC-NKG2D-CAR T组比较无显着性差异(图1)。3B,c).

4.1R通过ERK信号通路调节NKG2D-car T细胞

ERK是MAPK通路的成员,在4.1R中发挥着重要作用。−/−T细胞[15]。在本研究中,我们发现下调4.1R后,p-ERK的表达上调(见图)。4A)。为探讨4.1R是否通过激活ERK调节NKG2D-CAR T细胞功能,加入P-ERK抑制剂U 0126,结果显示P-ERK的表达受到抑制(补充图)。3),从而抑制细胞毒性功能、细胞增殖和CD 69的表达(如图所示)。4B-d)。此外,干扰素-γ的生产(数据未显示)以及GzmB的生产(图)。4E阻断ERK信号通路后,CD107a表达被抑制(数据未显示)。相反,蒂姆-3的表达。4F)和PD-1(数据未显示)被上调对抑制剂的反应。结果表明,4.1R通过ERK信号通路介导NKG2D-CAR T细胞的功能。

图4:4.1R缺陷通过ERK信号通路调节CAR T细胞的功能。
figure4

a模拟T、NKG2D-car T、NC-NKG2D-car T、Kd2-NKG2D-car T与PANC 28以9:1的比例孵育16h,流式细胞仪(左)检测p-ERK的表达,并对p-ERK阳性T细胞的百分率进行统计学分析(右)(n=3)。b线状图显示NC-NKG2D-CAR T和Kd2-NKG2D-CAR T对PANC 28的细胞毒性作用不同。E:T)在10μM U 0126存在和不存在的情况下,比值为16h。cNC-NKG2D-CAR T和Kd2-NKG2D-CAR T与PANC 28共同孵育,作用于不同的效应物。E:T)在10μM U 0126不存在和存在的情况下,7天的比值。用CFSE稀释法作为细胞增殖的衡量指标(左),计算MFI(右)(n=3)。NC-NKG2D-CAR T和Kd2-NKG2D-CAR T与PANC 28共同孵育,作用于不同的效应物。E:T)在10μM U 0126存在和不存在的情况下,比值为16h。CD 69表达d),Gzm B(e)和Tim-3(f)流式细胞仪检测(左)。对MFI和百分比进行了统计分析,并显示在列图(中、右)中(n=3)。数据代表了三个独立的实验。**P < 0.01, ***P < 0.001, NS not significant.

4.1R沉默NKG2D-CAR T细胞在小鼠体内显示出更有效的抗肿瘤活性。

为评价NKG2D-CAR T细胞的体内治疗效果,采用稳定荧光素酶转染的PANC 28细胞,在NSG小鼠体内建立皮下移植瘤。10天后,随机分为5组,分别静脉注射磷酸盐缓冲液生理盐水(PBS)、模拟T细胞(Mock-T细胞)、NKG2D-CAR T细胞、NC-NKG2D-CAR T细胞和Kd2-NKG2D-CAR T细胞(图1)。5A)。生物发光显像显示NKG2D-CAR T组与PBS组和Mock T组相比,肿瘤消退持续。此外,Kd2-NKG2D-CAR T组与NKG2D-CAR T组和NC-NKG2D-CAR T组相比,肿瘤体积明显缩小,生存率明显提高。5B-d)。NKG2D-CAR T组小鼠体重低于PBS组和Mock T组,NKG2D-CAR T组与PBS组和Mock T组比较无显着性差异(图1)。5E)。为了量化人T细胞的持续输注量,我们采集了荷瘤小鼠的外周血.第一次注射CAR T细胞后28天,人CD3+Kd2-NKG2D-CAR T组T细胞计数及效应T细胞比率均高于其他各组(图1)。5F,g)。这些结果表明,4.1R缺失增强了NKG2D-CAR T细胞的体内抗肿瘤功能。

图5:4.1R缺乏对PANC 28在小鼠体内形成的异种移植瘤表现出有效而持久的抗肿瘤活性。
figure5

a一个完整的动物实验的示意图。b, cPANC 28/Luc细胞移植小鼠在指定时间点的肿瘤生物发光图像。d用Kaplan-Meier曲线观察小鼠的总体存活情况.e线条图显示了小鼠的体重。fCD3计数+用流式细胞术(左)检测外周血T细胞,并测定CD3的百分率。+计算T细胞(右)(n=3)。g流式细胞术检测NKG2D-CAR T细胞在外周循环中的亚群比例。数据代表了三个独立的实验。**P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, NS not significant.

讨论

胰腺癌已成为世界上最致命的肿瘤之一,其临床治疗主要是手术切除。然而,许多PC患者往往是在晚期确诊的,因此在适当的时间治疗是非常困难的。2, 3]。近年来,CART免疫疗法的出现为恶性肿瘤的治疗提供了一种很有前途的方法。虽然CAR T在B细胞恶性肿瘤中有较好的治疗效果,但许多因素制约了CAR T对实体瘤的治疗。6, 7].

“离体肿瘤,靶点”是CAR T细胞治疗实体瘤最显著的因素之一。21]。NKG2D是一种在T细胞和NK细胞上表达的激活受体,NKG2DLs在PC和其他肿瘤上的表达,免疫抑制细胞已被证实。22]。因此,针对NKG2DLs的NKG2D-car T细胞被设计用于消除各种肿瘤。23]。在此基础上,我们设计了第二代NKG2D-CAR T细胞来治疗PC.

为了进一步提高CAR T细胞的抗肿瘤活性,人们采取了一些提高CAR T细胞疗效的策略,如增强趋化因子受体的表达,或添加抗体阻断检查点受体。然而,这些策略似乎对PC肿瘤没有多大作用。24, 25]。因此,一些抑制基因在CAR T细胞中被敲除,以增强CAR T细胞的功能,如A2aR、ACAT 1和PD-1[26,27,28]。细胞骨架蛋白4.1R是4.1家族成员之一,具有抑制T细胞活性的作用。15]。本研究以NKG2D-CAR T细胞为研究对象,研究了4.1R基因敲除对NKG2D-CAR T细胞的影响。产生含有shRNAs的NKG2D-CAR T细胞,干扰4.1R的表达。如预期的那样,4.1R的减少导致NKG2D-CAR T细胞的细胞毒性增强。此外,介导T细胞毒性的IFN-γ和GzmB在Kd2-NKG2D-CAR T细胞中明显高于NKG2D-CAR T细胞和正常T细胞。Kd2-NKG2D-CAR T组CD 69和CD107a表达高于NKG2D-CAR T细胞和正常T细胞。肿瘤中T细胞的积累有助于抑制肿瘤的生长。29]。在此,我们验证了4.1R抑制对细胞增殖的影响,发现Kd2-NKG2D-CAR T细胞比NKG2D-CAR T细胞和对照T细胞的增殖速度快得多。TIM-3和Pd-1在T细胞上的高表达,提示T细胞处于衰竭状态,损害了T细胞抗肿瘤的功能。19, 20]。在我们的研究中,我们的数据显示,在Kd2-NKG2D-CAR T细胞中,Tim-3和PD-1的表达低于NKG2D-CAR T细胞和正常T细胞。此外,NKG2D-CAR T细胞在PC异种移植瘤模型中具有较强的抑瘤作用。结果表明,抑制4.1R可增强NKG2D-CAR T细胞的功能,为PC的临床治疗提供了一种潜在的治疗策略。此外,我们还发现4.1R通过ERK信号通路调节NKG2D-CAR T细胞的功能,从而揭示了4.1R沉默NKG2D-CAR T细胞的机制。

RNA干扰(RNAi)技术和CRISPR/Cas9技术都被广泛应用于抑制基因表达。30, 31]。RNAi被广泛用于通过瞬时表达小干扰RNA(SiRNA)或稳定表达短发夹RNA(ShRNA)来降低靶基因的表达。32]。近年来,CRISPR/Cas9技术已经成为一种强有力的方法,可以通过Cas9介导的DNA切割来敲除靶基因。33]。然而,与CRISPR/Cas9相比,shRNA更方便、更经济。本研究在一个载体上构建了shRNA和CAR,并通过共表达shRNA和CAR的慢病毒感染获得了具有4.1R基因敲除的CAR T细胞。

本研究表明,4.1R基因敲除可激活NKG2D-CAR T细胞,并通过ERK信号通路增加IFN-γ和Gzm B的释放,从而增强NKG2D-CAR T细胞抗胰腺癌的活性。此外,我们的发现也为改良CAR T细胞在临床治疗实体性恶性肿瘤方面提供了潜在的应用前景。


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