抑制4.1R通过激活ERK信号通路增强NKG2D-car T细胞对胰腺癌的杀伤作用

胰腺癌(PC)是最常见的恶性肿瘤之一。嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞在血液恶性肿瘤的治疗中取得了显著的疗效。然而，肿瘤特异性靶点的缺乏和抑制因子的存在限制了CAR T细胞治疗实体瘤的功能。4.1R抑制T细胞反应的抗肿瘤活性。本研究研究了天然杀伤组(NKG2D)-CAR T细胞4.1R缺失对PC的抗肿瘤活性。将携带NKG2D-CAR、NC-NKG2D-CAR或Kd2-NKG2D-CAR的慢病毒载体转染T细胞，获得CAR T细胞。在体外，NKG2D-CAR T细胞比Mock T细胞具有更高的细胞毒性.然而，与NKG2D-CAR T细胞相比，Kd2-NKG2D-CAR T细胞对PC细胞的杀伤作用更强。此外，Kd2-NKG2D-CAR T细胞的增殖率和细胞毒活性均显著高于NKG2D-CAR T细胞。此外，抑制性受体PD-1和Tim-3在Kd2-NKG2D-CAR T细胞上表达较低.在体内，Kd2-NKG2D-CAR T细胞比NKG2D-CAR T细胞在异种移植模型中更有效地抑制肿瘤生长。4.1R通过激活ERK信号通路调节CAR T细胞功能。因此，本研究为提高CART治疗的抗肿瘤效率提供了新的思路。

胰腺癌(PC)是最具转移性和致命性的癌症之一，5年生存率不到5%。1, 2]。迄今为止，根治性手术是治疗PC的最佳选择之一，但在手术切除可行的情况下很难诊断。3]。因此，大多数患者最终会发展为局部和/或转移性复发，从而导致高死亡率和高发病率以及不良的预后。4].

随着肿瘤免疫治疗的迅速发展，嵌合抗原受体T细胞(CART)的过继转移可以长期缓解血液系统恶性肿瘤。5]。目前，CD 19 CAR T细胞治疗B细胞恶性肿瘤已获FDA批准[6]。然而，由于肿瘤特异性靶点的缺乏，固体肿瘤的治疗仍面临许多挑战。

NKG2D是一种在多种免疫效应细胞上表达的激活受体，在肿瘤监测中具有重要作用。NKG2D配体包括MHCⅠ链相关分子A和B(MICA和MICB)和6种巨细胞病毒UL16结合蛋白(ULBP 1-6)。众所周知，NKG2DLs主要在大多数肿瘤细胞上表达，包括血液学和实体肿瘤，但在健康组织中通常不表达或低水平表达。7, 8]。提示NKG2D受体可作为肿瘤免疫治疗的潜在靶点。到目前为止，NKG2D CAR T细胞已经在血液和实体肿瘤的治疗中得到了广泛的应用。对NKG2D-CAR T细胞的安全性和可行性进行了评价，发现NKG2D-CAR T细胞在体内的增殖和持久性受到限制。因此，虽然NKG2D-CAR T细胞在体外裂解肿瘤细胞方面表现出了惊人的效果，但仍需进一步改进以提高临床疗效。9,10,11].

细胞骨架蛋白4.1R(4.1R)属于4.1科，包括三个高度保守的结构域：N端膜结合区(Mbd)、内谱肌动蛋白结合区(SABD)和C末端结构域(Ctd)[12]。它首先在红细胞中被发现，在维持红细胞膜的机械稳定性方面起着重要的作用。13, 14]。目前已有研究表明，4.1R通过直接与LAT结合，从而抑制ZAP-70在T细胞中的磷酸化而发挥作用。15].

在本研究中，我们用NKG2D和shRNA-4.1R构建了CAR T来治疗PC。与NKG2D-CAR T细胞相比，Kd2-NKG2D-CAR T细胞的细胞增殖、细胞毒性和颗粒酶表达明显增强，耗竭标记物明显减少。Kd2-NKG2D-CAR T细胞在体内具有较强的抗肿瘤活性.这些发现为提高CAR T细胞治疗的效率提供了新的工具。

用shRNA靶向4.1R导致NKG2D-CAR T细胞的4.1R基因敲除

采用第二代CAR主干构建CAR T细胞。CAR包括CD8α先导、NKG2D胞外区、α铰链和跨膜结构域(TM)、4-1BB胞浆区(CD 137)、CD3ζ细胞质尾和靶向蛋白4.1R(shRNA4.1R)的shRNA，命名为Kd1-NKG2D CAR或Kd2-NKG2D CAR。1A)。将表达NKG2D-CAR和NC-NKG2D-CAR或KD-NKG2D-CAR的慢病毒转导后，产生Mock T细胞。采用BD-LSRFortessa流式细胞术检测NKG2D在CAR T细胞中的表达水平，结果表明NKG2D在CAR T细胞中的表达水平显著高于Mock T细胞，表明NKG2D在T细胞中的表达成功。1B).

aCD28和4-1BB共刺激结构域、CD3ζ结构域和shRNA4.1R的NKG2D靶向结构的图式表达。b流式细胞术分析其转导效率。用表达NKG2D-CAR的慢病毒转染T细胞，荧光标记抗NKG2D抗体染色后用流式细胞仪(FACS)分析转染效率。c定量实时PCR分析Mock T细胞、NC-NKG2D-CAR T细胞、Kd1-NKG2D-CAR T细胞和Kd2-NKG2D-CAR T细胞4.1R mRNA水平。提取转染细胞的总mRNA并进行反向转录，定量实时PCR检测4.1R的表达水平。dMock T细胞、NC-NKG2D-CAR T细胞、Kd1-NKG2D-CAR T细胞和Kd2-NKG2D-CAR T细胞4.1R蛋白水平的Western blot分析。数据代表了三个独立的实验。***P < 0.001, NS not significant.

全尺寸图像

为降低NKG2D-CAR T细胞中蛋白4.1R的表达，将shRNA-4.1R共同表达。用实时定量PCR和westernblot分析4.1R在转录和蛋白水平的表达。结果表明，Kd2-NKG2D-CAR T细胞中4.1R的表达明显低于NC-NKG2D-CAR T细胞，而Kd1-NKG2D-CAR T细胞与NC-NKG2D-CAR T细胞或Mock T细胞的表达无统计学差异(图5)。1C，d)。因此，Kd2-NKG2D-CAR T细胞被用于以下研究。

4.1R基因敲除增强NKG2D-CAR T细胞体外杀伤活性

NKG2DLs在肿瘤细胞表面的表达水平是影响NKG2D-CAR T细胞抗肿瘤活性的关键因素。因此，采用流式细胞仪检测MICA/B在SW 1990、CAPAN 2和PANC 28上的分布。我们的数据表明，许多PC细胞株表达的NKG2DLs水平较高。在这些细胞系中，PANC 28的表达最高，而SW 1990的表达最低，在随后的实验中作为阴性对照。2A)。为评价NKG2D-CAR T细胞的体外抗肿瘤活性，在1：1、3：1和9：1的比例下，将NKG2D-CAR T细胞与不同的PC细胞共孵育。所有类型的NKG2D-CAR T细胞对CAPAN 2和PANC 28均有明显的杀伤作用，而SW 1990则无明显的杀伤作用。Kd2-NKG2D-CAR T组比NKG2D-CAR T组和NC-NKG2D-CAR T组细胞毒活性高。NKG2D-CAR T组与NC-NKG2D-CAR T组比较无显着性差异(图1)。2B).

a流式细胞仪直方图显示NKG2DLs在SW 1990、CAPAN 2和PANC 28上表达。b细胞系图显示Mock T、NKG2D-CAR T、NC-NKG2D-CAR T和Kd2-NKG2D-car T对不同效应者的细胞毒性。E:T)16小时。CD 69的表达c)，干扰素-γ(d)和Gzm B(e)以及CD107a的表达(f以9：1的比例与PANC 28共孵育16h(左)。对MFI和百分比进行了统计分析，并显示在列图(中、右)中(n=3)。数据代表了三个独立的实验。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, NS not significant.

全尺寸图像

4.1R基因敲除刺激NKG2D-CAR T细胞活化、脱颗粒和分泌细胞因子

CD 69是一种T细胞表面分子，被认为是活化标记物[16]。NKG2D-CAR T细胞与PANC 28和CAPAN 2共培养后，NKG2D-CAR T细胞中CD 69的表达明显高于Mock T细胞(图1)。2C和补充图。1A)，但不是SW 1990(附图)。2A)。有趣的是，Kd2-NKG2D-CAR T组CD 69的表达明显高于NKG2D-CAR T组和NC-NKG2D-CAR T组。NKG2D-CAR T组与NC-NKG2D-CAR T组比较无显着性差异.

由于T细胞介导的细胞毒性在很大程度上依赖于干扰素-γ和GzmB[17]。与CD 69一致，与PANC 28和CAPAN 2共培养后，NKG2D-CAR T细胞中IFN-γ和GzmB的表达明显高于Mock T细胞。Kd2-NKG2D-CAR T组与NKG2D-CAR T组和NC-NKG2D-CAR T组相比，IFN-γ和Gzm B水平明显升高(图1)。2D，e和补充图。1B，c)，但不是SW 1990(附图)。2B，c)。NKG2D-CAR T组与NC-NKG2D-CAR T组比较无显着性差异.

脱颗粒是T淋巴细胞溶解功能的指标，可通过检测CD107a[18]。与PANC 28和CAPAN 2共培养后，NKG2D-CAR T细胞中CD107a水平高于Mock T细胞。此外，CD107a在Kd2-NKG2D-CAR T组高于NKG2D-CAR T组和NC-NKG2D-CAR T组。2F和补充图。1D)，但不是SW 1990(附图)。二维空间)。NKG2D-CAR T组与NC-NKG2D-CAR T组比较无显着性差异.

4.1R基因敲除促进细胞增殖，减少NKG2D-CAR T细胞的耗竭

为了研究NKG2D-CAR T细胞和Kd2-NKG2D-CAR T细胞的功能，本研究检测了与PANC 28共培养后的增殖能力。Kd2-NKG2D-CAR T组增殖速度明显快于其他各组，Mock T组、NKG2D-CAR T组和NC-NKG2D-CAR T组之间差异无显着性(图1)。3A).

a用CFSE标记的模拟T、NKG2D-CAR T、NC-NKG2D-CAR T和Kd2-NKG2D-CAR T以1：5的比例与PANC 28共同孵育7d。用CFSE稀释法作为细胞增殖的衡量指标(左)，计算MFI(右)(n=3)。b, c模拟T、NKG2D-CAR T、NC-NKG2D-CAR T、Kd2-NKG2D-CAR T与PANC 28按1：5比例孵育3d。用抗CD3染色区分T细胞和靶细胞.流式细胞术(左)检测TIM-3和PD-1的表达.对MFI和百分比进行了统计分析，并显示在列图(中、右)中(n=3)。数据代表了三个独立的实验。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, NS not significant.

全尺寸图像

许多抑制性受体，包括pd-1和Tim-3在T淋巴细胞上表达，可能导致杀伤和分泌细胞因子的能力下降。19, 20]。与PANC 28共培养后，NKG2D-CAR T细胞中PD-1的表达较Mock T细胞显著增加，而Tim-3则无明显增加。有趣的是，Kd2-NKG2D-CAR T组与NKG2D-CAR T组和NC-NKG2D-CAR T组相比，PD-1和Tim-3的表达均较低.NKG2D-CAR T组与NC-NKG2D-CAR T组比较无显着性差异(图1)。3B，c).

4.1R通过ERK信号通路调节NKG2D-car T细胞

ERK是MAPK通路的成员，在4.1R中发挥着重要作用。−/−T细胞[15]。在本研究中，我们发现下调4.1R后，p-ERK的表达上调(见图)。4A)。为探讨4.1R是否通过激活ERK调节NKG2D-CAR T细胞功能，加入P-ERK抑制剂U 0126，结果显示P-ERK的表达受到抑制(补充图)。3)，从而抑制细胞毒性功能、细胞增殖和CD 69的表达(如图所示)。4B-d)。此外，干扰素-γ的生产(数据未显示)以及GzmB的生产(图)。4E阻断ERK信号通路后，CD107a表达被抑制(数据未显示)。相反，蒂姆-3的表达。4F)和PD-1(数据未显示)被上调对抑制剂的反应。结果表明，4.1R通过ERK信号通路介导NKG2D-CAR T细胞的功能。

a模拟T、NKG2D-car T、NC-NKG2D-car T、Kd2-NKG2D-car T与PANC 28以9：1的比例孵育16h，流式细胞仪(左)检测p-ERK的表达，并对p-ERK阳性T细胞的百分率进行统计学分析(右)(n=3)。b线状图显示NC-NKG2D-CAR T和Kd2-NKG2D-CAR T对PANC 28的细胞毒性作用不同。E:T)在10μM U 0126存在和不存在的情况下，比值为16h。cNC-NKG2D-CAR T和Kd2-NKG2D-CAR T与PANC 28共同孵育，作用于不同的效应物。E:T)在10μM U 0126不存在和存在的情况下，7天的比值。用CFSE稀释法作为细胞增殖的衡量指标(左)，计算MFI(右)(n=3)。NC-NKG2D-CAR T和Kd2-NKG2D-CAR T与PANC 28共同孵育，作用于不同的效应物。E:T)在10μM U 0126存在和不存在的情况下，比值为16h。CD 69表达d)，Gzm B(e)和Tim-3(f)流式细胞仪检测(左)。对MFI和百分比进行了统计分析，并显示在列图(中、右)中(n=3)。数据代表了三个独立的实验。**P < 0.01, ***P < 0.001, NS not significant.

全尺寸图像

4.1R沉默NKG2D-CAR T细胞在小鼠体内显示出更有效的抗肿瘤活性。

为评价NKG2D-CAR T细胞的体内治疗效果，采用稳定荧光素酶转染的PANC 28细胞，在NSG小鼠体内建立皮下移植瘤。10天后，随机分为5组，分别静脉注射磷酸盐缓冲液生理盐水(PBS)、模拟T细胞(Mock-T细胞)、NKG2D-CAR T细胞、NC-NKG2D-CAR T细胞和Kd2-NKG2D-CAR T细胞(图1)。5A)。生物发光显像显示NKG2D-CAR T组与PBS组和Mock T组相比，肿瘤消退持续。此外，Kd2-NKG2D-CAR T组与NKG2D-CAR T组和NC-NKG2D-CAR T组相比，肿瘤体积明显缩小，生存率明显提高。5B-d)。NKG2D-CAR T组小鼠体重低于PBS组和Mock T组，NKG2D-CAR T组与PBS组和Mock T组比较无显着性差异(图1)。5E)。为了量化人T细胞的持续输注量，我们采集了荷瘤小鼠的外周血.第一次注射CAR T细胞后28天，人CD3+Kd2-NKG2D-CAR T组T细胞计数及效应T细胞比率均高于其他各组(图1)。5F，g)。这些结果表明，4.1R缺失增强了NKG2D-CAR T细胞的体内抗肿瘤功能。

a一个完整的动物实验的示意图。b, cPANC 28/Luc细胞移植小鼠在指定时间点的肿瘤生物发光图像。d用Kaplan-Meier曲线观察小鼠的总体存活情况.e线条图显示了小鼠的体重。fCD3计数+用流式细胞术(左)检测外周血T细胞，并测定CD3的百分率。+计算T细胞(右)(n=3)。g流式细胞术检测NKG2D-CAR T细胞在外周循环中的亚群比例。数据代表了三个独立的实验。**P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, NS not significant.

全尺寸图像

胰腺癌已成为世界上最致命的肿瘤之一，其临床治疗主要是手术切除。然而，许多PC患者往往是在晚期确诊的，因此在适当的时间治疗是非常困难的。2, 3]。近年来，CART免疫疗法的出现为恶性肿瘤的治疗提供了一种很有前途的方法。虽然CAR T在B细胞恶性肿瘤中有较好的治疗效果，但许多因素制约了CAR T对实体瘤的治疗。6, 7].

“离体肿瘤，靶点”是CAR T细胞治疗实体瘤最显著的因素之一。21]。NKG2D是一种在T细胞和NK细胞上表达的激活受体，NKG2DLs在PC和其他肿瘤上的表达，免疫抑制细胞已被证实。22]。因此，针对NKG2DLs的NKG2D-car T细胞被设计用于消除各种肿瘤。23]。在此基础上，我们设计了第二代NKG2D-CAR T细胞来治疗PC.

为了进一步提高CAR T细胞的抗肿瘤活性，人们采取了一些提高CAR T细胞疗效的策略，如增强趋化因子受体的表达，或添加抗体阻断检查点受体。然而，这些策略似乎对PC肿瘤没有多大作用。24, 25]。因此，一些抑制基因在CAR T细胞中被敲除，以增强CAR T细胞的功能，如A2aR、ACAT 1和PD-1[26,27,28]。细胞骨架蛋白4.1R是4.1家族成员之一，具有抑制T细胞活性的作用。15]。本研究以NKG2D-CAR T细胞为研究对象，研究了4.1R基因敲除对NKG2D-CAR T细胞的影响。产生含有shRNAs的NKG2D-CAR T细胞，干扰4.1R的表达。如预期的那样，4.1R的减少导致NKG2D-CAR T细胞的细胞毒性增强。此外，介导T细胞毒性的IFN-γ和GzmB在Kd2-NKG2D-CAR T细胞中明显高于NKG2D-CAR T细胞和正常T细胞。Kd2-NKG2D-CAR T组CD 69和CD107a表达高于NKG2D-CAR T细胞和正常T细胞。肿瘤中T细胞的积累有助于抑制肿瘤的生长。29]。在此，我们验证了4.1R抑制对细胞增殖的影响，发现Kd2-NKG2D-CAR T细胞比NKG2D-CAR T细胞和对照T细胞的增殖速度快得多。TIM-3和Pd-1在T细胞上的高表达，提示T细胞处于衰竭状态，损害了T细胞抗肿瘤的功能。19, 20]。在我们的研究中，我们的数据显示，在Kd2-NKG2D-CAR T细胞中，Tim-3和PD-1的表达低于NKG2D-CAR T细胞和正常T细胞。此外，NKG2D-CAR T细胞在PC异种移植瘤模型中具有较强的抑瘤作用。结果表明，抑制4.1R可增强NKG2D-CAR T细胞的功能，为PC的临床治疗提供了一种潜在的治疗策略。此外，我们还发现4.1R通过ERK信号通路调节NKG2D-CAR T细胞的功能，从而揭示了4.1R沉默NKG2D-CAR T细胞的机制。

RNA干扰(RNAi)技术和CRISPR/Cas9技术都被广泛应用于抑制基因表达。30, 31]。RNAi被广泛用于通过瞬时表达小干扰RNA(SiRNA)或稳定表达短发夹RNA(ShRNA)来降低靶基因的表达。32]。近年来，CRISPR/Cas9技术已经成为一种强有力的方法，可以通过Cas9介导的DNA切割来敲除靶基因。33]。然而，与CRISPR/Cas9相比，shRNA更方便、更经济。本研究在一个载体上构建了shRNA和CAR，并通过共表达shRNA和CAR的慢病毒感染获得了具有4.1R基因敲除的CAR T细胞。

本研究表明，4.1R基因敲除可激活NKG2D-CAR T细胞，并通过ERK信号通路增加IFN-γ和Gzm B的释放，从而增强NKG2D-CAR T细胞抗胰腺癌的活性。此外，我们的发现也为改良CAR T细胞在临床治疗实体性恶性肿瘤方面提供了潜在的应用前景。