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Gsdmd和RIPK 3在Th17介导的自身免疫性关节炎维持IL-1β生成和慢性炎症中的作用

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发表时间:2021-09-22 09:53作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

程序性坏死,如坏死和下垂,是一种高度促炎细胞事件,与慢性炎症有关。虽然自身免疫性组织炎症和随后的细胞死亡过程中存在着多种导致自身免疫功能下降和坏死的触发因素,但这些程序是否在自身免疫性关节炎的发病机制中起着重要的作用,包括损伤相关分子模式和IL-1β等,在自身免疫性关节炎的发病机制中是否起着关键的作用,目前尚不清楚该程序是否在自身免疫性关节炎的发病机制中起着重要的作用。本文报道Gsdmd(Gsdmd)和受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶3(RIPK 3)在炎症滑膜组织中表达上调,但对IL-1β的产生和分泌IL-17 T助手(Th17)细胞介导的自身免疫性关节炎有一定的促进作用。格斯德−/−, RIPK 3−/−,或格斯德−/− RIPK 3−/−SKG小鼠表现为严重的关节炎,在引流的LNS和发炎的关节中有Th17细胞的膨胀,这与野生型SKG小鼠相当。尽管IL-1β分泌明显减少格斯德−/−RIPK 3−/−在没有Gsdmd或RIPK 3的情况下,炎症滑膜中IL-1β水平不受典型刺激的影响。我们的结果显示T细胞介导的自身免疫性关节炎的进展独立于下垂和坏死途径。

导言

与组织炎症相关的程序性坏死是在过去几十年中出现的一种细胞死亡的新概念。1。下垂和坏死这两种不同形式的程序性坏死,不仅在宿主防御感染性病原体中起着至关重要的作用。1,2,3,但在各种病理条件下也被强调。2,4。在肿瘤坏死因子信号传递后,炎症小体激活和细胞应激反应,即主要的致死性和坏死性途径被启动,最终导致大量的前炎症成分(包括IL-1、IL-18)和损伤相关的分子模式(DAMP)的释放,这些分子模式可以激发和增强免疫反应和组织炎症。1。GasderminD(Gsdmd)最近被确认为由炎症体和特定caspase激活介导的下垂和Gsdmd在其连接区的断裂,诱导其寡聚并形成细胞质膜上的孔,导致溶解细胞死亡。5,6。另一方面,受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸激酶3(Ripk 3)是一种特殊的死亡关键分子,可激活假激酶混合谱系激酶样蛋白,最终导致细胞死亡。7,8。最近的报告格斯德−/−RIPK 3−/−小鼠在非酒精性肝炎、家族性地中海热、实验性自身免疫性脑脊髓炎、青色性胰腺炎、缺血/再灌注损伤和肾移植等组织损伤和疾病模型中表现出重要作用。9,10,11,12,13,14。因此,程序性细胞死亡的异常激活加剧了与急性损伤和先天细胞激活相关的组织炎症。然而,程序坏死在类风湿关节炎(RA)等T细胞介导的自身免疫性疾病的发病机制中是否起着至关重要的作用尚不清楚。

RA是人类最常见的自身免疫性疾病之一,约占世界人口的1%,其特点是骨质破坏性慢性多发性关节炎。15。虽然RA的确切病理生理仍有待确定,但人们普遍认识到CD4+T助手(Th)细胞在RA的发病机制中起着重要的作用,这得到了越来越多的证据的支持,例如mhcⅡ类单倍型人白细胞抗原(Hdb 1)-DRb 1被认为是最强的疾病易感基因,细胞毒性T淋巴细胞抗原4(Ctla 4)-Ig阻断T细胞共刺激分子治疗RA具有很高的疗效。15,16,17。慢性滑膜炎可伴随增殖成纤维细胞样滑膜细胞(FLSS)的细胞死亡和免疫细胞的聚集,以及促炎细胞因子的产生和炎性细胞因子的释放,这可能是由于炎症关节(包括肿瘤坏死因子(TNF)和内源性炎性配体)中存在的各种触发因素所致的下垂和坏死。尽管人们认为这些事件会放大慢性炎症和关节病理。18目前尚不清楚一种程序性坏死是如何导致自身免疫性关节炎的。

作为RA的小鼠模型,SKG小鼠自发地发展成依赖细胞的T助手(Th17)细胞依赖性自身免疫性关节炎,类似于RA患者慢性滑膜炎症的免疫病理。19,20。我们先前已经证明,包括alarmin IL-33在内的阻尼,至少通过刺激组织内滑膜固有淋巴样细胞(ILCs),增加了SKG小鼠炎症关节的慢性炎症。21。效应细胞Th17与活化的FLSS和ILCs一起,通过分泌大量的促炎细胞因子(包括IL-6、IL-17、GM-CSF和TNF)参与了慢性关节炎的发生,而这些炎症细胞反应及其信号通路可能引发坏死。由于溶血性坏死可释放大量炎症介质,包括阻尼和IL-1β,可增强自身免疫性Th17效应功能和关节炎症。本研究以小鼠为模型,研究了程序性坏死是否参与了自身免疫性Th17细胞的分化、增殖和自身免疫性关节炎的发生。

结果

产生.格斯德 −/−SKG小鼠与CD4+在稳态状态下Peyer‘s斑块中的T细胞轮廓

为了探讨Gsdmd在自身免疫性关节炎发病中的作用,我们首先评估了格斯德在健康和关节炎小鼠滑膜组织中的表达。SKG小鼠关节炎诱导后格斯德在发炎的关节中有升高的倾向(如图所示)。1a)。我们接下来评估格斯德CD4表达+T细胞,CD11b+Ly6G+中性粒细胞CD11b+Ly6G-Ly6C炎性单核细胞与CD 45-CD 31-Podoplanin+FLSS是从炎症关节中分离出来的,每个关节都是能增强慢性关节炎症的关键细胞成分。表达格斯德中性粒细胞和单核细胞高于CD4。+T细胞和FLSS,表明这些髓样细胞中的Gsdmd可能与SKG关节炎的病理生理学有关(见图)。1b)。然后我们生成格斯德−/−用CRISPR/Cas9系统研究Gsdmd对BALB/c小鼠CD4分化和维持的影响+处于稳态和炎症状态的T细胞亚群(补充图。1a)。如先前在C57BL/6背景中所报告的那样5,10,11, 格斯德−/−SKG小鼠正常生长像野生型SKG小鼠,Gsdmd的缺失对它们的发育、寿命和生育能力没有影响(数据未显示)。通过体外转染骨髓来源树突状细胞(Bmdc),证实了上睑下垂中gsdmd功能的丧失。格斯德−/− 拉格2−/−与wt中bmdc相比,小鼠IL-1β释放能力明显降低。拉格2−/−老鼠(图1.1(C)如以前所报告的,使用其他格斯德−/−菌株5。探讨Gsdmd的生理表达水平是否对CD4有影响。+在稳态条件下,我们评估了格斯德在无特异性病原体(Spf)条件下的BALB/c小鼠正常组织中的表达,发现小肠是一个具有高表达量的器官。格斯德的表达与肠道微生物区系和细菌成分无关。格斯德无菌(GF)小鼠。1d)。因为各种各样的CD4+T细胞亚群位于小肠的Peyer‘s斑块中,我们检测了T细胞在Peyer’s斑块中Th1、Th17和调节性T(Treg)细胞的比例。格斯德−/−SKG小鼠在SPF条件下。格斯德−/−SKG小鼠表现出几乎相同的CD4+T细胞对IL-17、GM-CSF、IFN-γ和Foxp 3的表达与WT小鼠比较有显着性差异(图1)。1E、f)。这些结果表明,gsdmd对生理d4的分化和维持作用不大。+T细胞亚群处于稳态状态。

图1
figure1

这个格斯德组织及炎症细胞及CD4+T细胞的表达格斯德-/-SKG小鼠。(A)定量RT-PCR分析格斯德健康关节和炎症关节的整个滑膜组织(n=4)。(B)定量RT-PCR检测格斯德CD4 mRNA表达+T细胞,CD11b+Ly6G+中性粒细胞CD11b+Ly6G-Ly6C炎性单核细胞与CD 45-CD 31-Podoplanin+发炎关节FLS(n=4例)。(CPam3CSK4-启动的BMDC培养上清IL-1β浓度在LPS转染后16h开始(n=4)。(D)定量RT-PCR检测格斯德BALB/c小鼠在SPF或无菌条件下(n=4)。(E,F)IL-17A的流式细胞术。+,GM-CSF+、干扰素-γ+和Foxp 3+CD4细胞+T细胞在Peyer‘s斑块中的年龄匹配健康WT和格斯德−/−SKG小鼠(n=8只)。垂直条表示面板中的sd。(a-C、F)面板中的SEM(D). *P < 0.05. Data are pooled from two independent experiments in panels ((a-D)以及三个独立的面板实验(F).

Gsdmd可用于SKG关节炎的诱导和发展

我们在WT和格斯德−/−并对SKG小鼠的临床表型和T淋巴细胞的发育情况进行了评价。关节炎的严重程度在两组小鼠之间没有差别(图1)。2a)。值得注意的是,两组关节炎后滑膜IL-1β水平相当,提示IL-1β可通过Gsdmd非依赖性机制产生(图1)。2b)。然后我们评估了Gsdmd对CD4的影响。+诱导关节炎后T细胞形态改变。CD4中IFN-γ-、GM-CSF-、IL-17-和Foxp 3-表达的频率+发炎关节或引流淋巴结(LNS)的T细胞在两组间几乎没有变化(图1)。2c,D)。我们还评估了CD4过继转移引起的关节炎的发生和严重程度。+T细胞来自WT或格斯德−/−SKG小鼠拉格2−/−格斯德−/−拉格2−/−小鼠,这使我们能够剖析gsdmd在CD4中的特殊作用。+T细胞与非CD4细胞+受体小鼠的T细胞,分别(图1)。2e)。就像关节炎的表型格斯德−/−SKG小鼠关节炎的病情进展曲线与4组比较。此外,在Gsdmd缺乏的条件下,炎症关节和引流LNS细胞的分化和扩展不受影响(图1)。2F-H)。这些数据表明,Gsdmd在SKG小鼠体内诱导T_(17)细胞和慢性关节炎的过程中是可有可无的。

图2
figure2

Gsdmd在自身免疫性关节炎发病中的作用。(A)WT和格斯德−/−注射甘露聚糖(20 Mg)后,SKG小鼠8只(n=8)。(B炎症关节滑膜组织IL-1β浓度。(c、D)白细胞介素-17A的流式细胞术+,GM-CSF+、干扰素-γ+和Foxp 3+CD4细胞+T细胞在引流LNS和WT及炎关节中的作用格斯德−/−SKG小鼠注射甘露聚糖后10周,每只8只。(ECD4过继转移的实验设计+T细胞来自WT或格斯德−/−SKG小鼠拉格2−/−格斯德−/− 拉格2−/−老鼠。(F)四组(a-d)关节炎评分如下(E)(n=9-10个)。(G,H)IL-17A的流式细胞术。+,GM-CSF+、干扰素-γ+和Foxp 3+CD4细胞+细胞移植后12周,4组小鼠引流LNS和炎症关节中的T细胞(每组8~10只)。竖条表示面板中的SD(B,D)和扫描电镜(A,F)。面板中的水平线(h)表示平均值。*P < 0.05. Data are pooled from two independent experiments in panels (a、B、D、F、H).

产生.RIPK 3 −/−SKG小鼠与CD4+在稳态状态下Peyer‘s斑块中的T细胞轮廓

接下来,我们同样研究了ripk 3在CD4中的作用。+T细胞稳态与SKG关节炎模型。与上次报告一致22,表达RIPK 3炎症关节明显增加(图1)。3a)。我们进一步评估了RIPK 3CD4表达+T细胞,CD11b+Ly6G+中性粒细胞CD11b+Ly6G-Ly6C炎性单核细胞与CD 45-CD 31-Podoplanin+FLSS是从发炎的关节中分离出来的。RIPK 3SKG关节炎关节主要炎症细胞广泛表达,表达模式与Gsdmd不同。3b)。然后我们生成RIPK 3−/−SKG小鼠在BALB/c背景下应用CRISPR/Cas9系统检测RIPK 3对CD4分化和维持的影响+处于稳态和炎症状态的T细胞亚群(补充图。1b)。喜欢格斯德-/-SKG小鼠RIPK 3−/−SKG小鼠在发育和寿命方面没有明显的表型变化。我们通过培养BMDC证实了RIPK 3功能的丧失。RIPK 3−/− 拉格2−/−结果表明,与wt相比,脂多糖对小鼠IL-1β的产生有显著的降低作用。拉格2−/−老鼠(图1.3(C)如先前报告所述23。当生理RIPK 3观察SPF或GF条件下BALB/c小鼠正常组织中的表达水平。RIPK 3在肠道、LNS和脾脏中的表达相对较高(见图)。3d)。其中,表达RIPK 3在小肠中,由于其在GF小鼠中表达的特异性降低,很可能受到肠道微生物的控制(见图)。3d)。然而,我们发现在CD4中IL-17A,GM-csf,IFN-γ和Foxp 3的表达频率没有差异。+Peyer氏斑T细胞在WT和WT之间的分布RIPK 3−/−SKG小鼠3E、f)。综上所述,这些数据表明RIPK 3不影响生理CD4的分化或维持。+T细胞亚群处于稳态状态。

图3
figure3

这个RIPK 3组织及炎症细胞及CD4+T细胞的表达RIPK 3−/−SKG小鼠。(A)定量RT-PCR检测RIPK 3健康关节和炎症关节的整个滑膜组织(n=4)。(B)定量RT-PCR检测RIPK 3CD4 mRNA表达+T细胞,CD11b+Ly6G+中性粒细胞CD11b+Ly6G-Ly6C炎性单核细胞与CD 45-CD 31-Podoplanin+发炎关节FLS(n=4例)。(C)LPS刺激后16h BMDC培养上清液IL-1β浓度(n=4)。D)定量RT-PCR检测RIPK 3BALB/c小鼠在SPF或GF条件下(n=4)。(E,F)IL-17A的流式细胞术。+,GM-CSF+、干扰素-γ+(n=各3)和Foxp 3+CD4细胞(n=4)+T细胞在Peyer‘s斑块中的WT和RIPK 3−/−SKG小鼠。垂直条表示面板中的sd。(a-C、F)面板中的SEM(D). *P < 0.05. Data are pooled from two independent experiments in panels (A-D,F).

RIPK 3可用于SKG关节炎的诱导和发展

接下来我们研究了RIPK 3在SKG关节炎的诱导和发展中的作用。我们在WT和RIPK 3−/−SKG小鼠。两组小鼠临床关节炎评分无显着性差异(图二)。4a)。与体外检测不同,IL-1β可在炎症滑膜中分泌。RIPK 3−/−SKG小鼠4b)。CD4中IFN-γ-、GM-CSF-、IL-17-和Foxp 3-表达的频率+T细胞在炎症关节和引流的LNS之间几乎是相似的(图一)。4c,D)。此外,采用CD4进行过继转移实验。+T细胞来自WT或RIPK 3−/−SKG小鼠的临床关节炎评分和受血者抽干LNS和发炎关节中的Th17细胞比例也没有显着性差异。拉格2−/−RIPK 3−/−拉格2−/−小鼠,虽然在炎症关节中产生IFN-γ和GM-CSF的Th细胞的比例略有下降(图1)。4(e-H)综上所述,这些数据表明RIPK 3在SKG小鼠致病Th17细胞的诱导和慢性关节炎的发展中是可有可无的。

图4
figure4

RIPK 3在自身免疫性关节炎发病中的作用. (A)关节炎评分(n=9)和RIPK 3−/−注射甘露聚糖(20 Mg)后,SKG小鼠(n=8)。(B炎症关节滑膜组织IL-1β浓度。(c、D)白细胞介素-17A的流式细胞术+,GM-CSF+、干扰素-γ+和Foxp 3+CD4细胞+引流LNS的T细胞与WT的炎症关节(n=9)RIPK 3−/−SKG小鼠(n=8)注射甘露聚糖后10周。(E)CD4过继转移的实验设计+T细胞来自WT或RIPK 3−/−SKG小鼠拉格2−/−RIPK 3−/−拉格2−/−老鼠。(F)四组(a-d)关节炎评分如下(E)(n=9或13)。(G,H)IL-17A的流式细胞术。+,GM-CSF+、干扰素-γ+和Foxp 3+CD4细胞+4组小鼠移植细胞12周后引流LNS和炎症关节内的T细胞(n=9或13)。竖条表示面板中的SD(B,D)和扫描电镜(A,F)。面板中的水平线(h)表示平均值。*P < 0.05, **P < 0.01. Data are pooled from two independent experiments in panels (A,B,D,F,h).

Gsdmd和RIPK 3之间的串扰或代偿作用对于SKG关节炎的诱导和发展并不是必需的。

因为gsdmd和ripk 3之间的补偿作用和上下文相关的交互作用已经被描述过了。24,25,我们产生了格斯德−/− RIPK 3−/−SKG小鼠杂交法格斯德−/−SKG和RIPK 3−/−研究RIPK 3和Gsdmd是否能分别弥补自身免疫性关节炎的Gsdmd和RIPK 3缺陷,并评估其关节炎表型和Th17细胞的发育。格斯德RIPK 3双重缺陷条件。关节炎评分格斯德−/− RIPK 3−/−诱导关节炎后的SKG小鼠与WT组小鼠无明显差异(图1)。5a)。发炎关节及引流淋巴结中产生IFN-γ-、GM-CSF-和IL-17的Th亚群的分化和扩增格斯德−/− RIPK 3−/−SKG小鼠与WT SKG小鼠相似,但Foxp 3所占比例略有下降。+Treg细胞(图1.5b、c)。这些结果进一步强化了Gsdmd和RIPK 3及其相互作用对于SKG小鼠慢性自身免疫性关节炎的诱导和发展的概念。

图5
figure5

Gsdmd和RIPK 3的串扰在自身免疫性关节炎发生中的作用。(A)关节炎评分(n=9)和格斯德−/− RIPK 3−/−注射甘露聚糖(20 Mg)后,SKG小鼠10只(n=10)。(B,C)IL-17A的流式细胞术。+,GM-CSF+、干扰素-γ+和Foxp 3+CD4细胞+T细胞在引流LNS和WT的炎症关节中的作用(n=9)和格斯德−/− RIPK 3−/−SKG小鼠10只。竖条表示面板中的SD(C)和扫描电镜(A). **P < 0.01. Data are pooled from two independent experiments in panels (A,c).

讨论

虽然已积累的证据有力地证实,下垂和坏死已经进化来对抗感染诱导的细胞凋亡所引起的逃避检测的传染性病原体,特别是细胞内的细菌,如福氏志贺菌由程序性细胞死亡触发的急性组织炎症和促炎细胞因子的产生,可能通过各种炎症细胞的异常激活而介导免疫病理。1,2,3,4,9,10,11,12,13,14。值得注意的是,RIPK 3和MLKL-这两种分子专门参与了坏死-据报道在胶原诱导的关节炎滑膜炎中被上调,这表明身体下垂可能对严重滑膜炎的形成有一定的贡献。22。程序性坏死对T细胞介导的自身免疫性关节炎的作用尚不清楚。因此,我们在本研究中讨论的关键问题之一是,下垂和坏死途径是否会加剧慢性炎症,特别是无菌滑膜炎症。使用格斯德−/−, RIPK 3−/−,或格斯德−/− RIPK 3−/−小鼠,我们证明,尽管大量的细胞死亡在炎症关节,下垂和死亡是不需要的艺术性Th17细胞的扩张或发展的Th17介导的自身免疫性关节炎。

炎症介质,包括由下垂和坏死释放的炎性细胞因子,可以放大Th17功能,但它们对致病Th17细胞的调控似乎与炎症类型和靶器官有关。细胞死亡的溶解形式似乎增强了fmf模型的系统性自身炎症,以及缺血和移植模型中的急性组织损伤,其机制是通过过量产生IL-1β和DAMP,从而通过激活天然免疫细胞来介导病理。10,12,13,14。由于这些模型的发病机制对适应性T细胞功能的依赖性较小,因此,巨噬细胞和坏死细胞可能参与了急性炎症的加重,组织损伤往往通过天然免疫细胞和间充质细胞的激活而自动放大。另一方面,在T细胞介导的自身免疫病理中,下垂和坏死的作用在特定的炎症环境中可能是可有可无的或有限的。EAE是一种特殊的模型,依赖于Gsdmd来发展Th17介导的自身免疫性神经炎症。机械地说,周围髓样细胞的gsdmd依赖的上睑下垂是激活和分化周围淋巴组织中致病的Th细胞所必需的,而这些细胞又会迁移到靶脊髓,引起慢性组织炎症。11。虽然致病性Th17细胞主要驱动SKG关节炎和EAE,但Gsdmd在模型中的不同需求可能与这些疾病的诱导有关。对EAE来说,完全的弗氏佐剂和百日咳毒素作为一种强有力的细菌化合物,可能是炎症小体激活后髓样细胞内的一种较强的吞噬因子。相比之下,SKG小鼠是一种自发性关节炎模型,可通过注射甘露聚糖诱导,这是一种不同于EAE的真菌化合物,可能不参与下垂通路的激活。因此,外周LNS的T细胞启动可能是不同的,而Gsdmd并不是诱导LNS中艺术性Th17细胞的必要条件。然而,我们很容易推测,在EAE或SKG小鼠靶组织中持续产生IL-1β和Th17介导的慢性炎症,可能同样不依赖于下垂和坏死,尽管炎症组织中存在大量的细胞死亡。

不同形式的程序性细胞死亡之间的串扰,包括凋亡和坏死,最近被强调为不同程序的信号通路之间相互作用和补偿作用的一个新方面。24,25,26。虽然有多种触发因素(TNF、内源性炎症配体等)红肿关节上的下垂和坏死,我们的数据使用格斯德−/− RIPK 3−/−SKG小鼠明显排除了Gsdmd和RIPK 3在自身免疫性关节炎发展中的代偿作用,进一步强化了我们的说法,即他们不参与Th17细胞介导的慢性炎症。但是,考虑到IL-1β的生产能力格斯德−/−RIPK 3−/−小鼠及其在SKG关节炎中的重要作用27在无菌组织炎症(如滑膜和中枢神经系统)中可能存在未被重视的细胞机制,这些机制也能促进IL-1β的成熟和释放。28,29.

相反,考虑到格斯德−/−RIPK 3−/−Gsdmd或RIPK 3抑制剂可能是治疗天然免疫细胞介导的组织损伤和全身炎症的潜在治疗靶点,因为这些抑制剂在阻断生理功能和T细胞介导的免疫方面具有有限的副作用。我们需要进一步的研究,以研究未知的机制,通过这些未知的机制,程序性细胞死亡模式参与了促炎症介质的产生(E.g.,IL-1β),以及自身免疫性疾病中慢性组织炎症的放大作用.

材料和方法

小鼠

SKG和拉格2−/−以前曾描述过老鼠21. 格斯德−/−RIPK 3−/−用CRISPR/Cas9系统建立SKG小鼠模型。格斯德−/− 拉格2−/−, RIPK 3−/− 拉格2−/−,和格斯德−/− RIPK 3−/−SKG是通过杂交上述菌株而产生的。BALB/c小鼠在SPF和GF条件下从日本Clea购买。所有动物实验都得到了京都大学前沿生命和医学研究所伦理委员会和医学研究生院的批准,并按照机构和“抵达指南”进行。

诱导性关节炎

单次腹腔注射甘露聚糖(20 mg;Sigma-Aldrich)诱导小鼠关节炎,或通过skg CD4过继转移诱发关节炎。+T细胞(静脉注射)进入受体小鼠,并按前面所述进行评分。19,20,30。用于CD4的过继转移+T细胞,CD4+根据制造商的指示,采用MACS CD4微球和LS柱(Miltenyi Biotec)从脾脏和外周LNS中筛选出T细胞,2×10。6CD4+通过尾静脉将T细胞移植到每只受体小鼠体内。

滑膜组织单细胞悬液及流式细胞术

取滑膜组织切成小块,37°C下酶切1h,加入含2%FBS(GIBCO)的IMDM缓冲液3ml,加入300 U胶原酶I和Ⅳ胶原酶(Worthington)。然后将消化后的组织用70μm网格过滤器捣碎.用所得滑膜组织单细胞悬液进行流式细胞术和细胞分选实验。细胞内细胞因子染色用佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(50 ng/ml;Sigma-Aldrich)和离体霉素(500 ng/ml;Sigma-Aldrich)刺激2.5h,在5%FBS(GIBCO)、2-分光乙醇(GIBCO)、GlutaMAX(GIBCO)、丙酮酸钠(GIBCO)、MEMNEAA(GIBCO)和青霉素链霉素(Nacalai Tesque)存在下,再刺激细胞内细胞因子A(1μg/ml;默克)。然后用3.7%甲醛(Sigma-Aldrich)固定细胞,再用0.1%NP-40(Nacalai Tisque)渗透,用细胞因子抗体染色。按照制造商的指示,用Foxp 3/转录因子染色缓冲液集(EBioscience)对Foxp 3进行染色。抗小鼠CD4(RM4-4)、CD11b(M1/70)、CD 45.2(104)、Ly-6G(1A8)、podoplanin(8.1.1)、IL-17A(TC11-18H10.1)、GM-CSF(MP1-22E9)和IFN-γ(XMG1.2),均来自Biolegend、抗小鼠Ly-6C(AL-21)、CD 31(390)和PE-链亲和素,均来自BD生物科学,来自eBioscience的抗鼠Foxp 3(FJK-16s)。所有的FACS数据都用Flowjo软件程序(TreeStar,Inc.)进行了分析。

定量RT-PCR

用TRIzol(Invitrogen)提取组织和分类细胞的总RNA,用SuperScript Vilo(Invitrogen)反向转录。利用qPCR主混合(TOYOBO)或露娜通用qPCR主混合(NEB)和Taqman基因表达试验(Thermo Fisher:),将得到的cDNA应用于轻型自行车480(Roche)或应用生物系统StepOnePlus(应用生物系统)上的定量RT-PCR。Gsdmd,Mm 00509958_M1;RIPK 3M 00444947_M1;HPRT,Mm 03024075_m1)。目的基因表达正常化后的表达水平。HPRT作为一种家务事基因。

骨髓来源树突状细胞的产生

取股骨、胫骨骨髓细胞,红细胞裂解液(Sigma-Aldrich)溶解红细胞。培养细胞5×105在含10%FBS、2-巯基乙醇和青霉素-链霉素的RPMI中加入20 ng/ml GM-CSF,连续6天分化为BMDC。

BMDC和关节组织IL-1β的检测

在1×10的96孔板中培养BMDC。5用1μg/ml LPS(InvivoGen)处理细胞,或用1μg/ml Pam3CSK4(InvivoGen)处理1μg/ml Pam3CSK4(InvivoGen)后,用0.3%v/v FuGENE HD(Promega)转染1μg/ml LPS(InvivoGen),16h后用细胞计量学珠阵列(BD Biosciations)测定培养上清液中IL-1β浓度。滑膜中IL-1β的测定,取炎关节滑膜组织,切成小块,测量组织重量。将所得滑膜组织置入D-PBS(−)的5 0 0μl(Nacalai Tisque)中,然后进行旋涡离心。收集的上清液用细胞珠阵列测定IL-1β浓度,并根据单个样本的组织重量对结果进行归一化处理。

统计分析

使用GraphPad PRISM 7软件程序(GraphPad软件)进行统计分析。采用双尾t检验进行统计分析。采用双向方差分析和TUKEY多重比较检验对分组数据进行分析。数据显示为均值(SEM)的均值±标准差(SEM)或均值±标准差(SD)。P<0.05为统计学意义。


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