葡萄膜黑色素瘤肿瘤的单细胞转录景观
解决肿瘤内部的异质性，并深入了解肿瘤的演化过程，而这种情况不能通过大体积的肿瘤剖面来解决。20,21我们分析了来自6个不同预后类别的6例新摘除的UM标本中17,074个单个细胞的转录情况(图)。1B)。摘除后立即取出肿瘤标本，并将其送往GEP临床预后测试(DecisionDx)，将个别患者归入GEP预后级别。19。根据DecisionDx，6个肿瘤中有4个被归类为高风险GEP 2，其余2个被归类为低风险GEP 1(补充表)。1)。福尔马林固定，石蜡包埋的标本也被送往目标外显子测序使用msk-Impact平台。22(无花果)1B，补充表1)。用单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析新鲜肿瘤标本，从不富集特定细胞类型的去核标本中提取，以不带偏见的方式采集一片活的肿瘤及其微环境。库的大小、复杂性和生存能力指标都是高质量的(补充图)。1A-c)和基本一致的病人(补充图。1D，e)。所有scrna-seq数据都进行了合并和归一化，创建了一个全局细胞图谱，并进行了聚类。23其中27种细胞类型和状态跨越视网膜、免疫和癌细胞(附图)。1F，g)。视网膜和免疫细胞类型在患者之间具有高度的可重复性，而在肿瘤细胞群中则观察到患者特异性的细胞状态(补充图)。氢-j)。分析的大多数细胞是肿瘤细胞，表达的基因与黑色素细胞的来源一致(补充图)。1I)和显示显着的染色体拷贝数的改变，包括那些与UM(补充图)相关的。2A，b)。此外，我们还从一个由8个主要UM组成的独立队列中获得了单细胞rna测序数据，以验证关键的发现。24.
UM肿瘤的瘤内表型异质性
根据GEP 1和GEP 2基因的平均推测表达，将单个肿瘤细胞分为一个预后级，使用两组分贝叶斯高斯混合模型(补充图)。3A，b、方法)。值得注意的是，五个肿瘤含有不同程度上相似于两个预后级别的混合细胞(图)。1C, MSKCC)。同样，相同的分类器应用于八个初级UM的独立队列。24，还显示大多数原发性肿瘤(8例中有7例)含有不同程度相似于两种预后级别的肿瘤细胞混合物，即使在控制不同患者的取样差异时也是如此(图1)。1C、杜兰特等人著。24)。我们没有观察到两种不同的状态，而是在单个细胞的水平上检测到了一个从GEP 1到GEP 2样表型的连续体(图)。1D)。与之前描述的BAP 1损失和侵略性表型2,3,14,25,26,27,28,29,30,31，GEP 1到-GEP 2的跃迁与降低高度相关。BAP 1表达式(附图)3C)与单体3相关基因的表达特征。17(补充图。三维空间)。值得注意的是，在MSK数据集中，基于批量转录谱(DecisionDx)的GEP分类与scRNA-seq检测到的大多数GEP分类不一致(图1/6)。1C和补充表1)。一个肿瘤(MSK-UM06)根据大量的转录样本被归类为GEP 1，但通过单细胞分析却以GEP 2细胞为主(96.1%)。该患者在诊断后6个月内经历了转移进展，并死于疾病，符合大量侵袭性肿瘤细胞，并强调了肿瘤分层的局限性，其基础是一个固有异质性肿瘤的大量转录谱。
虽然GEP分类在临床上被广泛用于诊断目的，但它具有技术和生物学上的局限性。对TCGA葡萄膜黑色素瘤队列的详细分析(UM转录组、甲基体和基因组拷贝数数据的综合分析，n(80例患者)显示存在四种不同的UM分子生物学和预后亚群。2。同样，为了在这些分子不同的子集中评估肿瘤内的异质性，应用四分量贝叶斯高斯混合模型，根据特征基因的平均推测表达，概率地将单个肿瘤细胞分配给每个亚型(图1)。1E和补充图。3E，f、方法)。单个肿瘤细胞混杂地表达与多种TCGA亚型相关的标记物(补充图)。第三代)和几乎所有的肿瘤跨越这两个队列24当肿瘤细胞被指定为最大可能的亚型时，表现出明显的肿瘤内异质性(如图所示)。1E)。因此，无论如何定义风险水平，单个UM肿瘤都含有不同程度类似不同分子亚型的异质混合细胞。为了捕捉患者体内细胞状态的复杂性--不依赖于临床基因的表达特征--我们使用了一个表型体积度量。32在每个病人体内肿瘤细胞表达的所有可变基因中。值得注意的是，在本研究过程中，表现出肿瘤内表型复杂性最高水平的两名患者死于转移性疾病(如图所示)。1F)。这种肿瘤内异质性--不能通过大量测序来解决--暗示了UM进展的模式；根据这种模式，原发肿瘤内的细胞沿着从懒惰到更有侵略性的表型的进化连续体的不同阶段存在。
这种细胞状态多样性背后的意想不到的表型进展(如图所示)。1D)促使我们应用原型分析33肿瘤表型状态的无偏全基因组转录特征34。分析发现8种肿瘤细胞原型，它们被标记在附图中的力定向布局上。4A。当单个肿瘤细胞被分配到最近的原型(“方法”)时，每个患者都显示出多个表型状态的积累，这些状态定义了疾病的进展(补充图)。4B)。每个原型周围的细胞的局部邻域被用来描述在这些边界表型状态下差异表达的基因(补充图)。4C)。原型通过与炎症反应程序、非整倍体、染色质修饰和UM预后分类相关的关键通路的差异表达来区别。(补充图。4D)。总的来说，这表明这些过程可能是UM肿瘤从惰性向侵袭性表型演变的基础。
PRC 1活动的丧失定义了高风险的UM。
为了更好地理解UM单细胞异质性和肿瘤进展的分子基础，我们寻找了能重现其独特的生物学和预后分类的实验模型。为此，我们对五种不同遗传背景的UM细胞系进行了rna测序。35,36,37。根据80个特征基因的表达，细胞株明显地聚在一起，这些基因决定了tcga-um的四个主要亚型或定义了GEP预后组的12-基因模块。19 (补充图5A-C)。我们将位于基因表达谱相反端的细胞系分别命名为低风险和高危UM细胞，分别为92.1和MP38。2A和补充图。5A)。意料之中的是，高风险的umm细胞(Mp38)存在。BAP 1突变35，未检测到BAP 1蛋白。2B)。这与有报道显示BAP 1基因组丢失是侵袭性UM的一个决定性特征。1,2,3,14.
图2：PRC 1介导的转录抑制在高危UM中的丢失。a基于GEP 12-判别基因集归一化FPKM值的UM细胞株92.1和MP 38的无偏分层聚类19. bBAP 1和PRC 1核心连接酶RING 1和RNF 2与肌动蛋白在92.1和MP 38细胞中的Westernblot分析。代表生物三重链的数据。c泛素化H2A(绿色)和DAPI(蓝色)在MSK-UM03(队列中GEP 1肿瘤细胞所占比例最大)和MSK-UM01(GEP 2肿瘤细胞在队列中所占比例最大)中的免疫荧光。6个生物标本的代表性图像。d代表H2AK119Ub剪切和运行强度的热图在92.1和MP 38中标准化为IgG。代表生物重复的数据。eH2AK119Ub基因在单个肿瘤细胞中的表达1)从左到右按升序排列。对于每一种基因，所有细胞都进行了z归一化表达，并使用一个20细胞移动平均窗口进行平滑处理.顶部，填充区图显示GEP 2标记基因在排列的肿瘤细胞中的平均表达。fH2AK119Ub靶基因在4种分子TCGA亚型中的表达。单因素方差分析统计显着性；p=7.3×10−6; n=80。条形图，平均表达式的平均值；误差条，平均值的标准误差。g总体生存(n80)TCGA-UM患者原发肿瘤分层率高(前50%)，n=40)和低(下50百分位数)，n(40)H2AK119Ub靶基因的表达。统计显着性检验采用双面对数秩检验。
BAP 1在转录抑制组蛋白翻译后修饰(PTM)H2AK119Ub上水解monoubiquitin15,16,38,39。为了检测BAP 1丢失是否转化为还原性H2AK119Ub，我们进行了H2AK119Ub免疫荧光检测。令我们惊讶的是，高风险UM细胞的H2AK119Ub比低风险细胞低(补充图)。6a，b)。H2AK119Ub基因全基因组定位分析，靶下切割和核酸酶释放40，与免疫染色结果一致。高风险UM细胞MP 38在目标位点几乎完全丢失H2AK119Ub沉积，而低风险的UM细胞则为92.1(如图所示)。二维空间)。接下来，我们在患者样本中验证了这一发现，并发现具有主要低风险特征的患者(如MSK-UM03)的H2AK119Ub染色明显高于那些具有高风险基因表达谱的患者(例如，MSK-UM01)(见图)。2C).
H2AK119的泛素连接酶活性由PRC 1介导15,41。除了6个pcg无名指结构域蛋白(pcf 1-6)外，prc 1还含有一个保守的核心，包括一个ring(真正有趣的新基因1)或rff 2，它们都具有e3泛素连接酶活性。15。摘要PRC 1核心连接酶活性是实现靶基因转录抑制所必需的。41,42。与降低H2AK119Ub在高风险um，转录和蛋白水平的核心PRC 1连接酶，RING 1和RNF2，确实较低的MP38高风险UM细胞(补充图)。6C还有无花果。2B)。同样，在TCGA队列中，UM肿瘤BAP 1损失显著降低RING 1和RNF 2与完整肿瘤相比的表达水平BAP 1，分别(附图)。6d，e)。在所有PRC 1附件成分(PCGF 1-6)中，4种(PCGF 2、3、6和PCGF 4，又称BMI 1)在MP38细胞中的表达较92.1(补充图1)降低。6f)。此外，表达JARID 2，它是一种与H2AK119Ub结合的副蛋白，它与H2AK119Ub结合。43,44，与92.1相比，mp 38细胞和人肿瘤细胞的表达均降低。BAP 1损失(附图)6g，h)。与H2AK119Ub相似，全基因组定位分析显示PRC 1组分、RING 1、RNF2和BMI 1在MP 38中几乎丢失，而补充图92.1。7A)。相反，在赖氨酸27(H3K27me3)与三甲基化组蛋白3结合的基因组位点上，另一个转录抑制组蛋白PTM在92.1和MP38(补充图3)之间相似。7A)。总的来说，这意味着在高风险UM中广泛减少PRC 1成分。
与这些发现一致的是，JARID 2或RING 1MRNA与总生存期延长和转移风险降低显著相关(附图)。7b，c)。双管齐下JARID 2和RING 1位于染色体6p上，与先前观察到的在um中，6p增益与良好的预后有关。2,45,46。然后我们问是否低JARID 2和RING 1水平与6P增益无关，预后差。以6p增益为协变量，用Logistic回归分析评估JARID 2或RING 1与UM转移或死亡的关系。JARID 2生存率(OR，0.50；95%可信区间(CI)0.31~0.74)和转移率(OR，0.69；CI，0.50-0.91)呈负相关。同样，RING 1表达水平与生存率(OR，0.61；CI，0.37~0.89)和转移(OR，0.65；CI，0.43~0.89)呈负相关，提示JARID 2或RING 1与6P增益无关，预后良好。
然后我们询问PRC 1和H2AK119Ub的缺失是否转化为靶基因转录抑制的丧失。我们从UM细胞中H2AK119Ub的基因组峰中筛选出一个基因列表。H2AK119Ub目标)。这些基因在患者肿瘤细胞中高表达，GEP 2样特征增加(如图所示)。2E和补充图。7D)(MSKCC和Durante等人。24)，在4种分子TCGA亚型中表现出渐进的去抑制作用(如图所示)。2F)，并预测不良预后(图一。2G、TCGA)。我们询问了不包括H2AK119Ub目标的与H3K27me3结合的基因的表达水平，发现它们的水平在4种分子TCGA亚型中是相似的，并且与总体存活率无关(补充图)。7E，f)。这些结果表明，丢失H2AK119Ub和PRC 1介导的转录抑制是高风险UM的一个特征，尽管同时失去了BAP 1.
PRC 1抑制剂UM进展
为了确定rng 1介导的转录抑制是否是从低风险向高风险um转变的基础，我们使用了ring 1和rff 2连接酶的特异性抑制剂prt 4165(此后称为prt)，这是维持prc 1介导的靶基因抑制所必需的。41,42。PRT已被证明在治疗后1小时内可废除泛素化的H2AK119。47。PRT-治疗低风险的92.1UM细胞，治疗2h后H2AK119Ub水平降低到MP38细胞中的水平(补充图1)。8A-d)。另一方面，治疗已适应低基础活性的高风险MP38UM细胞对H2AK119Ub水平没有影响(补充图)。8a，b)。重要的是，PRC 1的抑制导致低风险UM细胞(92.1和Mel202)的转录发生了深刻的变化，而对高风险UM细胞(MP 41、MP 46和MP 38)的基因表达的影响却很小(见图41、MP46和MP 38)。3A)。此外，PRT处理导致转录上调GEP 2标志基因和下调GEP 1标志基因在24小时后，在低风险-但不是高风险-UM细胞(图一)。3B)。相反，使用临床分级抑制剂EPZ抑制H3K27甲基转移酶(EZH 2)，不会导致GEP 1/2信号的转录改变(补充图)。8E)。在低风险UM细胞中，PRT治疗后差异表达的大多数基因(80.8%)在基线时也有高风险和低风险UM细胞的差异表达(图一)。3C).
图3：PRC 1抑制引起的侵袭性UM表型的演变。a火山图显示在PRT治疗的基因差异表达的五个UM细胞系排名根据他们的GEP 1/GEP 2评分(见附图)。5A-C)。单个基因的折叠变化显示为具有重要意义的函数-log。10(罗斯福)。FDR值小于0.05，倍数变化大于或小于1的基因分别表现为绿色和红色。不符合显着性的基因(FDR>0.05)显示为灰色。每个细胞株均标注符合显着性的基因数目(FDR<0.05)。bGEP 1/GEP 2平均基因签名表达率(补充数据文件中注释的基因签名)1)在低风险UM细胞(92.1)和高风险UM细胞(MP38)中，在24 h DMSO或PRT-处理时，报告了从大量RNA-seq中获得的FPKM值(BAR，Means；圆圈，生物复制)。cPRT处理(RED)和高风险UM细胞(MP 38)和低风险UM细胞(92.1)(绿色)之间差异表达基因(DEG)的Venn图。dPRT(补充数据文件注释“PRT-geneset”)对PRC 1药理抑制的转录去抑制原理图1). ePRT基因集在单个肿瘤细胞中的表达按GEP 2基因标记的平均推测表达(补充数据文件中标注的基因签名)排列1)从左到右按升序排列。对于每一种基因，所有细胞都进行了z归一化表达，并使用一个20细胞移动平均窗口进行平滑处理.顶部，填充区图显示平均表达的GEP 2标志跨排名的肿瘤细胞。f平均基因表达上调在PRT-处理92.1细胞(‘PRT-geneset’)跨越4种分子TCGA亚型。单因素方差分析统计显着性；p=9.6×10−9; n=80。条形图，平均表达式的平均值；误差条，平均值的标准误差。g总体生存(n80)TCGA-UM患者原发肿瘤分层率高(前50%)，n=40)和低(下50百分位数)，n=40)“PRT-geneset”的平均表达。统计显着性检验采用双面对数秩检验。
同时，基因上调了PRC 1在低风险UM细胞中的药理抑制作用(折叠变化>1，Bonferroni<0.05)，PRT基因集“如图所示。三维空间)在患者肿瘤细胞中高表达，GEP 2样特征增高(图1)。3E和补充图。8F)。这些基因在4种分子TCGA亚型中表现出渐进的去抑制作用(如图所示)。3F)和预测不良预后(图一。第三代，强调失去PRC 1介导的转录抑制是高风险UM的一个特征。在定义GEP 2图谱的4个基因中，有两个，ECM 1和HTR2B，是PRT基因中差异表达最多的基因之一。n=28)(补充数据档案1).
除了转录改变，PRT治疗还导致了长期与高风险um肿瘤相关的深刻的形态学改变。10,11；主要是扩大的细胞核和上皮样形态(图。4A，b)。根据药物对低风险UM细胞的特异性，其特点是PRC 1活性升高，治疗高风险时，PRT不降低PRC 1的MP38细胞对细胞核大小和形态的影响(附图)。8g)。同样，PRC 1的抑制也损害了低风险的92.1细胞的生长，但不影响高风险的MP 38细胞的生长(补充图)。8H)。值得注意的是，经PRT处理的92.1细胞生长速度较慢，类似于高风险UM细胞，然而PRT处理的92.1细胞的增长率在PRT戒断后迅速反弹至基线(补充图1)。8I)。总的来说，这些结果表明，PRC 1活性的丧失使其从低风险向高风险UM转变，这与关键的遗传、表观遗传和细胞学特征有关。
图4：PRC 1抑制引起的形态学改变和核膨大。a长期DMSO和PRT治疗的低风险UM细胞(92.1)的亮场光镜观察面板.低危UM细胞(92.1)经PRT 48h后DAPI染色及DMSO处理。代表实验三体的图像。b小提琴图显示低风险UM细胞(92.1)核大小在PRT上的分布(n=152)和DMSO(n处理48 h。谱线区分四分位数范围；宽度反映观察到的原子核数。用双面非配对学生的统计显着性检验t测试，p=4.9 e−36。源数据作为源数据文件提供。
CIN和炎症信号在高危UM中的广泛应用
为了进一步探讨这一转变的分子基础，我们对DMSO和PRT处理的低风险UM细胞进行了基因集富集分析(GSEA)。除PRC 1靶基因外，PRT还能显著上调炎症相关通路，如NF-κB(标准化富集评分，2.8；FDRq<0.001)、IL6/STAT 3(NES，1.8；FDRq，0.02)和上皮间充质转换(EMT)(NES，2.0；FDRq，0.04)。相反，参与细胞周期和有丝分裂纺锤体组装的通路被下调(如图所示)。5A)。PRT治疗后差异表达的途径让人想起那些在高风险MP 38中富集的细胞，而低风险的92.1 uM细胞，后者表现出炎症和EMT相关基因的上调(补充图)。9A).
图5：PRC 1抑制引起的染色体分离误差增加。a火山图显示低风险UM细胞(92.1)在PRT与DMSO作用24小时后的差异表达途径；选定基因集的归一化富集分数(NES)显示为具有重要意义的函数，-log10(FDRq)；FDRq，Bonferroni更正p价值。补充数据文件中提供了所有重要基因签名的未过滤列表5. b后期UM细胞的DAPI(蓝色)和着丝粒(红色)染色的例子；显示不同的染色体分离错误模式。补充图显示了更多的偏析模式。9B。具有代表性的生物三叉戟图像。cPRT处理的低风险UM细胞(92.1)后期染色体分离错误模式的丰富程度与时间的关系。用双面非配对学生的统计显着性检验t测试一下。源数据作为源数据文件提供。dUM细胞系后期染色体分离错误模式的丰富程度，根据GEP 2评分从左向右排列。源数据作为源数据文件提供。eH2AK119Ub、SING 1、RING 1和RNF 2在RING 1和RNF 2基因敲除上对Mel285细胞肌动蛋白的Westernblot分析。代表生物三重链的数据。fRNF 2基因敲除后UM细胞(Mel285.Cas9)后期染色体分离错误模式的丰富度用双面非配对学生的统计显着性检验t测试一下。源数据作为源数据文件提供。堆叠条，每种错分模式的平均值；误差条，跨试验三重条的平均值的标准误差(C-f).
在高风险原发性UM中增加非整倍体2和增加炎症信号(图一。5A)我们在积极的UM以及其他研究中观察到2,25,26,48,49,50,51,52，我们着手确定PRC 1的变化是否可能改变基因组的稳定性。我们最近发现，染色体分离的错误--染色体不稳定(CIN)是癌细胞的一个决定性特征--会产生微核，一旦破裂，就会将其封闭的基因组双链dna(Dsdna)暴露在胞浆中。53,54,55,56。这导致cgas刺激的胞质dsdna信号通路异常激活，非典型的NF-κb激活介导的下游炎症信号通路，以及促进转移进程的emt和迁移通路的上调。56。我们推测PRC 1功能的丧失可能触发CIN，导致高风险UM的迁移增强和炎症信号特征。事实上，PRT-治疗低风险的92.1细胞导致有丝分裂染色体分离错误的频率增加，这可以从PRT处理的细胞中的落后染色体和无着丝点染色质片段的优势来证明(见图)。5B，c和补充图。9B)。重要的是，这些缺陷出现在24-48小时后药物治疗(图一)。5C)反对对有丝分裂纺锤体产生直接的短期效应，而倾向于转录反应。重要的是，与我们先前的观察显示PRT对具有完整PRC 1的UM细胞的特异性，PRT治疗高风险MP 38细胞对染色体分离错误没有任何影响(补充图)。9C)。相应地，染色体内禀分离率与GEP 2/GEP 1基因表达率相关(图1)。5D)。与PRC 1不同，抑制EZH 2--PRC 2复合物的核心催化组分--不会导致染色体分离缺陷的增加(补充图1)。9d)。然后，我们通过对PRC 1连接酶的基因操纵来补充这些药物调节。首先，我们在低风险葡萄膜黑色素瘤细胞株mel285中建立了crispr-Cas9基因敲除系统，该系统表达bap 1。57。RING 1或RNF 2基因敲除导致H2AK119Ub水平显著降低(图1)。5E)，核心PRC 1组分的丢失显著增加了后期观察到的染色体分离缺陷(图1)。5F).
为了检测有丝分裂过程中染色体偏析的增加是否导致微核的形成，我们评估了不同UM细胞株的微核率，发现微核率与染色体错配率相一致。高风险UM细胞的微核率明显高于低风险细胞(图1)。6A)。同样，PRT处理92.1细胞--但不是高风险的MP 38细胞--导致微核显著增加(图1)。6B，c和补充图。9E)，而EZH 2抑制剂对其形成无影响(补充图)。9F)。同样，RNF 2基因敲除导致微核率显著增加(图1)。6d)。重要的是，这些微核常常与cGAS共同定位。6E)，指示胞浆暴露于其封闭的基因组dsDNA和激活的胞浆dsDNA传感，cGAS-针刺途径。
图6：高危UM患者胞浆DNA暴露情况。aUM细胞系的基线微核率，根据GEP 2评分从左向右排列。BAR代表中位数；点，测量的微核频率每一个高功率场评估了三个实验副本。用双面学生进行统计学显着性检验t试验；p=2.8×10−8。源数据作为源数据文件提供。bPRT治疗后低风险UM细胞微核率(92.1)随时间的变化.为(a, b)，BAR代表中值；点，测量的微核频率每高功率场评估了三个实验副本。用双面学生进行统计学显着性检验t试验；p=7.7×10−8。源数据作为源数据文件提供。c低风险UM细胞(92.1)染色DAPI(白色)；显示增加的核大小和微核形成的PRT-处理。代表实验三体的图像。dRNF 2基因敲除UM细胞微核率(Mel285.Cas9)BAR代表中位数；点，测量的微核频率每一个高功率场评估了三个实验副本。用双面学生进行统计学显着性检验t试验；p=7.7×10−6。源数据作为源数据文件提供。eCGAS(绿色)定位于微核(蓝色)的一个例子。具有代表性的生物三联图像。
与这些发现相一致，RING 1或RNF 2基因敲除导致刺痛水平增加(图1)。5E)。我们还观察到CGAS刺痛(TMEM 173)CIN诱导的mRNA和下游炎症反应通路效应物，包括非典型NF-κB靶点在患者肿瘤细胞中的表达水平按GEP 2基因的平均表达特征排列(如图所示)。7A)。这些靶基因在CIN细胞的慢性叮咬激活反应中被上调。56。我们在一个独立的队列中验证了这些发现。24，我们同样观察到CGAS，TMEM 173和下游炎症相关的mRNA，包括非典型的NF-κB靶点，在高风险肿瘤细胞(补充图)。10A)。合得来，刺和CGAS基因拷贝数丢失的TCGA-UM肿瘤组织中mRNA表达水平增高BAP 1与BAP 1-完整肿瘤相比(补充图)。10b)。为了进一步验证这些发现在人类肿瘤样本，我们进行了免疫荧光成像的刺痛，并发现肿瘤细胞的内在刺痛在主要高危肿瘤(如MSK-UM01)的高表达，与主要低风险肿瘤(例如MSK-UM 03)相比，最小的刺痛表达主要局限于间质室(图1)。7b)。在TCGA队列中，TMEM 173表达有很高的预后，高刺痛水平预测转移和整体生存率降低(图一)。7C、TCGA)。所有这些结果表明，CIN诱导的细胞胞浆dsDNA信号下游的PRC 1丢失，是一个高风险UM的特点。
图7：高危UM患者的细胞内源性炎症。a关键胞浆核酸传感器、中间信号适配器、执行器、干扰素刺激基因(Isgs)和CIN诱导的非典型NF-kB靶标的表达(以红色显示)56所有患者肿瘤细胞按GEP 2基因标记的平均推测表达排列(补充数据文件中注释的基因签名)1)从左到右依次排列；基因使用欧几里德距离度量进行聚类。对于每一种基因，所有细胞都进行了z归一化表达，并使用一个20细胞移动平均窗口进行平滑处理.顶部，填充区图显示平均表达的GEP 2标志跨排名的肿瘤细胞。bSING(绿色)和DAPI(蓝色)在MSK-UM03(队列中GEP 1肿瘤细胞所占比例最大)和MSK-UM01(GEP 2肿瘤细胞在队列中所占比例最大)的免疫荧光。6个生物标本的代表性图像。c总生存率(左)和UM相关转移(右)n80)TCGA-UM患者原发性肿瘤的高表达(前50百分位数)，n=40)和低(下50百分位数)，n=40)刺。统计显着性检验采用双边对数秩检验；p(左)=2.2×10−5.
PRC 1的抑制促进CIN和针刺依赖性的迁移。
非典型NF-κB的慢性活化和cGAS刺激下游的炎症通路对CIN细胞的迁移和转移有促进作用。56。因此，我们询问PRC 1的丢失是否能促进下游CIN诱导的迁移表型。事实上，PRT-治疗促进了低风险UM细胞的迁移，但没有促进高风险UM细胞的迁移。8A和补充图。10C)。为了确定PRC 1抑制所诱导的迁移表型是否通过CIN和SINT介导，我们使用CIN和SINT的药物调节剂。CIN被非稳定的微微管结合物抑制，这是一种小分子，被认为是增强Mcak活性的一个小分子，它是一种激肽-13蛋白，其在着丝粒的微管失稳活性对于忠实的染色体分离至关重要。58,59,60。UMK 57完全挽救了PRT治疗92.1个低风险UM细胞时染色体分离的增加，并显著减少了它们的迁移(附图)。11A还有无花果。8A)。我们接下来使用的是H 151，它是一种小分子的针刺共价抑制剂，可以阻断它的激活诱导的棕榈酰化。61。H 151还可挽救低风险92.1细胞中PRC 1抑制所见的迁移表型(如图所示)。8B)，表明CIN和SING介导的迁移效应是PRC 1丢失的下游。这些药物治疗比DMSO对照组对迁移的抑制更大，我们认为这是由于低风险DMSO处理的92.1细胞基础分离率较低所致。
图8：PRC 1抑制促进CIN和针刺依赖性迁移。a创伤划痕试验评估低风险UM细胞(92.1)在DMSO、PRT、UMK 57(CIN抑制)或PRT和UMK 57处理后的迁移潜能。从三个实验复制得到的数据。数据点，平均值；误差条，平均值的标准误差。源数据作为源数据文件提供。b创伤划痕试验评估低风险UM细胞(92.1)在DMSO、PRT、H 151(针刺抑制)或PRT和H 151处理后的迁移潜能。从三个实验复制得到的数据。数据点，平均值；误差条，平均值的标准误差。源数据作为源数据文件提供。c报道PRT、CIN诱导或UMK 57处理48 h后，低风险UM细胞(92.1，蓝色)和高危UM细胞(MP38，RED)中GEP 1/GEP 2基因平均表达的比值；报道了从大量RNA-seq中获得的FPKM值(bar，平均值；BAR，标准差)。生物三胞胎。d所提出的模型原理图：PRC 1连接酶活性的丧失导致参与GEP 2表型的靶基因的转录去抑制；这同时促进细胞核的扩大和向上皮样表型的形态学改变，并通过CIN诱导的SING信号促进迁移。黄色显示的药物调节剂；(PRT，PRC 1抑制；UMK 57；CIN抑制；H 151，刺抑制)。CIN染色体不稳定。
最后，我们开始确定CIN对定义高风险UM的转录谱的相对贡献。我们通过一种有效的有丝分裂激酶mps1抑制剂，通过逆转治疗，对低风险的92.1细胞进行了cIN诱导和不诱导的rna测序。62在没有PRC 1抑制的情况下。药理学CIN诱导导致染色体错误分离和微核形成的预期增加(附图)。11A，b)，转录改变占PRC 1抑制差异表达基因的一半(50.4%)(补充图)。11C)，包括炎症和迁移途径的上调(附图)。第11d)。但对GEP预后基因的表达无影响(图一)。8C)。因此，在高风险MP 38细胞或经PRT处理的92.1细胞中，使用UMK 57抑制CIN没有改变GEP特异性基因表达特征，尽管会导致染色体分离和微核形成减少(图一)。8C和补充图。11A，b)。这些发现表明，PRC 1丢失引起的迁移表型是通过CIN介导的，而典型的GEP相关基因则可能受PRC 1的直接控制，与CIN无关(图1)。8D).
