风险状况和年龄组的定义 妇女被定义为高风险，如果她们有一个生殖细胞突变，大大增加了终生乳腺癌诊断的风险，包括 BRCA 1 , BRCA 2 和 PALB 2 (参考文献。 2 ,18 )。HR样本年龄分布在24~59岁之间，平均为45.5岁(中位数=48年；补充表) 1 )。如果女性没有携带易感基因突变，她们就被定义为AR。在本研究中，样本被指定为“年轻”，如果他们是从≤35岁的妇女收集的，如果他们是≥55岁的“年长”的，以及从36-54岁的妇女中被指定为“中年人”。
HR腔上皮细胞共表达KRT 14和KRT 19 正常乳腺组织取自接受乳房切除或预防性乳房切除的HR和AR妇女(补充表)。 1 )。KRT 14和KRT 19蛋白在AR中的表达 n =26，平均年龄=38.5岁，中位年龄=39岁)和人力资源( n 2 3岁，平均年龄4 5.5岁，中位年龄4 8岁)组织切片和RNA在上皮细胞中的表达。在AR年轻妇女组织切片中，管腔上皮细胞(LEPs)表达KRT 19，肌上皮细胞(MEPs)表达KRT 14，尽管在不同年龄存在一些异质性(图1)。 1A )。然而，在老年AR妇女中，LEPs得到了KRT 14的表达，这与我们先前的研究结果一致。 6 ,7 (无花果) 1B )。有代表性的组织切片图像显示在人力资源载体上。 BRCA 2 (无花果) 1C ), BRCA 1 (无花果) 1D ), BRCA 1 和 BRCA 2 (无花果) 1E )，以及 PALB 2 突变(图1. 1F )，所有这些都在KRT 19中表达了KRT 14。 + LEPs。我们开发了一种图像分析管道来量化与KRT 14和KRT 19对应的荧光信号在原组织切片免疫荧光图像中上皮细胞中的表达。 1g )。在HR上皮中( n =23)，占19克朗的31% + LEPs也表达KRT 14，而在AR中只有7%的LEPs(Mann-Whitney)。 U -测试， P < 0.0001; Fig. 氢 )。较年轻(<35岁)AR( n =11)上皮细胞的KRT 14显著减少。 + LEPs较旧的AR( n (5)或任何年龄的HR上皮细胞，而老年AR组织与任何年龄的HR组织之间无差异(图5)。 1I )。表达 KRT 14 在较老的AR LEPs中，信使RNA显著升高(P<0.05)。 n =14)与较年轻的( n =17)及中年( n =7)AR LEPs，但与HR样本没有差别( n =13)(图1。 1J )。HR LEPs有更多 KRT 14 MRNA与更年轻的AR LEPs比较(见图)。 1J )。表达 KRT 19 在HR LEPs中的mRNA( n =13)与较旧的AR LEPs并无分别( n =14)但显著低于中、年轻的AR LEPs( n =7)(图1。 1K )。瀑布图显示了KRT 19中KRT 14高表达的总体趋势。 + HR乳腺组织中的LEPs对每种突变、年龄组和组织类型进行了定位(图一)。 1L )。在我们的样本中，有生殖细胞的女性 BRCA 1 穆特 相对于其他突变载体，KRT 14在LEPs中的表达最高(图1)。 1L )。增加的KRT 14所占比例 + HR组织中的LEPs与年龄无关(Spearman‘s) ρ =0.047， P 在AR组织中，这种增加与年龄有关(Spearman‘s) ρ =0.37， P =0.0334)。
图1：HR LEPs与KRT 19共同表达，类似于老化的LEPs。 a –f ，一位32岁的AR女性乳腺导管的免疫荧光图像，染色为KRT 19(绿色)和KRT 14(红色)。 a )，一名62岁的AR妇女( b )，一个33岁的女人窝藏着 BRCA 2 突变( BRCA 2 穆特 c )，一个24岁的女人 BRCA 1 穆特 d )，一个31岁的女人窝藏着 BRCA 1 和 BRCA 2 突变( e )和一个52岁的女人 PALB 2 穆特 f )。标尺，50μm。 g ，一种用于免疫荧光图像量化和分析的方法的原理图。 h ，KRT 19所占百分比的点状图 + 在HR中表达KRT 14的LEPs( n =23)和AR( n =26)样本。这个 P 值是使用双边Mann-Whitney计算的。 U -测试。 i ，KRT 19所占百分比的点状图 + 在HR中表达KRT 14的LEPs( n =23岁，AR年轻(≤35岁， n =11岁(>55岁)和AR(>55岁)， n (5)菌株。这个 P 数值采用单因素方差分析(ANOVA)计算，并采用Tukey的后特别检验进行多次比较. j ,k ，原木 2 (表达) KRT 14 (j )和 KRT 19 (k )第4代LEPs中的mRNA。方框的轮廓代表第一和第三四分位数。盒子内的垂直线代表中值，晶须从每个四分位数到最小值和最大值。这个 P 数值计算采用Welch‘s ANOVA检验，并与Dunnett的T3后特别检验进行多次比较。 l ，KRT 19所占百分比的瀑布地块 + 在HR和AR菌株中表达KRT 14的LEPs定位于突变、年龄和组织类型。年龄组为：青年35岁，≤35岁，中年>35岁，≤55岁，老年>55岁。 m 、KRT 14所占百分比的点状图 + 在HR和AR标本中表达KRT 19荧光信号的MEPs。 n ，KRT 19所占百分比的点状图 + LEPS和KRT 14 + 免疫荧光法检测HR和AR标本中表达KRT 14和KRT 19的MEPs。在……里面 m 和 n ， P 值是使用双边Mann-Whitney计算的。 U -测试。 o ，KRT 19所占百分比的瀑布地块 + 在所有HR株、所有AR株和乳腺癌前及恶性病变组织切片中表达KRT 14的LEPs。这个 P 数值计算采用Kruskal-Wallis检验，调整后用邓恩的后特别检验进行多次比较。在……里面 l 和 o ，条的边缘代表手段，错误条代表S.E.M。灰点 l 表示每个应变所拍摄的每幅图像的数据。灰点 o 表示所列组中每个应变/样本的平均图像。每个个体至少有两个切片进行染色和分析，结果相似。代表每一组别的不同人士数目如下：a , 11; b 5； c 5； d ，9； e 两个； f 三个。
由于怀孕对乳腺癌的风险有不同的影响，这取决于第一次怀孕时个人的年龄和最后一次分娩的时间。19 ,20 ,21 我们评估了分娩和妊娠状态，以及自上次分娩以来的时间(如果有的话)与KRT 14在LEPs的变化。LEPs家系忠诚度的丧失与分娩状态无关，因为自上次出生以来的平均胎次、妊娠率和出生时间在危险组之间没有差异，并且与LEPs中KRT 14表达增加无关(扩展数据图，图1)。 1 ).
为了评估MEPs中的谱系忠诚度损失，我们检测了MEPs中KRT 14和KRT 19的表达。KRT 14 + HR上皮内MEPs占18%( n 也表示KRT 19，表明MEPs中的谱系忠诚度下降(图1)。 1M )。谱系保真度下降似乎是HR上皮的特征之一，在所有上皮细胞(LEPs和MEPs)中，11%的HR上皮细胞表达两种角蛋白染色，而AR上皮细胞中有3%的细胞表达染色。 n =26)(Mann-Whitney) U -测试， P < 0.0001; Fig. 1N ).
接下来我们检测kt 14在kt 19中的表达频率。 + 乳腺良恶性病变中的细胞，如导管原位癌(DCIS)； n 5)浸润性导管癌(IDC)； n =6)。DCIS患者年龄为21~54岁(中位数=37岁)，IDC患者年龄为34~51岁(中位数=47岁)。在IDC，几乎50%的KRT 19 + 细胞也表达KRT 14，而KRT 19的表达率为31%。 + HR上皮细胞中的LEPs及KRT 19的7% + AR上皮细胞中的LEPs(Kruskal-Wallis试验， P < 0.0001; Fig. 十度 )。占KRT 19的比例 + DCIS病变组织中表达KRT 14的细胞明显高于AR组织，但无显着性差异(图5)。 十度 )。总之，携带癌症易感突变的妇女的HR乳腺上皮细胞在LEPs中的KRT 14表达水平显著高于AR，这在老年妇女和乳腺癌妇女中都有观察到。
HR上皮中大量的腔细胞 我们接下来确定HR和AR人乳腺上皮细胞(HMECs)中LEPs和MEPs的比例是否不同。采用流式细胞仪检测MEP标记物CD 271(神经生长因子受体)和LEP标记CD 227(sialomucin 1，MUC 1)在年龄相配的AR细胞上的相对表达。 n =17岁以下、9岁中年人和10岁以上)和人力资源( n =15)妇女。Ar年轻菌株从0.2%到12%LEPs(中位数=2.5%)，在老菌株中增加到9-39%(中位数=15.3%；Kruskal-Wallis试验， P =0.0008)，与我们以前的调查结果一致 6 ,7 (无花果) 2A，e )。我们观察到HR菌株之间的异质性：15株中有4株的LEPs小于5%(扩展数据图)。 2 )，但在15株(73%)HR菌株中，有11株(73%)的LEPs比例明显高于我们根据年龄预测的比例(范围=0.1-90%，中位数=33%；图1)。 2B，e )。LEP膨胀的最深刻的例子是在一个胚芽线上。 PALB 2 穆特 达到91%LEPS的载流子(图1)。 2C )。含有细菌的HMECs BRCA 1 穆特 LEP种群在1%到60%之间(中位数=41.7%)。 2B )；在HMECs中有一个种系。 BRCA 2 穆特 LEPs在3%到28%之间(中位数=4.9%)。 二维空间 以及扩展数据图。 2 )。免疫荧光法检测培养的HMECs中KRT 14和KRT 19的表达。年轻的AR HMECs中的LEPs和MEP以相互排斥的方式表达KRT 19和KRT 14(例如，见图1)。 2F )，而在HR和较老的AR HMECs中，KRT 19 + LEPs也表达了KRT 14(见图14)。 2G-j )。HRHMECs表现出更大比例的LEPs，甚至在年轻时也有KRT 14表达增加。
图2：HR培养的乳腺上皮细胞呈基本表型的腔内扩张。 a –d 流式细胞术检测一例AR 19岁妇女和一例AR 66岁妇女CD 271和MUC 1表达。 a )、不同年龄(31、35、40和53岁)的人力资源妇女窝藏 BRCA 1 突变( b )，一位52岁的人力资源部女性窝藏着 PALB 2 突变( PALB 2 穆特 c )和一个33岁的人事部门妇女窝藏着 BRCA 2 穆特 d ). e 从AR年轻妇女(≤35岁)获得的第4代上皮株的LEP群体所占百分比的点图。 n 17岁，AR中年妇女(36至55岁， n =9岁，老年妇女(>55岁， n =10)和人力资源妇女( n =15)。每个样本的中位数用一条水平线表示。这个 P 数值计算采用Kruskal-Wallis检验，调整后与邓恩的后特别试验进行多次比较。 f –j 第4代培养的上皮细胞免疫荧光染色检测一例AR 19岁妇女的KRT 19(绿色)、KRT 14(红色)和Hoechst(蓝色)。 f )，一名66岁的妇女( g )，一位24岁的人力资源部女性窝藏着 BRCA 1 穆特 h )，一位33岁的人力资源部女性窝藏着 BRCA 2 穆特 i )和一个52岁的女人 PALB 2 穆特 j )。每个面板右侧的图像是由合并图像中的白色矩形所勾画的区域的放大。标尺，50μ米。 f –j 分别重复三次，结果相似。
HR祖细胞有分化缺陷和基本偏见。 为了研究HR上皮的上皮祖细胞是否存在分化偏向，我们对FACS富集的受体酪氨酸激酶cKit(CD 117)表达细胞进行了克隆分化试验。高表达ckit的乳腺上皮细胞具有多系分化能力，但存在腔内偏见。 7 ,22 。FACS富集后，cKit + 在克隆密度条件下，细胞贴附盖膜，2d或7d后用免疫荧光法检测细胞的分化标志KRT 14和KRT 19。基于标记的分水岭分割在图像中鉴定单个细胞，然后测定与KRT 14或KRT 19表达相对应的平均荧光信号。CKit祖细胞的未分化状态由两种遗传标记的低水平双重表达来描述，通常导致细胞出现在点或等高线图的左下角，显示KRT强度。来自AR的ckit富集细胞( n =5)和人力资源( n =18：8 BRCA 1 穆特 六号 BRCA 2 穆特 四 PALB 2 穆特 )细胞检查。 3A-d 以及扩展数据图。 3A-f )。的平均年龄 BRCA 1 穆特 平均年龄为39.6岁(中位数=36岁)。 BRCA 2 穆特 是52岁(中位数=52岁)和平均年龄 PALB 2 穆特 平均54.5年(中位数=54.5年)。年轻AR ckit + 细胞导致KRT 19的不同种群。 + 或KRT 14 + 细胞培养2d后(见图)。 3A，e 以及扩展数据图。 3A )。较老的AR细胞有基本的分化偏向；大多数后代表达一些krt 14；AR株的年龄依赖性分化分布复制了我们先前的研究结果。 7 (无花果。 3B，f )。HR cKit后代的分布 + 2d后的祖细胞与AR cKit的祖细胞有显着性差异。 + 祖细胞(χ) 2 测试， P < 0.0001); almost 50% of HR cKit+ 与29%的AR cKit相比，细胞仍未分化。 + 单元(扩展数据图。 3A，b )。这种未区分状态是ckit的显著特征。 + 细胞 BRCA 1 突变(图1. 3C，g 以及扩展数据图。 4A，c )。CKIT后代 + 细胞 BRCA 2 突变分化有一个基本的偏见，也就是说，他们都表达了一些kRT 14，但明显地有更多的krt 19的表达。 BRCA 1 穆特 载体(图1. 3D，h )。从质量上讲， BRCA 2 穆特 表型与AR旧的ckit有更大的相似之处。 + 细胞。Ckit + 含有已知致病物质的细胞 PALB 2 变异体未能区分(图1)。 3I )，但作为 PALB 2 未知意义变异体(Vus)具有类似AR年轻细胞的分化模式，其后代表现出相互排斥的kt 19群体。 + 和KRT 14 + 细胞(图1. 3J 以及扩展数据图。 4B ).
图3：HR乳腺上皮祖细胞表现出分化缺陷和基础分化偏向。 a –d ，免疫荧光图像的cKit富集细胞染色KRT 19(绿色)和KRT 14(红色)，固定在2天的培养，从一个年轻的AR妇女。 a )，一位年长的妇女( b )，一位35岁的人力资源部女性窝藏着 BRCA 1 突变( BRCA 1 穆特 c )和一名44岁的人力资源部妇女窝藏着 BRCA 2 穆特 d )。标尺，50μm。 e –j 、KRT 14和KRT 19的密度等高线图，将AR年轻妇女培养2d后固定的cKit富集细胞中的平均荧光强度信号( e )、老年妇女( f )和携带生殖细胞突变的HR妇女 BRCA 1 (g ), BRCA 2 (h ), PALB 2 (i )和 PALB 2 (Vus)+ APC (Vus)( j )。实验 a –d 分别重复三次，结果相似。拥有ckit的个人数量+ 来自于对每一组的代表，具体如下： a 三个； b 两个； c 8只； d 六号。
7天后，HR ckit + 细胞产生了51%的KRT 14后代。 + 相对于34%的AR ckit + 细胞后代(χ) 2 测试， P < 0.0001) (Extended Data Fig. 3C-f ,我-我 )。HR cKit的分化模式 + 第7天后，按突变分类的细胞在扩展的数据图中显示。 3i-k 和 4D 。Ckit富集细胞 BRCA 1 和 BRCA 2 突变主要分化为KRT 14 + 细胞。Ckit富集细胞 PALB 2 即使在第7天，突变也无法区分(扩展数据图)。 3K )。然而，ckit + 细胞内有 PALB 2 (Vus)的分布更接近AR年轻ckit的特征。 + 单元(扩展数据图。 3L ).
CKIT后代 + 来源于HR上皮的祖细胞表现出一种基础分化偏向的模式，似乎与特定的生殖细胞突变无关。然而， BRCA 2 穆特 后代最终产生了KRT 14。 + 也表达KRT 19的后代，而 PALB 2 穆特 载体在分化过程中表现出明显的延迟；在本实验中，大多数细胞作为角蛋白双阳性细胞滞留了很长一段时间。
高危上皮细胞与衰老、炎症和癌症基因的关系 接下来我们比较了从HR女性中分离到的LEPs和MEPs的转录序列( n =11；6 BRCA 1 穆特 ，三 BRCA 2 穆特 和两个 PALB 2 穆特 )和年龄匹配的LEPs和MEP从AR妇女中分离出来( n =9)。总共有336个基因在HR LEPs和AR LEPs之间有差异表达(212个上调，124个下调；调整后)。 P -值截止<0.05；图1。 4A 和补充表 2 )。利用分子标记数据库(MSigDB)，对EMT和炎症的标志基因集进行了富集，其中包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因集通过核因子κ-活化B细胞轻链增强子(NF-κB)、白细胞介素-6-JAK-STAT 3和干扰素-γ信号转导(假发现率)<0.0 5； 4B )。我们接下来评估AR上皮中年龄依赖性基因表达的变化是否也是HR上皮的一个特征。我们将上述HR转录组数据集与AR、LEPs和从年轻公司分离出来的MEP数据进行合并( n =16岁及以上( n 减少乳腺增生症：HR和AR年轻LEPs之间的DE基因中共有452个基因，AR年龄大的LEPs和AR年轻的LEPs之间存在相同的方向，表明这些基因是共同的危险基因，无论是由于衰老还是潜在的遗传风险(图1)。 4C 和补充表 3 )。基因本体论(GO)术语被这些常见的危险基因过度表达，包括老化和蛋白质加工术语(图一)。 4D )。为了研究人力资源组内部的潜在差异，我们从以下几个方面对LEPs进行了DE分析。 BRCA 1 穆特 和 BRCA 2 穆特 航母。 BRCA 1 穆特 MSigdb标记基因集的emt，补体，凝血，血管生成，干扰素-α和-γ反应。 BRCA 2 穆特 LEPs在MYC靶区、版本1和2、E2F靶标和哺乳动物雷帕霉素复合物1(MTORC 1)信号传导靶点(图1)的标记基因集上富集。 4E )。这些数据提供了证据，表明AR、老年妇女和HR妇女在LEPs中都有共同的基因表达，这些基因携带生殖细胞突变，增加了他们在任何年龄患乳腺癌的风险。
图4：HR LEPs的转录序列类似于老化的LEPs，并映射到炎症和与癌症相关的通路. a 、HR中DE基因的Volcano图与AR LEPs的比较。 b ，MSigDB标记基因集在HR LEPs中富集，与AR LEPs相比。转化生长因子-β，转化生长因子-β。 c 比较三组DE基因的Venn图：HR与AR年轻(≤35岁)、HR与AR年龄大于55岁(>55岁)和AR年龄对AR年轻LEPs。 d ，GO术语在HR和AR的早期LEPs中都被上调，在共同的基因中被过度表达。圆圈的大小反映了每个术语的基因数目。 P 调整一下。 是调整后的 P 值用于多个比较。 e ，MSigDB标记基因集富集于含有LEPs的 BRCA 1 对决 BRCA 2 突变。 f ,g 、几种比较之间重叠的基因矩阵。矩阵中的数字表示 P 值；颜色梯度是日志。 2 (或)重叠。这个 P 对每对基因列表，采用Fischer‘s精确测试，对每对基因列表进行单边比较(Alternative=更大)。L.HR.v.AR，与AR LEPs相比，HR LEPs中的基因上调；L.HR.v.AR.Y，HR LEPs中上调的基因与AR年轻LEPs(≤35岁)相比；L.BRCA1.v.non-.RM，携带LEPs的基因上调 BRCA 1 与不携带从减少乳腺增生症中收集到的任何突变的AR LEPs相比；L.BRCA2.v.non-.RM，在含有LEPs的LEPs中上调的基因 BRCA 2 与不含任何减少性乳腺增生症突变的AR LEPs相比，HR.v.AR.Y，HR MEPs中的基因比AR年轻的MEPs(≤35岁)高。
我们接下来要研究的是，年龄依赖性和世系特异性基因标记是否与HR上皮细胞中富集的基因集重叠。基因重叠用优势比分析(OR)评估，值<1表示两个基因集之间没有重叠，值>1表示强重叠。 23 。MEP-特异性基因(补充表) 4 )与HR LEPs中上调的基因重叠，与年龄匹配的AR LEPs相比，OR值为7.7( P < 0.0001), and with genes upregulated in HR LEps compared with AR younger LEps with an OR of 27.3 (P < 0.0001) (Fig. 4F 和补充表 5 )。这也得到了基因的响应。 BRCA 1 穆特 LEPS和 BRCA 2 穆特 LEPs与来自还原性乳突的AR LEPs的比较(如图所示)。 4F )。这表明HR LEPs表达MEP/基础家系的基因，提示谱系保真度的丧失。HR LEPs中上调的基因与MSigDB衰老标志基因重叠，OR为4.1( P =0.016；图1。 4G )。此外，我们还通过选择在较老的LEPs中上调的基因与较年轻的LEPs(benamini-hochberg调整后的基因)，在LEPs中建立了一个老化特征。 P < 0.05; Supplementary Table 6 )。我们同样在MEPs(补充表)中建立了一个老化签名。 7 )。HR LEPs中上调的基因与衰老的LEP基因信号重叠，OR为20( P < 0.0001; Fig. 4G 和补充表 8 )。这表明HRLEPs具有加速衰老和丰富已知参与乳腺癌和炎症的基因通路的转录特征。
在MEPs中，HR细胞中有346个基因与AR细胞相比较(250个上调，96个下调)。 5A 和补充表 9 )。MSigDB标记基因具有炎症性(例如，TNF-α信号和干扰素-γ反应)和促进侵袭性生物学(例如，KRAS信号；图1)，HR MEPs被丰富。 5B )。在HR MEPs中过度表达的KEGG通路除了胰岛素抵抗外，还包括影响细胞外通讯的途径，如紧密连接和细胞因子(图1)。 5C )。HR MEPs与AR老年MEPs之间仅有72个基因DE(图1)。 5D 和补充表 10 )，表明它们在转录过程中有相似之处。HR MEPs中上调的基因与年龄匹配的AR MEPs和AR年轻MEPs与LEP特异性基因重叠(补充表) 11 )，分别为25和12.3( P < 0.0001 for both; Fig. 5E 和补充表 12 )。这表明HR MEPs在其转录序列中对某些LEP特异性基因进行了富集，这与谱系保真度的丧失是一致的。HR MEPs中上调的基因也与MSigDB衰老标志基因重叠，OR为3.3( P =0.063；图1。 4G 和补充表 8 )。我们建立的MEPs老化特征与HR MEPs中上调的基因重叠，OR为60( P < 0.0001; Fig. 4G 和补充表 8 )。总之，HR上皮的转录序列在炎症和促癌途径中富集，并与衰老和衰老标志基因重叠。HR、LEPs和MEPs对具有相反上皮系特征的基因集有一定的富集作用，提示谱系忠诚缺失是HR上皮和老年上皮共同的特性。
图5：HR MEPs的转录序列类似于老年MEPs，并映射到炎症和与癌症相关的通路. a 、HR中DE基因的Volcano图与AR MEPs的比较。 b ，MSigDB标记基因集在HR MEPs中富集，与AR MEPs相比。 c 与AR MEPs相比，KEGG通路在HR MEPs中表达过高。圆圈的大小反映了每条通路的基因数目。 d 3种比较的DE基因的Venn图：HR与AR年轻(≤35岁)MEPs、HR与AR年龄大于55岁(>55岁)和AR年龄对AR年轻MEPs。 e 一个跨几个比较的基因重叠的矩阵。矩阵中的数字表示 P 值，而颜色梯度是日志。 2 (或)重叠。这个 P 对每对基因列表，采用Fischer‘s精确测试，对每对基因列表进行单边比较(Alternative=更大)。MHR.v.AR，HR MEPs中上调的基因与AR MEP相比；M.HR.v.AR.Y，HR MEPs中上调的基因与AR年轻的MEPs(≤35岁)相比；M.BRCA1.v.NO.RM，MHR.v.AR.Y中表达上调的基因 BRCA 1 与AR MEP相比，AR MEP不存在从减少乳腺增生症中收集到的任何突变。
