SMARCA 4/2缺失通过抑制IP3R3介导的Ca抑制化疗诱导的细胞凋亡2+线粒体通量

灭活突变SMARCA 4同时表观遗传沉默SMARCA 2卵巢癌和肺癌亚型的特征。SWI/SNF染色质重构复合物中这些关键亚基的丢失与化疗耐药和预后不良有关。在这里，我们发现SMARCA 4/2的丢失通过破坏细胞内的细胞器钙离子(Ca)来抑制化疗诱导的细胞凋亡。2+)在这些癌症中释放。通过限制染色质的可访问性ITPR 3编码Ca2+IP3R3通道、SMARCA 4/2缺乏导致IP3R3表达降低导致钙受损2+从内质网转移到诱导凋亡所需的线粒体。组蛋白去乙酰化酶抑制剂对SMARCA 2的激活在体外和体内均能挽救SMARCA 4/2缺陷癌细胞中IP3R3的表达，增强顺铂的应答。我们的发现阐明了SMARCA 4/2对钙的贡献。2+-依赖性凋亡诱导，可用于增强SMARCA 4/2缺陷癌的化疗反应。

ATP依赖的染色质重构复合物SWI/SNF家族通过调节染色质组织控制基因表达1,2。他们还通过修饰染色质或招募相关蛋白直接参与dna的复制、修复和重组。3。癌症基因组测序工作揭示了20%以上的人类癌症中SWI/SNF亚基的突变，突出了它们在肿瘤发生中的关键作用。4。然而，确定SWI/SNF在促进癌症中丢失的驱动机制仍然是一个挑战。

SMARCA 4(BRG 1)和SMARCA 2(BRM)是SWI/SNF的两个相互排斥的ATP酶亚基。~10%的非小细胞肺癌(NSCLC)中，SMARCA 4被突变或其他机制灭活。5,6,7,8,9。此外，SMARCA 4/2蛋白在非小细胞肺癌患者中的表达也会随之丢失，预后不良。6,10。除非小细胞肺癌外，有害SMARCA 4突变是卵巢小细胞癌100%的唯一遗传驱动因素，高钙血症型(SCCOHT)是一种罕见的侵袭性卵巢癌，影响年轻女性。11,12,13,14,15。SCCOHT的另一个特点是SMARCA 4/2蛋白同时缺失，其中SMARCA 2表观基因沉默，其激活强烈抑制SCCOHT的生长16,17。与其他癌症类型不同的是，实验中的SMARCA 2抑制是合成致死性的，SMARCA 4丢失。18,19,20, SMARCA 2SMARCA 4/2缺陷SCCOHT和NSCLC中沉默可能与SMARCA 4缺失有关10,21。然而，根本的机制是不被理解的。

除了调节基因表达外，SWI/snf组分，包括smarca 4，也参与dna损伤修复(Dr)。22,23,24。因此，它们的失活也可能导致ddr和基因组不稳定，这被广泛认为是癌症发展中的驱动因素。25。然而，SCCOHT有一个简单的基因组，除了使突变失活外，几乎没有其他的突变或染色体改变。SMARCA 415,26,27，表明转录调控改变可能是本癌发生的主要驱动因素。28.

以铂为基础的化疗，如顺铂，可导致dna损伤导致癌细胞凋亡，已广泛应用于肺癌和卵巢癌的临床治疗。29,30。SWI/SNF参与DDR支持使用这些基因毒性药物治疗SMARCA 4/2缺乏症，而SMARCA 4/2缺乏症并不常与其他可治疗的致癌突变同时发生。事实上，先前的研究表明，在SMARCA 4熟练的癌细胞中，SMARCA 4的实验性抑制增强了对dna损伤剂的反应。31,32,33。然而，常规化疗对SCCOHT患者很少有效。15,34与其他类型的卵巢癌相比，SCCOHT细胞对这些药物表现出明显的耐药性。26,35。因此，伴有SMARCA 4/2缺失的NSCLC患者预后较差。6,10而辅助化疗仍然是这种癌症的主要治疗方案之一。29。因此，虽然SWI/SNF缺陷与肿瘤的进展密切相关，但SMARCA 4/2缺陷的癌细胞适应抗化疗的机制尚不清楚。

在本研究中，我们试图研究SMARCA 4/2在SCCOHT和NSCLC中调节化疗反应的作用，而SMARCA 4/2缺乏症是常见的。我们的结果揭示了SMARCA 4/2缺失与抑制凋亡诱导化疗耐药的机制，并为改善SMARCA 4/2缺乏症的治疗提出了一种潜在的治疗策略。

SMARCA 4/2缺失对化疗诱导的癌细胞凋亡产生耐药性

SCCOHT除了使突变失活外，很少有突变或染色体改变。SMARCA 4但对常规化疗有典型的耐受性。15,34提示SMARCA 4缺乏症可能与化疗耐药有关。由于SMARCA 4在非小细胞肺癌中也经常失活，我们研究了SMARCA 4表达与化疗反应在这种癌症类型。我们首先分析了最全面的非小细胞肺癌微阵列基因表达数据集的临床结果，从主任的挑战数据集肺腺癌(LUAD，最常见的非小细胞肺癌亚型)不同的肿瘤分期。36。为了我们的分析，我们选择了SMARCA 4用Kaplan-Meier(Km)绘图仪无偏见地识别“jetset探测器”37,38，这是最佳的探针集的特异性，覆盖面和退化抗性，而不预先与病人的结果。我们将每一治疗组内的病人按中位数分为两组。SMARCA 4表达发现低SMARCA 4与高水平的化疗和放疗相比，辅助治疗(化疗和放疗)患者的生存率更低。SMARCA 4表达式(附图)1A)。这得到了KM绘图仪使用同一探针分析多种不同肿瘤分期的多个可用LUAD数据集的类似结果的支持(补充图)。1B)。UT肺孢子数据集中类似的趋势39也观察到，虽然没有统计学意义(补充图)。1C)。这些结果表明，SMARCA 4缺乏与非小细胞肺癌的化疗耐药有关，与SCCOHT相似。

由于上述数据集的患者结果可能受到治疗史等其他可变因素的影响，我们接下来研究了SWI/SNF丢失在更可控的实验环境中介导肿瘤细胞耐药的作用。首先，我们研究了化疗反应与mrna表达水平的相关性。SMARCA 4/2在一大群细胞系中n=436)不同类型的癌症(附图)。2A)，通过整合来自癌症药物敏感性基因组学(GDSC)的公开获得的药物敏感数据(GDSC)40和来自肿瘤细胞株百科全书(CCLE)的rna-seq(rna-seq)数据。41,42。我们对这些PAN癌细胞株进行了分层(n=436)SMARCA 4/2在梯田中的表达(附图)。2B)并发现SMARCA 4低层/SMARCA 2低层(A4L/A2L，这两种基因的底部畸胎)组(n具有最高的半最大抑制浓度(IC)。50四组化疗药物中，顺铂、环磷酰胺、拓扑替康、紫杉醇、依托泊苷、5 FU的作用机制不同。1A，补充图。2C)。值得注意的是，IC50差异A4L/A2L而SMARCA 4高/SMARCA 2高 (A4H/A2H这两种基因的顶端畸胎)组(n50)对所有这些药物都有统计学意义。这个SMARCA 4低层/SMARCA 2高 (A4L/A2H)组(n=24)有第二高的集成电路50明显高于A4H/A2H6种药物中的3种，包括顺铂。我们还观察到了高集成电路的一致趋势。50在SMARCA 4高/SMARCA 2低层 (A4H/A2L)组(n=34)A4H/A2H尽管它在统计学上没有意义。同样的结果也得到了同样的结果，仅分析肺癌细胞株(图1)。1B，补充图。二维空间)，它代表了最大的癌症类型(n=103)在CCLE小组中(补充图1)。2A)。综上所述，这些观察表明SMARCA 4/2SMARCA 4的表达与顺铂等多种化疗药物的耐药有关，提示SMARCA 4可能在调控肿瘤细胞的药物反应中起主导作用。

为了帮助无偏见地评估SWI/SNF基因在调控顺铂反应中的潜在作用，我们对OVCAR 4中的496个表观基因修饰物进行了CRISPR基因敲除筛选，这是一株SMARCA 4/2熟练的高级别浆液性卵巢癌(HGSC)细胞系(图)。1C)。在屏幕完成后，我们使用MAGeCK统计软件包对数据进行了分析。43,44寻找可能导致顺铂耐药性的基因。验证屏幕，我们确定EP300和CARM 1在最优秀的候选人中(分别排名第1和第5位；补充表)1还有无花果。1D)，已知其抑制会导致顺铂耐药性。45,46,47。根据我们在患者预后和CCLE细胞对化疗的反应方面的上述发现，SMARCA 4在我们的屏幕上排名也很高(#11)，这表明SMARCA 4的丢失会导致顺铂耐药(如图所示)。1C、d和补充表1). SMARCA 2SMARCA 4在控制顺铂反应中起主导作用，SMARCA 2仅在SMARCA 4丢失时进行补偿。

为了验证上面的屏幕结果，我们删除了SMARCA 4在OVCAR 4细胞中，利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统，研究了顺铂诱导OVCAR 4细胞凋亡的机制。与父母的控制相比，SMARCA 4击倒A4高)细胞对顺铂诱导的AnnexinV(细胞死亡标记物；补充图)的表达有较强的耐药性。3A)、切割PARP和Caspase 3(凋亡标记物；图1)。1E)。他们还展示了减少的附件五。+碘化丙啶(PI)−凋亡细胞群(图1.1F)，并且有较少的形态学缺陷，这是凋亡细胞的特征之一(如图所示)。1g)对顺铂治疗的反应。同样，SMARCA 4基因敲除也保护OVCAR 4细胞免受紫杉醇诱导的细胞凋亡(附图)。3B)。此外，击倒SMARCA 2使用两个独立的短发夹RNA(ShRNA)A4高细胞对顺铂诱导的上述凋亡反应的耐药性增加(如图所示)。1E-g，补充图。3A)。在HEC 116卵巢子宫内膜癌细胞系中也得到了类似的结果(附图)。3C，d)，进一步验证了上述结果在OVCAR 4细胞中的有效性。我们还注意到，在OVCAR 4对照细胞中大剂量的顺铂治疗会导致SMARCA 4/2蛋白表达降低(如图所示)。1E)，提出一种潜在的负反馈调控或选择低表达SMARCA 4/2的细胞。为了证实我们的结果，我们试图通过恢复SMARCA 4/2缺失的癌细胞中的SMARCA 4或SMARCA 2来进行反向实验。SMARCA 4/2修复对SCCOHT细胞生长的抑制作用16,17这限制了研究顺铂治疗后细胞凋亡调控的实验窗。相比之下，SMARCA 4/2缺陷的NSCLC细胞，包括H 1703细胞，能耐受SMARCA 4/2的恢复。48因此更适合这种分析。SMARCA 4或SMARCA 2致敏H 1703细胞在顺铂作用下的异位表达并诱导细胞凋亡，表现为Annexin V升高，PARP断裂，caspase 3被切割，Annexin V明显增加+/PI−凋亡细胞群，凋亡细胞形态的获取，以及生长受损。氢-j，补充图。3E，f)。进一步支持这一点，CRISPR/Cas9-调解SMARCA 4SMARCA 4/2基因敲除-熟练的H 1437非小细胞肺癌细胞对顺铂诱导的细胞凋亡产生耐药性；SMARCA 2在这些A4高细胞对顺铂的耐药性进一步增强，表现为PARP和Caspase 3断裂的减少和细胞存活率的提高(附图)。3G，h).

我们通过上述HEC 116和H 1703的等基因细胞对SMARCA 4状态的差异，进一步研究了SMARCA 4丢失对其他常用化疗药物的作用。与顺铂的结果一致，SMARCA 4HEC 116细胞的基因敲除可抑制环磷酰胺、拓扑替康和紫杉醇(附图)诱导的PARP和Caspase 3的升高。4A在这些药物的存在下，细胞活力增加(补充图)。4B)。相反，SMARCA 4可使H 1703细胞对这些药物的治疗产生敏化作用，表现为细胞凋亡的增加和细胞存活率的提高(补充图1)。4C，d)。我们的数据表明，SMARCA 4/2缺失抑制化疗诱导的卵巢癌和肺癌细胞凋亡反应。

SMARCA 4/2丢失导致细胞内Ca的改变2+癌细胞的稳态

为了了解SMARCA 4/2是如何调节化疗敏感性和诱导凋亡的，我们利用SCCOHT细胞的简单遗传背景分析了SMARCA 4调控的转录组。SCCOHT-1和BIN-67细胞±SMARCA 4修复过程中RNA-seq数据的基因集富集分析(GSEA)49揭示了前十个基因本体(GO)术语，由SMARCA 4调控，这两个SCCOHT细胞系一致(补充图)。5)。多个与离子/钙稳态相关的术语被鉴定为“离子转运体”和“钙离子结合”(图1)。2A、b)。钙离子的重要作用2+)细胞凋亡诱导中的稳态50使这些术语特别有趣。瞬时Ca2+内质网释放，这是细胞内主要的钙2+储存、进入胞浆和随后转移到线粒体对于细胞信号传导和ATP的产生都是很重要的。51。然而，过量的ER-Ca2+释放导致线粒体钙2+过载和细胞死亡，最近与癌细胞的选择性脆弱性有关。52,53,54。在SCCOHT细胞中，这些转录组分析表明Ca2+稳态可能是SMARCA 4改变的细胞过程，在细胞凋亡调控和癌细胞存活中起重要作用。

考虑到细胞内钙的关键作用2+在诱导细胞凋亡中，我们推测SMARCA 4/2可能通过调节细胞内钙而影响细胞凋亡。2+通量。SMARCA 4/2在Ca中的作用2+动态平衡和线粒体转移，我们测定了细胞浆和线粒体钙的变化。2+三磷酸肌醇(IP3)激活ER-Ca激动剂对组胺作用下SCCOHT-1细胞的含量及±SMARCA 4的恢复作用2+三磷酸肌醇受体(IP3R)释放55。为了监测细胞内钙2+动态，我们表达了基因编码的Ca2+针对胞浆的指标(R-GECO)56或线粒体(cepia-2 mt)57并监测geci荧光对ER-Ca的影响。2+旋转盘共聚焦显微镜释放刺激(补充图。6)。而组胺刺激引起的胞质或线粒体Ca变化不大。2+在SCCOHT-1对照细胞中，钙明显升高。2+SMARCA 4-恢复细胞的两个室的含量(图)。2C-e)。与此相一致，SMARCA 4在H 1703细胞中的恢复也显著增加了ER-Ca。2+释放到胞浆和钙2+与对照细胞相比，组胺刺激后线粒体转移。2F-h)。这些数据表明SMARCA 4在调节细胞内钙的过程中起着重要的作用。2+ER-Ca的稳态作用2+释放到胞浆和线粒体。

胞浆和线粒体Ca升高2+SMARCA 4修复后所观察到的钙含量可能与钙的直接增强有关。2+从ER释放或提高ER-Ca的容量2+内容。为了区分这些可能性，我们测量了细胞内钙。2+肌浆/ER Ca抑制剂thapsigargin对SCCOHT-1和H 1703上述等基因细胞对的影响2+-ATP酶，它可以完全耗尽ER-Ca2+商店55。有趣的是，SMARCA 4的修复不会增加最大胞浆ER-Ca。2+Thapsigargin在SCCOHT-1或H 1703细胞中的释放(补充图。7a，b)，提示SMARCA 4促进Ca2+从ER释放而不是增加ER-Ca2+储存容量。进一步支持这一点的是，OVCAR 4和H 1437细胞的SMARCA 4基因敲除显著降低了细胞浆和线粒体Ca的诱导。2+组胺治疗(图1)。2i-n)，即使SMARCA 4基因敲除增加了ER-Ca2+从胞浆Ca的增加中可以看出2+在OVCAR 4细胞中，而在H 1437细胞中，在thapsigargin刺激后(补充图)。7C，d)。最后，排除线粒体钙的潜在贡献。2+在此表型摄取机制中，我们发现线粒体钙单转运体(Mcu)及其调节因子的蛋白质水平。58,59在这些细胞系中没有变化，表明Ca2+转移缺陷不是线粒体钙缺陷所致。2+进口机械(附图)7E)。这些结果表明，SMARCA 4/2对细胞内钙有调节作用。2+稳态与线粒体钙2+控制Ca含量2+从急诊室释放。

SMARCA 4/2直接调节ITPR 3表达

探讨SMARCA 4/2调节Ca的详细机制2+动态平衡，我们进一步研究了Ca。2+-从上述SCCOHT细胞转录组分析中发现的离子/钙相关GO术语中的相关基因(见图)。2A、b)。在SCCOHT-1和BIN-67细胞中，这两个数据集重叠产生了198个受SMARCA 4修复影响的共同基因(图1)。3A；补充表2)。为了帮助识别SMARCA 4的直接靶点，我们在染色质免疫共沉淀测序(芯片-seq)数据集中检测了这198个共同调控的基因，分析了SMARCA 4在BIN-67细胞±SMARCA 4修复中的占用率。60。这一分析显示，在198个基因中，有69个基因显示SMARCA 4占据了他们的位点(图一)。3A；补充表2)。认为SMARCA 4和SMARCA 2可能调控相同的靶基因，而SMARCA 4对Ca也有调节作用。2+NSCLC细胞的稳态2F-h)，我们在bin-67细胞±smarca 4/2修复的独立rna-seq数据集中检测了这69个基因的调控。60NSCLC细胞株H 1299±SMARCA 4的微阵列数据集61。值得注意的是，69个受SMARCA 4影响的基因在BIN-67细胞中也受到SMARCA 2的调控，提示SMARCA 4/2在调控Ca方面可能具有冗余功能。2+稳态(图1.3B)。与肺癌细胞比SCCOHT具有更复杂的遗传环境这一事实相一致15,62，只有四个基因，即ITPR 3, MATN 2，EHD 4，和ATP2B4，SMARCA 4在两种肿瘤类型中持续上调(图1)。3B).

在这四种常见基因中，ITPR 3编码1，4，5-三磷酸肌醇受体3型(IP3R3)，是构成Ca的IP3R家族成员之一。2+内质网通道及其在胞内钙中的重要作用2+稳态与细胞凋亡52,63。Ip3r3定位在线粒体相关膜上，这是一个信号平台，可以生成高钙的微区。2+有效线粒体钙所需浓度2+摄取64，并优先传递凋亡Ca2+信号通过其他IP3Rs进入线粒体65。PTEN、BAP 1和PML等抑癌因子可通过促进IP3R3介导的Ca而诱导癌细胞凋亡。2+ER到线粒体的通量66,67,68。因此，我们假设SMARCA 4/2可能促进Ca的形成。2+线粒体通量与细胞凋亡的直接调控ITPR 3基因表达证实我们的转录组数据以上(图。3BSMARCA 4或SMARCA 2在SCCOHT(BIN-67，SCCOHT-1)和NSCLC(H 1299，H 1703)细胞中的异位表达均导致IP3R3 mRNA和蛋白表达增加。3C、d)。相反，SMARCA 4OVCAR 4、HEC 116和H 1437细胞的基因敲除抑制IP3R3的表达，随后进一步下调IP3R3的表达。SMARCA 2击倒(附图)8)。这些数据证实，SMARCA 4/2可能通过直接调控转录促进卵巢癌和肺癌细胞中IP3R3的表达。

考虑到SWI/SNF在染色质重构中的作用，我们重点研究了SWI/SNF的染色质结构。ITPR 3SMARCA 4/2对SMARCA 4位点的潜在调节作用。ITPR 3启动子芯片-seq数据的BIN-67细胞在SMARCA 4恢复(图1。3E)60。我们还检测到SMARCA 4修复后对H 1703细胞中SMARCA 4的占用率。48在H 1299细胞中表达可诱导的SMARCA 461(无花果)3E)。这些数据表明SMARCA 4/2可能直接调节ITPR 3表情。与此相一致，我们发现h3k27ac(一个与活性启动子和增强子相关的染色质标记)的芯片seq信号在h3k27ac的上游和基因体区域升高。ITPR 3SMARCA 4修复后的BIN-67细胞60SMARCA 4或SMARCA 2修复后的H 1703细胞48(无花果)3F、上面板)。此外，用测序法(atac-seq)测定转座酶-可接近染色质。ITPR 3H 1703细胞SMARCA 4/2恢复后基因组区也增加(图1)。3F)，表示染色质可访问性增强。ITPR 3SMARCA 4/2位点。这些数据表明，SMARCA 4/2促进了ITPR 3通过直接重构染色质结构在其基因位点的转录。

SMARCA 4/2缺失通过抑制IP3R3介导的Ca抑制细胞凋亡2+线粒体通量

接下来，我们研究了降低ip3r3表达是否导致钙受损。2+SMARCA 4/2缺乏的SCCOHT和NSCLC细胞的通量(见图)。2C-n)。为此，我们通过抑制SMARCA 4介导的IP3R3对SCCOHT-1和H 1703细胞的诱导作用进行了拯救实验。伴随着IP3R3水平的增加(如图所示)。4A)，SMARCA 4在SCCOHT-1细胞中的表达明显升高(如图所示)。4B)和线粒体。4C)钙2+组胺刺激反应的内容。值得注意的是，在这些SMARCA 4恢复的细胞中，shRNA介导的IP3R3基因敲除水平与对照细胞相似，可以阻止ER-Ca。2+释放，其特征是胞浆和线粒体钙显著减少2+内容(图1.4A-C)。这些结果在H 1703细胞中得到证实，小干扰RNA(SiRNA)抑制了IP3R3。4D-f)。此外，胞浆Ca2+上述SCCOHT-1和H 1703细胞对thapsigargin刺激的测定表明ER-Ca2+储存容量没有明显改变ITPR 3击倒(附图)9)。这些数据表明，IP3R3表达的减少是导致钙受损的关键因素。2+SMARCA 4/2缺陷细胞的通量。

aSCCOHT-1细胞的免疫印迹SMARCA 4 (A4)和ITPR 3 (R3)扰动。什R3*靶向性shRNAITPR 3。胞浆变化b)和线粒体(c)钙2+SCCOHT-1细胞的含量±A4和R3组胺刺激的扰动。b43控制(Ctrl)，30A4, 51 A4什R3♯1和50A4什R3♯2细胞n对4个独立实验进行了分析。c31岁，Ctrl，30岁A4, 50 A4什R3♯1和50A4什R3♯2细胞n对4个独立实验进行了分析。dH 1703细胞的免疫印迹A4和R3扰动西R3SiRNA靶向ITPR 3。胞浆变化e)和线粒体(f)钙2+H 1703细胞的含量±A4和R3组胺刺激的扰动。e64 Ctrl，70岁A4、64A4西R3细胞n=3项独立实验。f53 Ctrl，53A4，和50A4西R3细胞n=3项独立实验。gOVCAR 4细胞的免疫印迹ITPR 3顺铂治疗后48h击倒。裂了。h附件五+/PI−流式细胞仪检测OVCAR 4细胞凋亡g。H 1703细胞的免疫印迹R3过度表达(i)或±A4和R3扰动(j)。处理后72h收集细胞。k附件五+/PI−流式细胞仪测定H 1703细胞凋亡j. b, c, e, f左：胞浆或线粒体钙的痕迹2+100μM组胺刺激的含量(平均±扫描电镜)。右：最大Ca的量化2+组胺诱导的信号峰(平均±SD)。钙2+用R-GECO(R-GECF/F0)和Cepia-2 mt(Cepia-2 mt F/F0)探针检测细胞胞浆和线粒体Ca。2+分别。ARB。单位任意单位。单因素方差分析，邓尼特的多重比较检验，p值(p): bA4-0.0003，shR 3#1-0.6223，shR 3#2-0.9866；cA4<0.0001，shR 3#1-0.9109，shR 3#2-0.9845；eA4-0.0038，SiR3-0.4232；fA4-0.0007，SiR 3-0.1620。H，k平均±SDn=3项独立实验，单程方差分析和Dunnett的多重比较检验，p值(p)：全部<0.0001。*p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; ns not significant.

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IP3R3在Ca中的既定作用2+-介导凋亡，抑制IP3R3在OVCAR 4细胞中的作用，可通过降低PARP和Caspase 3的水平来阻止顺铂诱导的细胞凋亡(如图3所示)。4G)和附件五+/PI−凋亡细胞群(图1.4H)。相反，IP3R3在H 1703细胞中的异位表达促进了顺铂治疗后细胞凋亡的诱导和生长抑制。4I，补充图。10a，b)。同样，异位表达的IP3R3也使BIN-67细胞对顺铂治疗有致敏作用(附图)。10C，d)。因此，IP3R3对顺铂诱导的细胞凋亡是必要的，也是足够的。考虑到SMARCA 4/2直接激活ITPR 3表达式(图1.3)研究了SMARCA 4/2缺陷细胞IP3R3表达降低是否导致化疗诱导的细胞凋亡。如图所示。4J，k，当SMARCA 4在H 1703细胞中恢复后，IP3R3的表达增加，PARP、Caspase 3和Annexin V的表达也随之升高。+/PI−凋亡细胞经顺铂处理后，IP3R3的敲除明显抑制了这些SMARCA 4表达细胞的凋亡标记物的诱导，证实了Ca的存在。2+这些细胞中的信号缺陷(图)。4D-f)。这些数据表明SMARCA 4/2缺失通过抑制IP3R3介导的Ca而抑制化疗诱导的细胞凋亡。2+流向线粒体。

SMARCA 4/2缺陷癌中IP3R3的表达降低

进一步验证我们的发现ITPR 3SMARCA 4/2在基因微扰细胞模型中的调节作用ITPR 3和SMARCA 4/2在rna-seq卵巢数据集中(n=47)和肺癌(n=192)可从CCLE获得的细胞系41,42。对于这两种癌症类型，低分化的细胞系SMARCA 4表达式(下四分位数)也表示较低的ITPR 3与其他细胞株相比SMARCA 4表达式(附图)11A)。此外，我们观察到ITPR 3和SMARCA 2在这些卵巢(n=11，r=0.825)和肺(n=48，r=0.584)低的癌细胞株SMARCA 4表达式(图1.5A)。此外，在20株NSCLC细胞株中，SMARCA 4缺陷细胞与SMARCA 4熟练细胞相比，IP3R3蛋白表达降低；SMARCA 4/2双缺陷细胞系IP3R3表达水平最低(图1)。5B)。这些结果与我们的上述功能数据一致，支持在SMARCA 4/2缺乏的卵巢癌和肺癌细胞中IP3R3的表达降低。

a相关的ITPR 3和SMARCA 2 (A2)mRNA在卵巢(n=11)和肺(n=48)低表达的癌细胞株SMARCA 4 (A4)。从癌细胞株百科全书(CCLE)中获得每百万阅读材料(RPKM)的表达数据。42. A4低层，下四分位数。r皮尔逊相关；p: p值(双尾)b表明SMARCA 4/2(A4/2)状态的肺癌细胞免疫印迹。专业熟练，缺乏DEF；*克拉斯变种人。c相关的ITPR 3和SMARCA 2卵巢癌组织中mRNA的表达n=89)和肺腺癌(LUAD)，n=128)低表达的肿瘤SMARCA 4。从UCSC Xena获得的基因表达数据为每千巴酶百万(FPKM)片段。A4低层，下四分位数。r、Pearson相关；p, p值(双尾)d ITPR 3SCCOHT和卵巢癌患者肿瘤中mRNA的表达。TCGA卵巢癌(OV)(n=379)SMARCA 4/2如附图所示。2B. ITPR 3将FPKM中的表达式归一化为ACTB。H：高；L：低。单向ANOVA，Brown，Forsythe和Welch检验，以及Dunnett的多重比较检验A4HA2H, p值(p): A4HA2L—0.3830, A4LA2H—0.0009, A4LA2L < 0.0001, SCCOHT—0.0108, or two-tailed t-之间的测试A4LA2L小组和SCCOHT，p=0.4953。有代表性的图片(E，g)和H-得分(F，h)免疫组化分析IP3R3和SMARCA 4在肿瘤中的表达。e, fHGSC(n=49)和SCCOHT(n=45)。G，h非小细胞肺癌(n=59)。标尺，100μm.Mann-Whitney检验(双尾)，p值(p): f 0.0066, h 0.0270. iH 1703异种移植瘤生长模型±外源性SMARCA 4的表达多西环素(Dox)从第21天开始每日给药诱导SMARCA 4。上，肿瘤大小；下，终点肿瘤重量。均值±扫描电镜，−Dox(n=4只动物)，+Dox(n=6只动物)，双向变异数(上)，双尾t-测试(下)，p值(p)：上-0.0014，下-0.0008。有代表性的图片(j)和数字量化(k)的免疫组织化学分析i。标尺，100μm.平均值±SD，−Dox(n=4)，+Dox(n=6)，双尾t-测试(下)，p值(p)：上、中<0.0001；下-0.0041。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; ns not significant.

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其次，我们研究了IP3R3和SMARCA 4/2在肿瘤中的表达之间的关系。我们分析了卵巢浆液性囊腺癌(OV)的tcga rna-seq数据集。69、LUAD和肺鳞状细胞癌肿瘤7,70。类似于上述对细胞系的观察，ITPR 3底四分位的肿瘤组织中mRNA的表达SMARCA 4在所有三组数据中，与其他肿瘤相比，表达明显减少(补充图)。11B)。证实细胞系的结果(图)。5A), ITPR 3也与SMARCA 2低表达肿瘤中mRNA的表达SMARCA 4表达式(图1.5C，补充图。11C)。此外，我们还分析了ITPR 3SCCOHT患者肿瘤中mRNA的表达n=13)SMARCA 4/2蛋白表达缺失。与上述分析一致，ITPR 3SCCOHT肿瘤中mRNA表达与OV肿瘤相似，低表达SMARCA 4/2 (n=42)而明显低于高表达的OV肿瘤SMARCA 4/2 (n=50)69(无花果)5D)。应用免疫组织化学(IHC)技术，用IP3R3抗体检测了IP3R3蛋白在SCCOHT和HGSC中的表达。12)。如图所示。5E、f、SCCOHT肿瘤(n表达水平明显低于HGSCs(n=45)。SMARCA 4低表达的NSCLC肿瘤n=9，HSMARCA 4高表达组(≤100)IP3R3蛋白表达明显低于SMARCA 4高表达组(P<0.05)。n=50，H-得分>200)(如图所示)。5G、h)。这些结果来自多个细胞系和患者肿瘤样本，支持SMARCA 4/2在调控中的协同作用。ITPR 3并证实在SMARCA 4/2缺陷癌中IP3R3表达降低。

抑制IP3R3介导的Ca2+通量和凋亡与其他主要抑癌因子PTEN、BAP 1和PML有关，它们在促进肿瘤发生中起着重要作用。66,67,68我们的上述分析表明，这也可能在SMARCA 4/2缺陷型癌症中发挥作用。我们利用一种具有外源smarca 4表达的h1703细胞的异种移植模型，利用一个有效的多西环素控制的表达系统，在体内研究了这种可能性。49。在肿瘤建立后，我们用强力霉素诱导了SMARCA 4的表达，这确实导致了肿瘤生长的抑制(图一)。5I)。此外，对终末期肿瘤的IHC分析表明，诱导-SMARCA 4的表达可导致IP3R3和Caspase 3的高表达(如图3所示)。5J、k)。虽然这还需要进一步的研究，但这些数据支持降低SMARCA 4/2缺陷癌中IP3R3的表达，可能通过抑制凋亡直接促进肿瘤的发生。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)对SMARCA 4/2缺陷癌细胞IP3R3表达及顺铂反应的影响

我们的数据表明，SMARCA 4/2缺陷的癌细胞对顺铂有一定的耐药性，部分原因是通过抑制IP3R3，而异位表达的IP3R3可以使这些癌细胞对顺铂诱导的凋亡敏感(图一)。4G-k，补充图。10)。虽然IP3R3不具有靶向性，但它的表达是由SMARCA 4/2直接激活的。3)。与有害突变形成对照SMARCA 4，SMARCA 2缺失是SCCOHT和NSCLC表观遗传沉默所致。17,71,72,73。此外，hdaci，一类抗癌药物，可以阻止染色质和其他细胞底物的去乙酰化，参与癌症的发生和发展。74,75在SCCOHT和肺癌细胞中重新激活SMARCA 2的表达。17,76,77。事实上，使用奎索他汀的治疗78，第二代HDACi使SMARCA 2在SCCOHT的mRNA和蛋白水平同时升高，从而引起SMARCA 2的强烈激活。13)和SMARCA 4/2缺失的NSCLC癌细胞(图1)。6A、b)。与此相一致的是，Quisinostat治疗明显升高了胞浆(补充图1)。14A)和线粒体(补充图。14B)钙2+组胺刺激反应的含量，类似于异位SMARCA 4在H 1703细胞中的表达水平(补充图)。14A-c)。值得注意的是，sirna介导的ip3r3基因敲除在这些quisinostat处理的细胞中可以阻止ER-Ca。2+释放，其特征是胞浆和线粒体钙显著减少2+目录(附图)14A-c)。这些数据表明，准顺式处理可以间接恢复ip3r3的表达，挽救Ca。2+SMARCA 4/2缺陷癌细胞的通量。

其次，我们探讨了用HDACi恢复SMARCA 4/2缺陷癌细胞化疗敏感性的可能性。在H 1703细胞中，联合应用顺铂和准顺铂可使PARP和Caspase 3的裂解率明显升高(图3)。6B)，附件五+/PI−凋亡细胞群(图1.6C)，以及生长抑制(图1.6d)。考虑到HDACi将激活除HDACi以外的其他基因的表达SMARCA 2验证SMARCA 2在该药物组合诱导细胞凋亡中的重要作用。为此，CRISPR/Cas9-调解SMARCA 2在H 1703细胞中的基因敲除可以使IP3R3的升高和顺铂联合作用下的细胞凋亡标记物减弱(如图1所示)。6E)。此外，siRNA介导的IP3R3基因敲除也可阻止该治疗组合诱导的H 1703细胞凋亡标记物的升高(图一)。6f)。最后，共聚焦活细胞显像显示，顺铂与双顺铂联合应用可强烈诱导基底线粒体钙的增加。2+这些细胞的水平(图)。6g、h)。这些结果表明，quisinostat能刺激SMARCA 2依赖的IP3R3的表达，恢复ER-Ca。2+释放型线粒体钙2+SMARCA 4/2缺陷癌细胞的通量和化疗敏感性。

最后，我们利用H 1703细胞移植模型验证了顺铂与准顺铂联合用药的体内抗肿瘤作用。肿瘤建立后，动物用顺铂(4mg Kg)治疗。−1)，Quisinostat(10毫克千克)−1)，或者它们的组合。与我们的体外结果一致，联合使用比单独使用每种药物更有效地抑制肿瘤生长，如肿瘤体积和重量的显著减少所表明的那样(图1)。6I)。我们注意到，一些动物使用顺铂或联合治疗，但不是单用奎斯诺特，显示体重下降(补充图)。15A)，可能与化疗引起的副作用有关。然而，当回归到动物体重时，药物组合仍然显示出与单一治疗相比，肿瘤体积和重量都显著减少(补充图)。15B，c)。此外，对终末期肿瘤的IHC分析表明，Quisinostat治疗能够诱导SMARCA 2和IP3R3蛋白的表达。6J与顺铂联合，协同诱导强烈的凋亡反应，表现为Caspase 3水平明显升高(图3)。6J、k)。综上所述，我们的数据为增强SMARCA 4/2缺陷型癌症患者的化疗疗效提供了一个概念上的证明。

我们发现SMARCA 4/2缺乏症至少在一定程度上是通过改变ER对线粒体Ca的改变来降低化疗诱导的卵巢癌和肺癌的凋亡反应。2+通量。直接限制ITPR 3SMARCA 4/2缺失抑制Ca的表达2+从ER转移到线粒体是诱导细胞凋亡所必需的。因此，刺激ITPR 3HDACi通过SMARCA 2的激活增强SMARCA 4/2缺陷癌细胞的化疗反应。

SWI/SNF亚基在人类癌症中经常发生突变4，它与癌症的特征有关，包括细胞异常增殖、分化和代谢改变。1,28。我们的发现建立了SMARCA 4/2丢失与IP3R3介导的Ca之间的功能联系。2+抵抗程序化细胞死亡的通量。虽然我们目前的研究主要集中在耐药方面，但我们也发现单用SMARCA 4修复可以抑制H 1703异种移植物的肿瘤生长，这与IP3R3和裂解caspase 3的表达增加有关。2+稳态还可能通过抑制细胞凋亡直接参与SMARCA 4/2丢失的肿瘤发生，就像其他主要抑癌基因PTEN、BAP 1和PML一样。66,67,68。有必要进行更多的调查，以进一步证实这些结果。SMARCA 4/2在线粒体Ca调节ER中的协同作用2+通量和凋亡，很可能以SWI/SNF依赖的方式发挥这些功能。因此，探讨其他常在癌症中改变的SWI/SNF亚基的潜在作用，如ARID1A4，钙2+稳态和凋亡可能有助于了解其他SWI/SNF缺陷癌的致癌机制。

我们的研究探讨了SMARCA 4/2在自然隐藏SMARA 4/2改变的癌细胞株调控化疗反应和诱导凋亡中的作用。这与以往使用RNAi介导的研究不同。SMARCA 4SMARCA 4基因敲除-熟练的癌细胞，导致对DNA损伤剂的反应增强31,32,33。我们发现自然发生的SMARCA 4/2缺乏的癌细胞对化疗更有耐受性，这与以前的报告一致，表明SCCOHT在细胞模型和患者中对常规化疗都有更强的耐药性。15,34。同样，SMARCA 2的实验抑制也被证明对SMARCA 4缺陷/SMARCA 2熟练的癌细胞具有选择性致死作用。18,19,20。然而，SMARCA 4/2的同时丢失发生在几乎所有的SCCOHT和与患者预后较差相关的NSCLCs的子集中。6,10,16,17。因此，自然发生的SMARC4A/2缺乏症可能代表一个独特的群体，具有独特的性质，如改变的Ca。2+稳态导致化疗耐药。

与SCCOHT相似，我们对包括最全面的主任挑战数据集在内的多个非小细胞肺癌数据集的分析表明，减少了SMARCA 4非小细胞肺癌组织中表达与化疗耐药有关。上一次报告79NSCLCs早期JBR.10数据集分析80显示肿瘤低表达的病人SMARCA 4，但不高SMARCA 4，受益于顺铂和长春瑞滨(一种微管抑制剂)的辅助治疗。此差异可能是由于SMARCA 4微阵列探针组的选择，病人队列的组成，以及数据分析方法。当我们使用KM绘图仪无偏见地识别出最优的Jetset探针时，基因芯片技术在定量基因表达方面的敏感性和特异性有限。因此，这些结果需要进一步证实使用更好的工具，如rna-seq。此外，我们还认识到，患者的预后往往受到治疗史等多种因素的影响，而这些因素在分析的所有患者中并不是一致的。因此，需要更多的临床研究来更好地控制这些变异，并评估SMARCA 4/2在预测NSCLC患者化疗疗效中的作用。

HDACi已被临床批准用于治疗几种血液系统恶性肿瘤，但其在实体肿瘤中的活性仅限于单一药物。74,75。因此，识别HDACi的遗传易感性和有效的药物组合可以提高其临床应用价值。SCCOHT细胞对HDACi的敏感性高于SMARCA 4/2缺陷的NSCLC细胞。76。这可能是因为非小细胞肺癌的基因组成比SCCOHT更复杂。15,62。我们的研究提供了原则上的证据，证明hdaci可能是一种潜在的刺激治疗策略。ITPR 3通过SMARCA 2的转录，使SMARCA 4/2缺陷型肿瘤对化疗恢复和敏化。还可以探讨其他战略。例如，ggti-2418，一种geranylgeranyl转移酶抑制剂，通过稳定ip3r3蛋白，使A 549细胞通过光动力疗法在体外和异种移植模型中对细胞凋亡产生敏化作用。66。值得注意的是，A 549也是SMARCA 4缺陷的NSCLC细胞系，这一独立研究进一步支持了上调IP3R3表达以增强SMARCA 4/2缺陷癌化疗反应的观点。然而，HDACi和GGTI-2418都间接地干预了IP3R3的表达，并可能造成意想不到的毒性。因此，其他直接促进钙的试剂2+从ER到线粒体的通量还有待进一步研究。除IP3R3外，SMARCA 4/2的其他共同靶点也可能参与Ca的改变。2+细胞凋亡的稳态效应可能是SMARCA 4/2缺乏症的潜在药物靶点，需要进一步研究。

总之，我们发现SMARCA 4/2的丢失限制了IP3R3介导的Ca。2+ER与线粒体的通透性，导致卵巢癌和肺癌对化疗诱导的凋亡产生抗药性。我们的研究为探讨SWI/SNF丢失促进耐药的分子机制提供了理论依据，并提出了一种增强SMARCA 4/2缺乏症患者化疗反应的潜在治疗策略。