妊娠与子宫肌瘤染色体损伤的关系

在受约束的细胞环境中的机械力最近被确立为染色体损伤的促进者。这是否能促进肿瘤的发生尚不清楚。子宫肌瘤是一种常见的肿瘤，其染色体畸变相对较少。我们假设，如果机械力导致染色体损伤，可以在分娩的妇女子宫肌瘤中看到这方面的迹象。我们检查了1946年肿瘤的核型，发现染色体损伤与胎次有关的异常现象。然后我们对肌层细胞施加类似于怀孕期间所遇到的生理力量，发现这会导致DNA断裂和DNA修复反应。虽然在受约束的细胞环境中作用的机械力可能会导致子宫肌瘤的肿瘤变性和发生，但还需要进一步的研究来证明所观察到的相关性的可能因果关系。没有发现进展为恶性肿瘤的证据。

近几年来，限制环境是染色体损伤的原因这一观点引起了人们的极大关注，核包膜破裂作为一种机制一直是人们关注的焦点。1,2。Ne破裂是一种常见的现象，即使在正常条件下也是如此，在受限环境中，Ne破裂的频率急剧增加。3。去甲肾上腺素破裂的已知原因包括细胞外基质的僵硬增加了肾上腺髓质收缩能力。4,5，以及通过窄孔迁移(见6)。损伤也可由核变形引起，而不发生NE断裂，例如dna的机械剪切或dna修复因子被排除在dna损伤部位。7,8。此外，由迁移和细胞压缩引起的核变形被证明是通过增加复制应力而导致dna损伤，而不是NE破裂。9。染色体损伤是肿瘤发生的重要驱动因素。10，是否机械力可能是一个重要的贡献，人类肿瘤尚未得到解决。

在怀孕期间，子宫平滑肌细胞会不断拉伸，随后，在分娩期间，肌动蛋白和肌球蛋白会产生强烈的周期性收缩。11,12。子宫平滑肌瘤(ULS)是非常常见的良性平滑肌肿瘤。终生流行率接近70%13。ULS是异常出血和疼痛的常见原因，也是子宫切除术最常见的原因。多发同步肿瘤的发生是典型的14。大多数ULS是由MED 12基因15,16。与癌症中常见的高度复杂的核型相比，染色体型通常是相对稳定的，但是由于dna双链断裂(Dna)而引起的染色体畸变(特别是染色体区域的丢失)是常见的现象。17,18,19。一个特别有趣的特征是复杂的染色体重排(CCRs)在其他良性的ULS中相对频繁地发生，类似于色性关节炎(Chromothripsis)。17。嗜铬菌是一个单一的事件，其中一个或少数染色体会受到数十至数百个重排。它通常与TP 53突变型癌症20。多种机制可能导致这一现象，微核的形成和随后的染色体损伤是可能的关键原因。21。在ULS中观察到的CCR涉及数目有限的染色体，包含链式结构重排，因此，似乎是在单个事件中形成的，如17。虽然这些特征也具有色性，但不同之处在于UL中检测到的大多数CCR事件不那么引人注目。一个合理的解释是，在UL成因中，作为强大癌症驱动因素的嗜色性事件是不能容忍的，因为细胞检查点仍然完好无损。21在TP 53野生型前体细胞17。摘要子宫平滑肌肉瘤(Ulms)是一种罕见的恶性平滑肌肿瘤，具有广泛的拷贝数改变和嗜铬事件。22。虽然UL的恶性潜能极低，但已提出将UL转化为Ulms的可能性。23.

在这项工作中，我们检验了这样的假设：如果机械力作用于一个受约束的细胞环境中是染色体损伤的相关来源，那么在经历过妊娠和分娩的妇女的子宫肌层肿瘤中可以看到这种情况的迹象。我们在1946年从628例ULS患者中检测了与染色体断裂的关系，以及在群体背景下与Ulms的关联。

患者与肿瘤特征

对628例患者进行了胎次分析，1935例肿瘤进入分析。31%的肿瘤来自无胎患者，69%的肿瘤来自分娩患者；79%的肿瘤来自于产妇。MED 12突变(称为MED 12肿瘤)；21%为野生型(WT)(称为WT肿瘤)MED 12司机突变。共有595名参与1836个肿瘤的患者提供了所有背景变量的信息：子宫切除年龄、绝经状况(前、后和激素替代治疗)、激素避孕使用(从未/从未)和吸烟状况(从未/从未)。患者特征摘要见图。1A和补充表1，肿瘤特征见图。1B，以及图中奇偶度与背景变量之间的关系。1C.

a病人特征(N=628)。每个病人的肿瘤数目的分布，胎次，患者的年龄和更年期状况。中间用蓝色垂直线表示。b子宫肌瘤的壁内、浆液下和粘膜下部位(N=1451)。大部分肿瘤是壁内肿瘤，但是MED 12突变的肿瘤与浆液下的位置有关。c在左上角，子宫切除术的年龄按胎次分层。这个y-轴是以年为单位的。方阵图显示中间四分位数以及第一和第三四分位数。误差条扩展到四分位数以上的1.5IQR。每组患者数分别为：胎次0=196，1=108，2=213，3=71，4=28，5=9，6=1，7=1。左下角，有吸烟史(是/否)的患者按胎次分层。在右上角，口服避孕药联合使用(从未/从未)的患者数量按胎次进行分层。右下角是绝经前、绝经后患者和激素替代治疗(HRT)患者的数量.提供了源数据。

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UL染色体的得失与胎次的关系

我们利用芬兰肌瘤研究中建立的基于单核苷酸多态(Snp)阵列的等位基因不平衡(AI)数据，研究了基因突变与DNA损伤的关系。19。图中给出了一个由SNP阵列确定AI的实例.2A和不同程度的DNA损伤在WGS数据图中的例子。2B。断点的平均数目、损失区域的总长度、增益区域的总长度和总合并长度的平均值如图所示。2C和补充表2。结果由胎次(无胎和分娩)以及肿瘤亚型(MED 12突变体和WT)。我们发现，当将分娩患者的肿瘤与无生育患者的肿瘤进行比较时，断点数的平均值以及拷贝数改变的总长度都在增加。例如，胎儿肿瘤的躯体损失总长度高于无孕产肿瘤：MED 12肿瘤和WT肿瘤的平均长度分别高62%和47%。

aSNP阵列数据中的等位基因不平衡(AI)片段。从自上而下的例子，染色体1B-等位基因频率(BAF)，镜像BAF(MBAF)和LogR比率(LRR)。底部，一个解释段的示意图：黑色的水平线代表AI段。蓝色水平线表示LRR阈值−0.15。蓝点代表计算出的断点：I.当AI片段位于染色体末端时，只计算出一个断点。如果相邻拷贝数段之间的LRR差值小于0.1，则这些段被认为是连续的，并且仅被计算为两个断点。当片段不在染色体末端，相邻片段间的LRR差值>0.1时，计算出两个断点。bULS的典型等位基因失衡模式。复杂染色体重排(CCR)模式在不同ULS中的代表性例子。只有受等位基因不平衡变化影响的染色体：顶部：大多数断点数高的肿瘤来自已知的野生型肿瘤(Wt)。MED 12突变。Chr 12之间的易位(HMGA 2)和chr 14(RAD51B)是很常见的。中期：MED 12肿瘤的染色体重排通常较为中度。底部：全染色体丢失主要发生在分娩患者的WT肿瘤中。蓝线：删除，绿线：插入，紫色线：反转，红线：重复，黑线：移位，蓝色框：LOH/丢失，红色框：增益。c本文给出了产妇肿瘤的平均断点数、丢失区的总长度、增益区的总长度以及丢失区和增益区的合并长度。对所有1935个肿瘤(紫色)和分别给出了结果。MED 12(鲑鱼)和WT(绿松石)肿瘤。给出了平均95%的自举置信区间。在所有的比较中，肿瘤基因组AI区的平均长度在分娩组高于无产妇组。提供了源数据。

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统计数据列于表中。1以及补充图中的完整模型。1–3。简而言之，损失和收益区域的总长度与平价显著相关(P < 0.001, rate ratio (RR) = 1.32, 95% CI: 1.15–1.52, Bonferroni adjusted). The association remained significant within the MED12 tumors (PRR=1.39 95%CI：1.05~1.84)。

40个肿瘤至少有一个完整的染色体丢失。在这些肿瘤中，只有两个(5%)是MED 12变异了。在19例肿瘤中，最常见的缺失是22例，其次是13例和14例。WT肿瘤整体染色体丢失与胎次呈显著正相关(P比值比(OR)=1.64，95%CI：1.13-2.36)。见附图。4全模特的。在无生育的患者中，只有一个肿瘤显示整个染色体丢失(如图所示)。3B).

a所有1935年肿瘤的CCR状态摘要(紫色)，按病人的胎次分层。类似地，CCR状态在MED 12突变肿瘤(鲑鱼)和WT肿瘤(绿松石)。b全染色体丢失与产次的关系。c，CCR肿瘤中的断点数，由零生子分层(n=45个肿瘤)和分娩病人(n=134例肿瘤。橙色点描绘MED 12突变的肿瘤，绿色的WT肿瘤。值得注意的是，所有具有高断点数的ULS都来自于分娩患者的WT肿瘤。平均断点数为13.0(95%CI：10.93~15.79)和18.17(14.74~22.14)。d，给出了平均断点数、损失区域的总长度、增益区域的总长度以及损失和增益区域的合并长度。MED 12CCR肿瘤(n=52)n=36)和无生育的病人(n=16)。给出了平均95%的自举置信区间。e本文给出了WT-CCR肿瘤的平均断点数、损失区的总长度、增益区的总长度以及损耗区和增益区的合并长度(n=127)。n=98)及无生育病人(n=29)。给出了平均95%的自举置信区间。提供了源数据。

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鉴定复杂染色体重排

在38个全基因组测序(WGS)ULS中的CCR事件是现成的。17。我们研究了有无CCR的WGS样本中的DSB数以及各自的SNP阵列数据，并将CCR准则外推到所有SNP阵列样本中。SNP阵列分析发现179例肿瘤(占1935的9.3%)与CCR相一致.平均断点数和拷贝数损失和收益的总长度在补充表中报告。2无论是CCR肿瘤还是无CCR的肿瘤，均以胎次和亚型分离。MED 12突变阳性肿瘤在ccr肿瘤中的比例较低(179例中占29.0%)，这与我们之前的研究结果一致。17.

用长读WGS对43例肿瘤进行了基于SNP阵列的预测CCRs的验证.3个肿瘤(7%)未显示相互关联的重排，40例(93%)显示至少一个CCR事件(补充图)。5和补充表3)。三种有CCR的肿瘤和不同的染色体损伤模式如图所示。2B.

UL中的CCR与奇偶校验相关联

胎次与CCR事件显著相关(图1)。3A, P < 0.001, OR = 1.29, 95% CI: 1.09–1.52). The association remained significant within the MED12 tumors (Fig. 3A, P=0.006，OR=1.47，95%CI：1.07~2.0)。混杂变量--年龄、吸烟状况、更年期状态和口服激素避孕药的使用--与CCR无关。见附图。6–8完整的模型描述。在179例受CCR影响的肿瘤中，分娩组肿瘤的断点数大于无产妇组：16例断点超过28点的肿瘤均来自分娩患者(图1)。3C)。CCR肿瘤的AI总长度如图所示。3D，e.

肿瘤部位对等位基因失衡的影响

关于1451个肿瘤的肿瘤位置和大小的信息。1142例MED 12肿瘤中，壁内肿瘤占76%，浆膜下肿瘤占15%，粘膜下肿瘤占9%。309例WT肿瘤中，壁内肿瘤占87%，浆膜下肿瘤占6%，粘膜下肿瘤占7%。1B)。在MED 12肿瘤中，与壁内肿瘤相比，浆膜下肿瘤的染色体丢失区域长度较短(P=0.001，RR=0.28，95%CI=0.11-0.72，补充图。9和补充表4)。肿瘤大小与AI长度无关。

机械力诱导肌层细胞DNA损伤

利用患者源性子宫肌瘤的原代细胞培养和相应的正常子宫肌层，研究了机械拉伸对子宫肌瘤的影响。将26%伸长率的静态拉伸作用于柔性膜上培养24~48h，有无恢复期。4A)。释放拉伸后，光镜初步评价显示非拉伸对照细胞呈现典型的拉长形态，而拉伸细胞则呈现较小、较圆的形态。固定和免疫荧光染色后，用高含量共聚焦显微镜对细胞进行硅分析。这些细胞的有代表性的视野如图所示。4B。在每次染色的图像分析中，平均识别出483个细胞核(中位282个核；每染色183-571个四分位数范围；图)。4C详见附图。10和补充表5).

用γH2AX阳性核(>10γH2AX病灶)与非拉伸对照细胞比较，评价DSBs在拉伸细胞中的损伤程度。以电离辐射(IR)为阳性对照的子宫肌细胞和平滑肌瘤细胞的γH2AX阳性核数均预期增加(OR=33.1和OR=11.9；两者均为阳性对照)。P < 0.0001; Supplementary Fig. 11)。拉伸使平滑肌瘤和肌层细胞中的γH2Ax阳性细胞核增加幅度较小，但非常显著(OR=1.6和P < 0.0001; Fig. 4D和补充图。12)。这种反应取决于治疗时间；平滑肌瘤细胞在拉伸24h后第一次检测到明显的DNA损伤，呈双相模式，而肌层细胞则在随后的两个时间点出现明显的dna损伤(补充表)。7)。DNA损伤的增加与DNA修复的增加是一致的(图一)。4E)。非同源端连接(Nhej)是γh2ax(>10个病灶)和53bp(>5个病灶)双重阳性的细胞核，是肌层(OR=1.5)和平滑肌瘤(OR=2.0；两者)的主要修复机制。P < 0.0001; Fig. 4E和补充图。13)细胞。RAD 51(>5个病灶)和cyclinA 2(细胞周期S/G)双阳性核2)，表明同源重组(HR)，是罕见的IR(补充图)。11)和拉伸实验(补充图。14，补充图。15)，实验条件间无统计学差异。加在一起，机械拉伸导致DNA损伤和NHEJ修复(补充表)6).

肌层和UL细胞在拉伸后细胞密度下降。P < 0.05; Fig. 4C)。这并不是由于细胞凋亡(以Caspase-3的阳性裂解来衡量)，而细胞凋亡主要表现为减少，这可能是由于拉伸所产生的额外空间(补充图1)。16)。拉伸对细胞衰老无总体影响(P14ARF)(附图)。17)，可减少增殖细胞(细胞核Ki 67病灶)的数量(补充图)。15和18)。对细胞周期素A2阳性核数，即S期细胞数无一致影响(附图)。15和19)。值得注意的是，即使在拉伸48h后，仍有相当比例的存活细胞(25-37%)仍在增殖。有关CyclinA 2、Ki 67、cCasp3和p14ARF的数据汇总在补充表中。8。分段核成像数据显示，拉伸后核团圆度高于<10γH2AX病灶(P<0.0 5)。P < 0.0001; Supplementary Fig. 20核区γH2AX阳性拉伸细胞略有增加。

分娩与子宫平滑肌肉瘤风险无关

对399例Ulms患者和1657例配对对照的人群分析显示，两者之间无统计学意义(OR=1.03；95%CI 0.96~1.11；P在奇偶和Ulms之间=0.38)。

受限的细胞环境是最近提出的染色体损伤的来源。2,7,24。研究还表明，在机械应力作用下，许多细胞是可行的。7因此，损伤引起的染色体畸变可以传递到子代细胞上。我们推测，这种现象的痕迹可能在分娩的妇女子宫肌瘤中检测到，因为子宫肌层细胞在怀孕和分娩期间暴露在机械力下，染色体畸变有可能导致肿瘤的生长。我们的数据表明UL的染色体断裂与胎次密切相关。我们研究了由于拷贝数变化而改变的基因组的总长度，这是基因组不稳定的一个常用的代名词。25,26，以及类似于色蓟马症的复杂染色体重排的发生。这两种DNA损伤类型均呈正相关。考虑到导致结构和数值染色体不稳定的机制可能是不同的。27我们分析了整个染色体丢失的发生，并发现这些与胎次显著相关。由于染色体不稳定是包括Ulms在内的许多癌症的一个既定特征，我们检查了这一恶性肿瘤的发生与胎次的关系，结果为阴性。而我们基于人口的Ulms病人系列是广泛的，考虑到这种情况的罕见性。22,23它的功率仅限于大效应(OR≥1.5)，需要更广泛的材料来全面解决这个问题。与平价相关的Ulms可能增加的风险很可能很小，如果有的话。

我们利用静态拉伸原发性子宫肌层和平滑肌瘤细胞的方法，实验研究了类似于怀孕期间观察到的力量是否有可能引起DNA损伤。拉伸后的细胞DNA损伤明显增加，同时发现NHEJ可诱导DNA修复。这一结果与先前观察到的循环机械张力的结果是一致的，这导致了γh2ax焦点在椎间盘内核的增加。28。此外，循环拉伸曾被证明能增强(虽然不是诱导)心肌细胞的核破裂和DNA损伤。4。在我们的实验中，拉伸会导致细胞密度下降，在没有凋亡的情况下，一个可能的原因是拉伸后细胞的增殖受到损害。尽管如此，细胞的增殖亚群在挑战后仍然存在，并且在这些短期实验中没有诱导细胞衰老。

修复双链断裂的主要途径29NHEJ是拉伸诱导的主要修复机制，而HR介导的修复在照射后和拉伸后均不常见。由于nhej不使用互补模板，因此dna重复序列的两个断裂末端的融合，不具有或有限的同源性，可能导致碱基对的缺失或插入以及其他重排。30,31...因此，在拉伸诱导的dna损伤后，偶尔将基因改变传递给子代细胞似乎是可以想象的，尽管短暂的原代细胞培养阻碍了长期随访。这可能会增加在机械拉伸后发生ULS的风险。需要进一步的研究，以澄清是什么机制导致人类子宫内膜和ULS的低心率。

在玻璃上培养的阳性对照细胞比柔性膜上的拉伸细胞具有更强的诱导γH2AX病灶的能力。与这些观察相一致，增加细胞培养基质的硬度有利于DNA损伤和核层A敲除细胞的核破裂。4,5。在这个模型中，细胞在刚性基质上的扩展会导致高核曲率的局部位置，促进活成像中的核破裂和降低核圆度。5。在我们的实验装置中，细胞在拉伸释放后被固定，拉伸后DNA损伤阳性的细胞呈增加的圆形。虽然这些观测结果可能与拉伸或恢复过程中发生的核变形有关，但详细的机制仍有待于今后的研究加以阐明。有趣的是，即使在没有核包膜破裂的情况下，核变形也会在细胞压缩或通过紧密空间迁移的情况下，通过复制应力造成dna损伤。9。总之，细胞核对几种类型的机械应力是敏感的，引起的反应取决于细胞类型、培养基质以及这种应力的类型、强度和持续时间。

由于子宫肌层在多种不同的强大信号作用下，要全面了解胎儿与染色体损伤之间的关系还需要更多的工作，而在妊娠和分娩过程中对子宫肌层核的直接作用似乎是导致我们在原发性肿瘤中发现的一个可能的因素。众所周知，受限环境通过多种不同的机制使细胞易受DNA损伤(Shah等人对此作了综述)。3)：放线肌球蛋白收缩能力增强造成的损伤--核包膜破裂的一个已知关键因素6-这一点在分娩时最为突出，在怀孕期间，核变形和随后的核包膜损伤都是合理的可能性。即使在不损坏核包膜的情况下，dna也可以发生机械剪切。3。核变形和NE断裂是极端条件下常见的现象，染色质通过核层突出，使DNA暴露于细胞质中，造成DNA损伤。Ne断裂还使DNA暴露于细胞质核酸酶中。与微核形成类似的一种特别有趣的损伤形式是，去甲肾上腺素破裂后，染色质可以变得碎裂，并与细胞核分离。6。这可能会导致在ULS中观察到的CCR变化。17。NE破裂后的染色体片段在有丝分裂过程中也可能分布不均匀。事实上，有缺陷的核膜被认为是卵巢癌非整倍体的主要原因之一。32。此外，机械力与肌层中的其他线索协同工作；例如在缺氧期间。33.

虽然我们的结果坚定地联系在染色体损伤UL，进一步的研究，以检查机械力是否在这一关联中发挥了作用。而机械力最近被确定为一种能够引起dna损伤的因素。3，据我们所知，它与常见肿瘤的发生无关。它对子宫肌层和其他组织中肿瘤变性的潜在贡献是一个有趣的新的研究途径，有助于更全面地理解肿瘤的发生。