多区域外显子测序显示外科手术切除的小细胞肺癌瘤内异质性

小细胞肺癌(SCLC)是一种高度恶性肿瘤，最终难以治疗。瘤内异质性(ITH)可能导致治疗失败。然而，小细胞肺癌中ITH的程度尚不清楚。本文对40例Ⅰ~Ⅲ期小细胞肺癌患者的120例肿瘤标本进行多区域全外显子测序.最常见的突变基因是TP 53(88%)和RB1(72%)。我们观察到中等水平的突变异质性(0.30，0.0~0.98)和肿瘤突变负担(TMB，10.2突变/Mb，范围1.1~51.7)。我们的SCLC样本在所有患者中也表现出体细胞拷贝数变异(CNV)，平均CNV ITH为0.49(0.02~0.99)。从突变分布、ITH、TMB、突变簇和基因标记等方面来看，合并SCLC患者的表现与单纯SCLC患者大致相同。这种情况也存在于吸烟患者和EGFR突变患者中。较高的TMB与更好的无病生存率有关，而单核苷酸变异ITH与整体生存率较差有关，因此这些特征可作为SCLC预后的生物标志物。这些发现共同证明了外科切除的小细胞肺癌瘤内遗传异质性，并提供了对治疗耐药的见解。

肺癌是世界上最常见的癌症，15%的患者被诊断为高侵袭性和转移性小细胞肺癌(SCLC)。1。约有三分之一的小细胞肺癌患者有局限性疾病(LD)，其余的患者在最初诊断时被诊断为广泛性疾病(ED)。ED SCLC的5年总生存率(OS)低于7%。2。对于SCLC患者来说，在过去的十年里，治疗方式并没有取得显著的进展。虽然绝大多数患者在初次治疗时对化疗和放疗敏感，但所有患者都不可避免地面临着化疗耐药性和疾病进展的两难境地。3。近年来，免疫疗法被批准用于ED SCLC的综合治疗。4,5,6,7,8。然而，复发、耐药和癌症作为死亡原因在SCLC的过程中仍然很常见。对于这种顽固不化的恶性肿瘤，如何改善患者的预后仍然是一个未得到满足的需求。

抗肿瘤治疗失败的一个重要因素是肿瘤内异质性(Ith)，它指的是同一肿瘤标本中不同的肿瘤细胞群(具有不同的分子和表型)，导致肿瘤生长速度、侵袭能力、药物敏感性和预后的差异。9。下一代测序(NGS)技术在肿瘤基因组变异研究中得到了广泛的应用，并在ITH研究中显示出优异的能力。例如，在TRACERx(TRACERx)肺研究中，对100例早期非小细胞肺癌(NSCLC)患者采用多区域全外显子测序(MRS)的肺癌组织进行多区域取样，发现患者中普遍存在ITH和拷贝数变异(CNV)。ITH与预后密切相关，为后续的肿瘤基因组研究提供了参考。10。阐明SCLC的异质性有助于我们更好地理解疾病管理。最近的一项研究发现，化疗导致ITH升高，导致ED SCLC的多种耐药机制的发展。11。然而，由于缺乏肿瘤样本，未进行化疗的LD SCLC患者的ITH仍不清楚。

本研究通过对40例小细胞肺癌120例标本的全外显子序列分析，为外科手术切除的小细胞肺癌提供肿瘤内遗传异质性景观。我们描述了它们的突变负担、异质性、进化和潜在的生物标志物。小细胞肺癌中存在大量的瘤内遗传异质性。我们进一步确定了几个异质性相关的预后生物标志物。

病人特征

本研究包括40例手术切除的小细胞肺癌患者，其中6例诊断为联合小细胞肺癌(C-SCLC)。大多数SCLCs(34/40)为纯小细胞肺癌(P-SCLC)。表1显示患者的临床特征。年龄中位数为62岁。大多数患者为男性(35，87.5%)，有吸烟史(31，77.5%)。所有患者均接受了手术，中位肿瘤大小为22.5mm。约65%的患者术后接受进一步治疗。中位随访时间22.82个月后，15例(15例，38%)死亡.

40例SCLC患者多区域序列分析

我们对120例福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)小细胞肺癌标本(每例3个区域)进行了MRS检测，共鉴定出33,153例非沉默的体细胞突变，平均测序深度为252×测序深度(补充数据)。1)。我们发现每个病人平均有340种突变(范围33到1552)。小细胞肺癌的中位多区域肿瘤突变负担(TMB)与我们队列中的单区域突变负担(TMB)和肿瘤基因组图谱(TCGA)(补充图)相似。1A，Mann-Whitney-Wilcoxon检验p>0.05)。TMB与肿瘤新抗原负荷(TNB)呈正相关(Spearman‘s相关系数)，r=0.59，p < 0.001; Supplementary Fig. 1B)。最常见的突变基因是TP 53(88%)和Rb1(72%)为克隆突变；LRP1B (22%), PCLO(15%)KMT2D(15%)为亚克隆突变。1A，补充图。2C，补充数据2)。C>T和C>A在这些患者中丰富(补充图)。1C，d)。年龄相关的，BRCA 1/2-相关的、烟草相关的和黄曲霉毒素相关的信号也是这些患者的主要突变信号(图一)。1A)。年龄相关的、黄曲霉毒素相关的和dna修复相关的标记是分支中的最高签名，而年龄相关和吸烟相关的标记是主干中的主要签名(补充图)。1E，f).

aSCLC的突变景观(n=40)。突变基因频率>15%涉及以前报道的重大突变基因在小细胞肺癌中显示在每个区域的病人。上游，TMB计数；中间，驱动程序突变热图；较低的突变特征。b每例患者的克隆和亚克隆突变计数(n=40)。c每个病人的亚克隆突变百分比(n=40)。SCLC小细胞肺癌，P-SCLC纯小细胞肺癌，C-SCLC联合小细胞肺癌，SNVS单核苷酸变异，CDS编码序列。

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非沉默突变分布显示ITH在SCLC患者中有显着性差异(图一)。1B)。百分比从17%到100%不等(如图所示)。1C)。我们发现我们的小细胞肺癌具有中等的突变异质性(0.30，0.12-0.56)，而P-SCLC和C-SCLC的SNV ITH与TRACERx研究的NSCLC没有显著差异(P>0.05)。p=0.065和p=0.32)10(无花果)1C和补充图。2B)。我们还展示了10条常见的致癌信号通路中突变的分布。12(补充图。2G)，并确定了TP 53和RTK-RAS-ERK信号通路主要是克隆突变。

CNV瘤内异质性研究

小细胞肺癌在第1、12、18、19、20、3q、5p、6p和8q染色体上存在扩增，在第4、10、3p、5q、13q、15q、16q、17q、21p和11q染色体上有缺失。2A，补充数据3–5)。显著扩增的区域包括1p34.2(海尔)，1q21.3(APH1A)，2p24.3(MYCN)，3q29(PIK3CA)，第5页13.2(IL7R)，6p22.3(E2F3)，8q24.21(MYC)，以及第9p24.1页(CD 274, PDCD1LG2)以及已删除的区域3p12.1、4q13.2、5q35.3、9q21.11(CBWD 3)，10q23.31(PTEN)，13q14.2(Rb1)、14q11.2、15q25.3(NTRK 3)，第19p12页(ZNF 429)和22q11.1(图1)。2B，c)。使用CNVITH，在小细胞肺癌中的中位数为0.485(0.02-0.99/扇区)。二维空间)。其中，IL7R, PIK3CA, SETDB 1, TERT, SEPT 9, MYC, CEBPA，和CD 274基因被放大为经常重复出现的克隆基因，而缺失的克隆基因如CBWD 3, Rb1，和PTEN在我们的病人中被确认(补充图)。2E).

aGISTIC2.0鉴定的ARM水平CNVS在SCLC中的应用(n=40)。错误发现率(FDR)校正p值代表着本雅明-霍奇伯格测试的重大变化。b基因组染色体图描绘了由GISTIC2.0鉴定的显著的细胞带。c单个患者的每个区域均显示单纯SCLC和联合肺癌的显著躯体局灶CNV。细胞带的基因涉及宇宙驱动和那些发生在至少50%的病人。d每名患者在CNV主干和分支中的计数；每名患者的分支CNV所占百分比(n=40)。SCLC小细胞肺癌，放大器放大，DEL缺失，CNVS拷贝数变异。

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克隆进化与途径富集

我们还根据在多个区域检测到的体细胞突变构建了系统发育树。图形3A显示每个病人的系统发育树，根据他们的疾病分期。特别是，TP 53, EGFR，和CREBBP突变是小细胞肺癌进化过程中常见的早期克隆事件。3B)，同时Rb1其他突变为晚期克隆事件。一般情况下，在克隆突变和亚克隆突变中，乘客突变比例高于驱动突变(癌基因和TSG，图)。4E).

a每个病人的系统发育树(n=40)按阶段分层。b所有患者的进化模式(n=40)。P-SCLC纯小细胞肺癌，C-SCLC联合小细胞肺癌，GD前基因组加倍.

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比较aSNV ITH，bCNV ITH，cTMB，d纯小细胞肺癌之间的平均TMB(n=34)和联合肺癌(nEGFR突变体(n=7)，以及野生型(n=33)，以及吸烟(n=31)及非吸烟(n=8)子群。p来自双边Mann-Whitney的值U测试一下。方格表示为中心线，中位数；框限，第25和75百分位数；延伸的胡须代表1.5*四分位数范围内的上下值。e, f司机基因、乘客基因和其他基因在主干和分支中所占的比例。p双边费舍尔精确测试的数值。SNV单核苷酸变异、CNV拷贝数变异、ITH瘤内异质性、P-SCLC单纯小细胞肺癌、C-SCLC联合小细胞肺癌、TMB肿瘤突变负担、TSG抑癌基因。

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基因改变与临床特征的相关性

ITH与病理、吸烟史、EGFR突变状态和肿瘤分期。4A，b，补充图。二维空间)。在EGFR突变，三例患者携带非经典EGFR突变(p.G652W，p.E114Q，p.Q701L溶胶p.R108K；补充数据)64例发生经典突变(P.L858R和EX19del)。经典EGFR2例(5.9%，2/34)P-SCLC和2例(33%，2/6)C-SCLC患者发生突变.在我们的队列中，我们发现EGFR突变与TP 53失活Rb1灭活(突变和/或损失)(补充数据)6)。这个TP 53/RB1/EGFR小细胞肺癌的突变与临床(肿瘤分期和肿瘤大小)、基因组特征(TMB、ITH和WGD)无关。6A)。有趣的是，EGFR/RB1/TP 53突变型患者的倍性高于野生型(p=0.017)。和WGD发生在所有的EGFR/RB1/TP 53突变患者(附图)6A)。此外，这些突变与无病生存(DFS)或OS在术后没有或有治疗的情况下无关(补充图)。6B，c).

补充图3还有无花果。5A在这个队列中显示基本的临床病理信息。P-SCLC/C-SCLC，吸烟者/非吸烟者，EGFR突变型/野生型的ITH、TMB和突变簇水平相近，在基因标记和突变景观上没有差异(图二)。4，补充图。4B，c)。值得注意的是，单因素分析显示，高TMB/簇与较好的DFS相关，而SNV ITH与OS相关(图1)。5B，c)。但DFS、OS与TMB、突变簇、肿瘤分期无明显相关性(图5)。5B，c，补充图。6d，e)。在一项经年龄、肿瘤大小、肿瘤分期和吸烟状况调整后的多因素分析中，只有TMB/集群与较好的DFS相关，SNV ITH也与SCLC的OS恶化有关(图1)。5D，e).

a显示每个病人的临床信息和基因组特征的热图(n=40)。Kaplan-Meier图描述了对无疾病生存的估计。b)和整体生存(c)每个簇的参数包括SNV ITH、CNV ITH、突变簇和TMB。这个p用双面对数秩检验确定其值和危险度.无病生存的多元协变量Cox回归分析(英文)d)和整体生存(e)按年龄、吸烟、肿瘤大小、分期、ITH等分组分类。用未配对的双面Wilcoxon秩检验对各亚组进行统计比较.WGD，全基因组复制，GII基因组不稳定性指数，MSI微卫星不稳定性，SNV单核苷酸变异，CNV拷贝数变异，ITH瘤内异质性，P-SCLC纯小细胞肺癌，C-SCLC联合小细胞肺癌，TMB肿瘤突变负担，HR危险比，CI置信区间。

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所有复发病例均接受全身化疗。根据患者的复发情况和全身化疗情况，未发现ITH差异(附图)。6f)。在复发病例中，ITH和TMB/群集与生存结果无关(p>0.05，n=11，附图。6g)。接受全身化疗的病例有一个更好的整体结果(补充图)。6g)，提示术后化疗在小细胞肺癌治疗中的有利作用。

许多小细胞肺癌患者对初治很敏感，但所有的患者都不可避免地面临着化疗耐药的困境。据推测，ith在治疗小细胞肺癌中很常见，有许多耐药亚克隆。13。然而，由于缺乏有效的肿瘤样本，这一空白仍然存在于SCLC的研究领域。此外，该领域的研究主要是利用传统的基因组测序方法，即无法捕捉到完整的基因组景观的单一位点。14。MRS对小细胞肺癌ITH的评价较好。因此，我们对一组手术切除的SCLC患者进行了MRS检查。SNV和CNV广泛存在ITH，不同患者ITH评分中等。这种普遍存在的ITH甚至在早期就表明了SCLC复杂的基因组格局，说明了当前治疗的困境，如疾病的快速发展和难治性疾病的复发。

对于体细胞突变来说，TP 53和Rb1突变率最高15。这与目前的研究相吻合。以往的单区域测序显示小细胞肺癌中存在广泛的肿瘤特异性基因组改变，如TP 53和Rb116,17,18。它们也是MRS数据中发现的最常见的克隆突变，即TP 53和CREBBP，几乎完全是早期克隆事件。我们队列中的大多数患者都携带了亚克隆突变，包括LRP1B, KMT2D，和PCLO，随机出现在不同区域。同样的现象发生在CNV事件中，但并非所有CNV事件都存在于同一样本的每个组织中。这突出了单区域测序的局限性，并强调了MRS的优势，以便更好地理解精确医学中的基因组景观。

EGFR突变在新小细胞肺癌或转化为小细胞肺癌的病例中是罕见的。EGFR-突变体(EGFR-MT)腺癌19。在我们的研究中，经典的频率EGFRP-SCLC突变率为5.9%.这些数据与以前报道的台湾人2.6%和中国人2.0%的报告相比较19,20。我们的EGFR-突变型SCLC患者未接受EGFR-TKI治疗EGFR突变状态与术后复发无关(附图)。三维空间)。阿EGFR在我们的分析中，突变被认为是一个早期的克隆事件(图)。3B)。然而，低司机占主导地位EGFRScore不支持它在SCLC中作为驱动基因的作用，而后者不同于普通的NSCLC(补充图)。4A)。换句话说，EGFR突变不是SCLC的主要驱动基因。目前，没有针对性的治疗EGFR突变型SCLC新时代的大多数人EGFR-mtSCLC对EGFR-TKI治疗耐药，与EGFR-mtnSCLC21，这可能是因为更多地关注驱动基因。“EGFR“而忽略乘客突变的影响。EGFR乘客突变也可能协同驱动突变触发小细胞肺癌的肿瘤发生。以前的研究人员已经证明EGFR/RB1/TP 53是EGFR-TKI治疗后非小细胞肺癌转化为小细胞肺癌的关键事件。22,23。在我们的治疗中--天真的SCLC队列中，我们还发现EGFR突变与TP 53和Rb1突变。EGFR/RB1/TP 53突变患者有WGD事件，其倍性高于野生型(附图)。6A)。然而，TP 53/RB1/EGFR突变与临床病理特征无关，与预后无关。基于Swanton等人提出的肿瘤进化算法模型。10，我们授予TP 53和EGFR突变是SCLC进化的早期事件，而Rb1突变和丢失发生后，间接暗示了一个关键的作用Rb1小细胞肺癌进化中的失活然而，这一假说需要在进一步的研究中加以验证。

我们试图探讨ITH评分与临床病理特征之间的关系。在这项研究中，我们对六位C-SCLC患者特别感兴趣.综合研究表明，这组患者在突变分布、ITH、TMB、突变簇和基因标记等方面与P-SCLC患者表现相似。这种情况也存在于EGFR突变和有吸烟史的人。在诊断出的SCLC患者中，大多数患者有吸烟史。我们特别关注非吸烟性小细胞肺癌患者的进化树，发现与吸烟者相比没有明显差异(补充图)。5)。小细胞肺癌基因组的瘤内异质性在一定程度上与病理类型、吸烟史、驱动基因突变状态等共同的临床病理特征无关，但肿瘤内异质性仍存在相对一致的中度异质性。先前的一项研究报告广泛的ITH在化疗治疗的SCLC，并发现它可能导致不良的治疗反应和预后。我们观察了SNV ITH在治疗天真的LD SCLC患者中的同样表现.多变量COX分析支持SNV ITH对OS的独立预后作用。我们将目光转向另一种肿瘤异质性评估算法，即每簇TMB，这似乎是另一个潜在的预后生物标志物。我们发现更多的TMB与早期疾病复发和进展有关。这表明肿瘤内的复杂突变可能导致抗癌治疗的失败。需要进一步研究其与治疗敏感性和抗药性的关系。

虽然我们的研究提出了一些发现，但也有一些局限性。首先，如果有更多来自其他中心的病人，我们的结果会更可靠。与我们有限的样本有关，我们没有对每个病人进行动态基因组监测。我们也不能更好地了解SCLC的肿瘤微环境。此外，我们应该注意到，测序数据中存在技术噪声是很常见的，而真正的肿瘤内基因异质性很难与这些测序伪影区分开来。24。这可能导致对ITH的高估。因此，我们使用了两种变异调用算法和严格的标准来过滤掉这些私有工件，并将工件的影响降到最低。25,26。由于样本的不可用性，我们无法在同一样本中验证我们的结果。然而，为了准确量化ITH，需要进行更深入的研究。

我们展示了手术切除的SCLC的ITH景观。尽管存在中度突变负担，但SCLC在早期表现为中度瘤内异质性，SNV和CNVITH较高，这可能是SCLC患者面临治疗困境的原因之一。