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Δ133 p5 3β亚型对癌细胞侵袭活性的调节是通过一种聚集依赖机制来实现的

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发表时间:2021-09-16 10:02作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

P53亚型Δ133p53β在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用。在此,我们报告了Δ133 p53β的活性是通过一种聚集依赖的机制来调节的。在癌细胞和肿瘤活检组织中观察到Δ133 p53β聚合体。Δ133 p53β聚集依赖于与包括p63家族成员或cct伴侣复合体在内的相互作用伙伴的关联。CCT复合物的缺失促进了Δ133 p53β聚集和Δ133 p53β依赖的癌细胞浸润的丢失。相反,与p63家族成员相关的是从聚集体中招募Δ133 p53β,从而增加其细胞内迁移率。我们的研究揭示了p53亚型癌进展的新机制,这种机制是通过与p63亚型或CCT伴侣复合体等特定的合作伙伴结合,通过聚集隔离和招募来调控的,这些机制对EMT、迁移和侵袭等癌细胞特征有重要影响。

导言

P53失活是肿瘤发展中常见的事件。约50%的人类癌症在TP 53,而在其他情况下,p5 3通路被其他机制灭活。1,2。突变后,p53不仅停止提供抑癌活性,而且成为一种非常强的肿瘤诱导剂。突变的p5 3由于缺乏细胞周期和促凋亡调节而不能维持基因组的稳定性。3,4。此外,p5 3突变体强烈诱导癌细胞迁移和侵袭。5,6.

最近的研究表明,突变的p5 3突变体,特别是结构突变的p5 3突变体,可以产生蛋白质7淀粉样特征8,9。有趣的是,突变体p5 3与p63和p73等一些相互作用的伙伴共同聚集,被认为是其获得诱发癌症进展的功能活性的机制。10。此外,伴侣复合物cct(含tcp 1或tcp-1环复合物)正确折叠p5 3对其在迁移和侵袭中的功能至关重要。11.

这个TP 53基因编码12个不同的异构体产生的替代启动子使用,替代剪接和替代转录起始位点使用(综述在参考文献。12)。P53亚型主要分为四大类,分别为TAp53[α,β]和γ],Δ40 P53[α,β和γ],Δ133 p53[α,β和γ]和Δ160 p53[α,β,γ]。P53亚型是典型p53蛋白(TAp53α-TA代表“transactivation”)的修饰版本,在N-端(Δ40、Δ133和Δ160)被截断,或具有不同的C端寡聚体结构域(α,β或γ)。越来越多的文献表明p5 3亚型参与了细胞周期进程、细胞程序性死亡、复制衰老、细胞分化、病毒复制和血管生成的调控。13,14,15,16,17,18其中一些被解除了对人类肿瘤的管制19。例如,Δ133 p5 3在小鼠模型中的过表达被报道通过持续炎症参与了肿瘤的形成,并以一种依赖于IL-6的方式参与了肿瘤的形成。20,21以及通过激活JAK-STAT和RhoA-Rock信号通路来促进肿瘤的侵袭。20。Δ133p53亚型和Δ133p53β的异常表达尤其能促进转移性扩散。22与乳腺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌复发风险增加相关,不依赖于TP 53突变20,22,23,24,25。此外,野生型(Wt)Δ133p53β可促进肿瘤干细胞的潜能。26。因此,WTΔ133p53β似乎具有内在的致癌活性,与典型p53蛋白的抑癌功能相对立。因此,WTΔ133p53β亚型的促癌活性与突变的p53蛋白在功能上非常相似。

虽然有大量文献显示p53亚型,特别是Δ133 p53β在肿瘤进展中的重要作用,但其活性的调控尚不清楚。在此,我们发现Δ133 p53β活性是通过一种聚集依赖机制来调节的。采用生化、细胞和计算方法以及重组蛋白体外分析的方法评价WTΔ133p53β的聚集能力。用免疫组织化学方法检测了Δ122 p53转基因小鼠Δ133p53模型小鼠体内的聚集物。27在人类肿瘤中也是如此。

WTΔ133p53β聚集能力与其在癌细胞侵袭和迁移中的活性呈负相关。此外,WTΔ133p53β聚集依赖于与特定调控伙伴的结合。CCT伴侣复合物的缺失与WTΔ133p53β有关,增加了这种亚型的聚集,并消除了该异构体的亲迁移效应。相反,与p63家族成员的结合降低WTΔ133p53β的聚集,并显著调节乳腺癌细胞的侵袭能力。

综上所述,我们的数据通过其聚集能力为Δ133p53β活性的调节机制提供了证据。我们的数据表明聚合和非聚集的Δ133p53β蛋白之间的平衡决定了它在癌细胞中的活性水平。因此,与促进Δ133p53β活性的伙伴(如cct亚单位或p63家族成员)的相互作用,为治疗表达这种异型的癌症转移性疾病提供了有趣的新的治疗机会。

结果

WTΔ133p53β生成细胞聚集体

越来越多的文献表明小的p5 3亚型(特别是wtΔ133 p5 3β)和突变的p5 3在肿瘤进展中的功能相似。21,22,24,26,28。此外,最近的研究表明,结构突变的p53蛋白能够在癌细胞中产生蛋白质聚集物。在这里,我们询问WT,Δ,133p53,β是否也有能力在癌细胞中产生蛋白质聚集物。

为此,采取了多学科办法。我们首先采用改良的westernblot法。由于聚集体比非聚集蛋白具有更强的抗SDS和热变性能力,提取物在42°C或95°C下加热,SDS-PAGE上分子质量向上移动,这与大的多聚体的形成相一致。此外,用共聚焦显微镜直接显示聚集体,然后对Z-栈进行三维重建,进行免疫荧光分析。然后,我们研究了Δ133 p53β聚合体在小鼠转基因模型和人类肿瘤中的存在。最后,我们评估了重组WTΔ133p53β蛋白的聚集能力。

为评价p53及其突变体的聚集形成能力,将表达WT p53、p53R175H或p53R273H的质粒及表达WT和突变Δ133p53β亚型的质粒(WTΔ133p53β,Δ133p53βR175H和Δ133p53βR273H)转染到不含内源性p53的肺癌H1299细胞株中,从而方便了单个亚型特征的研究。我们发现结构p53R175H,但未发现WT p53在42°C时产生聚集物。接触突变体p53R273H也显示出一些很低的聚集形成能力(图一)。1A)。这些观察与文献一致,表明p53突变(包括R175H等结构突变)会影响蛋白质的正确折叠,导致P53蛋白的“变性”,这是聚合的先决条件。另一方面,影响dna结合区(如r273H等接触突变体)的突变不会影响折叠,因此对聚合的贡献不大。29.

图1:P53和Δ133 P53β聚合形成能力的评价。
figure1

a转染WT后H 1299细胞可溶性蛋白组分的westernblot分析,p53和Δ133p53β的结构和接触性突变。n=3。b转染WT后H 1299细胞不溶性蛋白组分的westernblot分析,p53和Δ133p53β的结构和接触性突变。n=3。c转染WT的H 1299细胞共聚焦免疫荧光Z叠加图像的三维重建、结构和接触突变的p53。绿色:α-标志(P53),红色:α-OC(Aβ42,淀粉样聚集物)抗体,蓝色:Hoechst.标尺8μm。n=3。d转染WT的H 1299细胞共聚焦免疫荧光Z叠加图像的三维重建,结构和接触突变的Δ133p53β。绿色:α-标志(Δ133p53β),红色:α-OC(Aβ42,淀粉样聚集物)抗体,蓝色:Hoechst.标尺8μm。n=3。e用Pab 421抗体对Δ122 p53纯合子小鼠组织进行p53(Δ122 p53)定位的免疫荧光分析。黄色:p53(Δ122 p53),蓝色:Hoechst。总共有十个肿瘤Δ122 p53动物模型分析。在上面板箭头显示明显的细胞质聚集,而在下面板箭头显示在弥漫性细胞质染色之间的聚集。标尺50μm。f上面板:RNAScope检测转移性三阴性乳腺肿瘤,表达Δ133p53β。泛素C(UBC)为阳性,细菌基因DapB为阴性对照。下面板:用KJC 8抗体检测转移性三阴性乳腺肿瘤中的Δ133p53β聚集物的免疫荧光分析。框状区域:具有特征染色的区域的数字放大。n=5.标尺20μm。g不同原发或转移性肿瘤及正常乳腺组织中Δ133 p53β聚集表达的免疫组织化学分析。箭头显示明显的Δ133 p53β聚集。标尺50μm。n=5(适用于原发性乳腺癌和相应的脑转移),15例为正常相关乳腺组织n结肠癌脑转移=3。hMBP-Δ133p53β构建的溶液研究。在Superdex 200 16/60上注射重组MBP-Δ133p53β的大小排斥色谱(SEC)图谱。峰的最大值对应于56 mL的洗脱体积,接近该色谱柱的死体积。根据校准结果,蛋白质的大小估计为440 kDa。在洗脱时间为47 ml(第1行)和56 ml(第2行)时采集SEC样品的SDS-PAGE。所观察到的SDS-PAGE谱带符合MBP-Δ133p53β(67.4KDa)的预期分子量。i。动态光散射(DLS)剖面的最大峰值来自SEC(2)。该剖面显示了一个独特的峰,最大对应的粒子直径为16.7nm,估计分子量为480 KDa。峰宽,很可能与多种不同大小物种的平衡相对应。n=3.箭头表示图中的共同定位。1C和d或汇总图。1E-g。分子量以kDa表示。源数据作为源数据文件提供。

此外,Δ133p53β亚型及其突变体均能形成明显的聚集体,与p53R175H相比,95°C下的β亚型具有更强的抗热变性能力。1A)。为了完成生化分析,我们还检测了不溶性细胞组分.蛋白质提取过程使我们能够从细胞碎片中分离可溶性蛋白质(图中标注为“上清液”)和不溶性蛋白质分数(图中注释为“小球”)。在不溶性蛋白中检测到少量的p53R175H结构突变体,在不溶性蛋白组分中检测到明显的Δ133p53β(图1)。1B).

免疫荧光分析表明,只有结构上的p53R175H突变体才能与淀粉样聚集体部分共定位,这与特异性检测纤维聚集的OC(α-Aβ42)抗体检测到的结果是一致的。1C和补充图。1A)。这与westernblot分析和以前报道的数据一致。8。相反,WT和突变体r273H p5 3蛋白呈扩散核染色,支持先前的发现。10几乎没有与OC(α-Aβ42)标记的淀粉样聚集体共定位。然而,一个明显的点状染色显示Δ133 p53β主要聚集在细胞质中,无论是WT蛋白还是突变蛋白。有趣的是,Δ133p53β聚合体比由p53R175H突变体形成的β聚集物更为明显。与p53R175H聚合体类似,Δ133p53β仅与OC(α-Aβ42)抗体检测到的淀粉样聚集体部分共定位。1C和补充图。1B)。此外,p53R175H与A11抗体检测到的寡聚体部分共定位,识别氨基酸序列无关的蛋白质或肽寡聚体。Δ133 p53β蛋白几乎不存在这种共定位现象,表明突变型p53与Δ133 p53β在结构上存在差异(附图)。1C,d).

我们还评估了WT和突变型Δ133p53β亚型在乳腺癌细胞模型中的聚集形成能力。该癌可分为三重阴性(以强侵袭性MDA-MB-231为代表)、B型(以中等侵袭性MCF 7为代表)、p53突变状态不同的亚型(MCF 7)、结构突变型(SK-BR-3为p53R175H)或接触突变体(mDA-MB-231为p53R280K)。不同的乳腺癌细胞模型可以研究p53突变状态、肿瘤侵袭性和∆133 p53β聚集之间的相互作用。

将Δ133p53β转染MD-MB-231D3HLN和Δ133p53βR175H的MCF-7、Δ133p53βR280K,转染SK-Br-3细胞。如附图所示。2A,在所有细胞系中均检测到聚集物。与H 1299细胞的结果相似,MCF-7和MDA-MB-231D3HLN中Δ133p53β的WT和R280K突变体分别与淀粉样聚集体部分共定位,呈明显的“斑点”型。而SK-Br-3细胞则呈大量的淀粉样聚集体,与Δ133p53βR175H亚型共同定位。由于SK-Br-3细胞也表达了p53R175H蛋白,因此大量聚集在该细胞系中并不令人惊讶。最后,我们通过westernblot分析进一步证明了每个细胞系中聚集物的存在(补充图)。2B).

其次,我们分析了Δ133p53β蛋白在小鼠模型中的表达规律。N-p53末端缺失突变体(Δ122 p53,Δ133 p53小鼠模型),27,30。Δ122 p53结果显示,小鼠的存活率和侵袭性肿瘤谱明显降低,增殖优势明显,凋亡减少,并表现出深刻的促炎表型,暗示了Δ的存在。122 p53是一个占优势的癌基因27。图形1EΔ弥漫性大B细胞淋巴瘤p53免疫组化分析122 p53纯合小鼠。两种主要类型的Δ122 p53定位:主要是细胞质聚集(上面板,图)。1E)或弥漫性细胞质(在某些情况下也是核的)与聚集体混合(下板,图)。1E)。Δ122p53在Δ中的聚集122 p53小鼠模型与表达Δ133p53β的人细胞模型一致。

其次,我们分析了Δ133 p53β在人肿瘤中的表达情况。Δ133p53β在乳腺癌中的表达首次在RNAScope检测。如图上面板所示。1F转移性乳腺癌的mRNA表达阳性。此外,我们应用特异性检测Δ亚型的kjc 8抗体免疫组织化学方法,分析了同一肿瘤序列切片中β133p53蛋白的表达情况。15。与上述结果一致,Δ133p53β亚型在乳腺癌中也有形成蛋白聚集的倾向(图1)。1F下面板和数字放大)。表达Δ133p53β的H 1299细胞与人转移性乳腺癌均有相同的表达模式:部分弥漫性染色与明显的聚合体相邻。更有趣的是,这些人类肿瘤Δ133p53β聚集体大多位于细胞质中,这完全证实了在H 1299细胞株中所得到的观察结果。

此外,我们用KJC 8抗体的免疫组织化学方法分析了不同肿瘤类型中Δ133 p53β蛋白聚集物的表达情况。检测Δ133 p53β在乳腺癌、肺癌、大肠癌及其脑转移中的表达。并对健康相关的乳腺和肺组织进行了分析。如图所示。1g和补充表1在分析的大多数肿瘤中均检测到Δ133p53β聚集物。观察到两种主要的Δ133p53β聚集模式:一些肿瘤聚集分布于整个肿瘤,而另一些肿瘤仅在选定的区域聚集(后者在补充表中用星号突出显示)。1)。有趣的是,在乳腺肿瘤中,与ER+Pr+HER 2阴性腔A亚型相比,侵袭性三阴性和Her 2+亚型中聚集物的存在更为明显(补充表)。1还有无花果。1g)。在三重阴性和Hr~(2+)亚型中,与相应的原发肿瘤相比,脑转移瘤聚集倾向于增加。在正常乳腺和肺相关组织中,除了乳腺样本中一些罕见的散在的正常细胞可能是反映淋巴细胞外,没有检测到聚集物。此外,肺癌和结直肠肿瘤的脑转移呈聚集性,而在原发性肺癌中则未观察到(补充表)。1还有无花果。1g).

我们以前的工作已经证明了Δ133 p53β聚合体在前列腺癌中的存在。25。为了进一步评估这种聚合模式在前列腺癌中的作用,已经发表的对12例前列腺癌进行了RNAseq分析。25用于基因集富集分析。接下来,我们发现与Δ133 p53β相关的转录本与Spearman的相关剪接≥0.3或≤−0.3有关。利用这些转录本进行基因集富集分析(FDR切断<0.05)。Δ133p53β表达的增加与与高寡核苷酸和同型四聚体相关的细胞过程明显相关,证实了Δ133p53β亚型存在于前列腺癌中的聚集现象(补充图)。2C,d)。与Δ133p53β正相关的例子包括RNF 135(泛素E3连接酶),KCTD 5(E3连接酶适配器),福斯(RNA结合蛋白),TRPM 2(通过蛋白质聚集参与神经变性)和CRTC 2(溶酶体途径)(附图)2E).

所有这些数据表明,Δ133p53β亚型聚集在不同原发肿瘤的阵列中,并在其脑转移中更为明显。较高的聚集性(反映Δ133p53β亚型表达增加)与肿瘤侵袭性有关。

最后,为了检测重组wtΔ133p53β的聚集特性,我们将其与麦芽糖结合蛋白(mbp-Δ133 p5 3β)融合。大肠杆菌(详见“方法”)。亲和纯化后,用大小排斥色谱(SEC)测定MBP-Δ133 P53β的大小。色谱图显示单峰部分重叠于柱的空腔体积,分子量估计为440 kDa,表明纯化后的蛋白与大量的可溶性物质相对应。)。SDS-PAGE清楚地证明MBP-Δ133p53β是与峰最大体积和空隙体积相对应的组分中的唯一组分(图1)。)。用动态光散射(DLS)进一步验证了这些MBP-Δ133p53β寡聚体的大尺寸。最大的尺寸排斥色谱图显示出一个单一的DLS峰对应于直径范围较宽的颗粒(从10到40 nm)(如图所示)。1I)。MBP的切割尝试失败,可能是由于缺乏连接酶的可及性。综上所述,MBP-Δ133p53β的生物物理表征表明,该蛋白在溶液中形成了不同大小的寡聚体。

综上所述,这些数据揭示了WTΔ133p53β蛋白的聚集形成能力。有趣的是,Δ133p53β聚集物似乎不同于由p53R175H所形成的聚合体,因为它们具有更强的抗变性能力,且具有重要的不溶性组分。免疫荧光分析显示,它们既存在于细胞质和细胞核中,也与淀粉样聚集体部分共定位,但不存在中间寡聚体。此外,在表达Δ122p53亚型的转基因小鼠模型中,观察到了相似的聚集和细胞分布。这些观察被一系列人类癌症的染色所充分证实,显示了Δ133p53β在人类癌症中的存在。最后,我们对重组蛋白的体外分析证实了WTΔ133p53β亚型的聚集形成能力。

WTΔ133p53β具有未折叠构象

接下来我们讨论WTΔ133p53β蛋白是如何具有聚集形成能力的。大量文献表明,p53R175H DNA结合域的展开促进了聚集形成能力。这种展开导致具有淀粉样蛋白形成能力的蛋白质区域暴露,这些区域通常被埋没在WT p5 3中。当用于免疫沉淀分析时,单克隆α-p53单克隆抗体Ab240可检测到213-217位的抗原表位。如图所示。2AAb240只检测到p53R175H结构突变蛋白,而未检测到具有接触突变的天然WT、p53或p53蛋白。后两种蛋白具有完整的DNA结合域,表位不能为Ab240所访问。令人惊讶的是,WTΔ133p53β作为p53结构突变体,表现出与Ab240相同的免疫反应性.更有趣的是,突变(结构-R175H或接触-R280K)对WTΔ133p53β对Ab240的免疫反应性没有进一步的影响。2B)。此外,Δ133p53α对Ab240也有免疫反应,提示该亚型具有与p53R175H结构突变体和Δ133p53β亚型相似的未折叠的DNA结合区。此外,我们还能证明WTΔ133p53α亚型对Ab240(补充图)也有免疫反应。5D)。此外,我们还比较了结构突变体p53R175H和WTΔ133p53β对Ab240的免疫反应性。如图所示。2C突变体p53R175H和WTΔ133p53β蛋白与WT蛋白相比,均显著增强了对检测展开事件的抗体的免疫反应性。这些数据表明WTΔ133p53β亚型具有一个与p53R175H结构突变体相似的未折叠的DNA结合结构域。

图2:WTΔ133p53β亚型二级结构的特征。

a单克隆抗体240和CM1在H 1299细胞中对p53、结构和接触突变蛋白的免疫沉淀分析。n=3。b用Ab 240和CM1对H 1299细胞株Δ133p53βWT、结构蛋白和接触突变蛋白的免疫沉淀分析。n=3。c用Ab 240和CM1对H 1299细胞株p53和WTΔ133p53β的结构突变体进行免疫沉淀分析。n=3。dIUPRED程序分析用于预测Δ133p53β蛋白的非结构化倾向。用Waltz预测淀粉样区67-232-237区域(IHYNYM);意大利面68和ZipperDB50-251-257区域(ILTIITL)和具有阈值0.370的ArchCandy33-195-270区域。e用CMview软件实现了WT、p53、DBD的接触图。69使用PDB ID 1 TUP的结构。图的水平轴和垂直轴对应于蛋白质的氨基酸序列,位于两个不同残基交界处的一个点表示与这些氨基酸≤8的两个原子之间的距离的假定接触。二级结构的元素在对角线上以红色表示。Δ133p53β缺失的前39个残基由一个粉红色的矩形区域勾勒出来。C终端α螺旋由地图左下角包围的联系人簇稳定.这些接触大多来自于缺失片段中的残基。在这些接触中,我们区分了哪些在α-螺旋稳定中起关键作用的:T 125-G 279(红色),L 130-L 289(绿色),K132-E 285(蓝色)。f放大N端区域和C端α-螺旋之间的接触.与重要接触有关的侧链被着色。g左面板:P53、DBD的三维结构,N端94-132为洋红色,C端为α-螺旋(276-289)为蓝色。中面板:P53 DBD表面。右面:Δ133p53β亚型结合区的假想表面。表面由氨基酸残基的疏水性进行颜色编码,使用参考文献中的刻度。70。为了便于比较,这三种结构都有相同的方向。结构上的椭圆形区域表示DBDβ夹层褶皱疏水核的面积。利用PyMol程序生成和分析了p5 3 dbd的截断结构。71。分子量以kDa表示。源数据作为源数据文件提供。

此外,计算分析表明WTΔ133p53β蛋白具有明显的展开作用。Wt p5 3由一个结构良好的中央dna结合域(Dbd)(残基94-294)组成。31两侧有两个本质上无序的区域。N端侧翼区(残基1-93)代表转录激活区,在与转录因子结合时采用固定构象.C端四聚结构域(残基325~355)在均聚反应中形成结构.与WT p53相比,WTΔ133 p53β亚型不存在N端反激活区,C端四聚结构域的主要部分被截断。此外,WTΔ133p53β亚型没有中央DBD的前39个残基(图1)。二维空间)。在硅分析中,确定了这种截断对DBD剩余133-294区域结构状态的可能影响。第一个结果是DBD的N端和C端之间的几个关键接触消失了(图1)。2E,f)。例如,K 132和E 285之间的盐桥,L 130与L 289之间的相互作用,T 125和G 279之间的相互作用,如图中圆圈所示。2E。因此,在Δ133p53β亚型中,C端α-螺旋是dbd界面的一个关键元件,它可能展开并破坏与dna的结合。此外,还利用IUPRED程序对p53蛋白进行了分析。32表明在全长蛋白中,C端α-螺旋代表了最容易展开的区域(图)。二维空间)。此外,Δ133p53β亚型中N端94-132区的缺失也可能破坏DBD的β夹心核的稳定性。事实上,IUPRED预测这个地区的折叠倾向最高(图1)。二维空间)。在p53DBD结构中,这个N端片段覆盖了DBDβ-夹心结构的疏水核心。它的去除将暴露出疏水残基M 133、F 134、V 135、V 141、V 143、V 145、I 255、L 257、L 265、F 270。2e-g)的β夹心芯到溶剂,导致DBD的不稳定。

这些分析表明,DBD的其余部分要么结构稳定性很低,要么很可能是展开的。如果wtΔ133p5β亚型被展开,这就增加了它的聚集潜力,因为在大多数情况下,在聚集之前必须先展开具有聚集倾向的多肽链。33。我们使用几个程序预测聚集倾向区域的分析表明,WTΔ133p53β序列有许多这样的区域(图1)。二维空间).

这些数据表明WTΔ133p53β具有类似p53R175H结构突变体的未折叠构象。

Cct伴侣复合物对WTΔ133p53β聚集形成能力的调节

为了评价哪些蛋白参与了Δ133 p53β亚型的折叠和聚集,我们采用了高通量的蛋白质组学方法。将Δ133p53β转染H 1299细胞,经免疫共沉淀和蛋白质组学分析,检测到多个伙伴。如附图所示。5E我们能够检测到免疫沉淀的伙伴已经在银染的聚丙烯酰胺凝胶上,所以我们把我们的蛋白质组学分析集中在这个区域,如附图所示。5F。因为伴侣是细胞聚集体在不同环境中的共同组成部分。34,我们重点研究了Δ133p53β的伴侣。有趣的是,CCT复合物是Δ133p53β亚型的合作伙伴。这种复合物不仅参与了新合成的蛋白质的折叠,而且还参与了防止聚集的过程。它由两个由8个平行亚基(CCT 1到CCT 8)组成的叠加环组成。35。免疫共沉淀分析证实了CCT复合物与Δ133p53β亚型的相互作用。3A)。为确定Δ133p53β哪些区域参与细胞间的相互作用,在H 1299细胞中转染Δ133p53β,Δ133p53α或Δ160 p53β亚型后进行共沉淀分析。Δ133 p53β和Δ133 p53α在C端不同,而Δ133 p53β和Δ160 p53β在N端有差异。Δ160 p53β可视为Δ133 p53β的一种缺失形式。5C)。Δ133 p53α与CCT 3亚基结合,但与Δ133 p53β相比亲和力较低。这表明CCT复合物(CCT 3)的第3亚基的C-末端参与了一定程度的相互作用.然而,Δ133p53β的N端27个氨基酸的缺失几乎完全与CCT 3结合,因为Δ160 p53β与此亚基的结合能力较差(如图1所示)。3B)。此外,我们还比较了WT p53及其结构的R175H突变体和Δ133p53亚型与CCT复合物的亲缘关系。如图所示。3BΔ133p53亚型,特别是Δ133p53β,显著增强了其与TA复合物的亲和力。

图3:CCT复合物积极参与Δ133p53β聚集及其活性的调控。
figure3

aH 1299细胞CCT 3亚基与WTΔ133p53β共沉淀分析。n=3。b不同p53和Δ133p53亚基在H 1299细胞中的共沉淀分析。n=3。cH 1299细胞CCT复合亚基缺失的Westernblot分析n=2。d对照和CCT 3、5和7缺失背景下转染WTΔ133p53β后H 1299细胞可溶性蛋白组分的Westernblot分析。n=3。e对照和CCT 3、5、7亚基缺失背景下,WTΔ133p53β转染后H 1299细胞不溶性蛋白组分的Westernblot分析。n=3。f。对照组WTΔ133p53β聚合体和CCT 3、5和7个亚基缺失H 1299细胞株对共聚焦Z-栈三维重建的免疫荧光分析。红色:α-旗帜(Δ133p53β),蓝色:Hoechst.标尺8μm。n=3。gH 1299细胞表达调控、WTΔ133p53β或CCT复合物缺失背景迁移能力的定量研究t=伤口愈合后12小时,n=3.值是三个独立实验的±SEM(误差条)的平均值,每个实验中每个样本有15幅图像(共45幅图像/样本)。用非参数Mann-Whitney进行统计分析。t用棱镜软件(GraphPad)进行测试。全p值<0.0001。hH 1299细胞早期表达WTΔ133p53β的创面愈合迁移相对比分析T=0h)和测试结束(12h)。展示了每三个实验中有一个具有代表性的图像。iH 1299细胞CCT复合亚基缺失的Westernblot分析图中三个实验中有一个具有代表性的免疫印迹。3H显示。箭头表示集合。分子量以kDa表示。源数据作为源数据文件提供。

这些数据表明,Δ133p53亚型的N端是结合CCT复合物的关键。

为了进一步研究CCT复合物在Δ133 p53β聚集中的作用,我们耗尽了该复合物的三个亚基CCT 3、CCT 5和CCT 7(图7)。3C)。CCT复合物的缺失导致Δ133 P53β聚集在可溶性和最明显的不溶性蛋白质组分中显著增加(图1)。3D,e分别)。因此,免疫荧光分析显示,Δ133 p53β聚集物在CCT复杂耗竭过程中具有重要的聚集性(如图1所示)。3F)。同样,cct伴侣耗尽后,wt p5 3全长的聚集积累也被报道。11.

为评价Δ133p53β的聚集状态是否影响其功能,在Δ133p53β亚型的存在或不存在的情况下表达,并评价其对H 1299细胞迁移的影响。而Δ133p53β增加了H 1299细胞的迁移,而shRNA对CCT 2和CCT 3亚基的破坏则完全消除了Δ133 P53β的迁移效应。在不存在Δ133p53β亚型的情况下,CCT复合物的缺失对H 1299细胞迁移能力的基础水平没有影响。3G-I).

为了研究∆133p53β聚集物的调控是否是特定于CCT复合物,还是依赖于与其他伴侣的相互作用,我们测试了HSP 70和Pontin的结合对∆133p53β聚集状态的影响。有趣的是,这两种蛋白只与突变相关,而与WT p53无关。36,37,38,39.

使用免疫共沉淀的方法,我们能够证实Pontin只与突变的p53(补充图)相互作用。3A)而HSP 70只与结构变异的p53R175H(补充图)联系在一起。3B)。将WTΔ133p53β、Contact(Δ133p53βR280K)或结构突变体(Δ133p53βR175H)转染H 1299细胞,进行免疫沉淀分析。所有Δ133p53β蛋白均与Pontin和HSP 70结合,与其突变状态无关(补充图)。3C,d)具有与突变型p53相似的特征。其次,我们比较了Δ133p53β和一个结构型p53突变体与Pontin的亲缘关系。为此,将携带接触突变(R280K)的WT或Δ133p53β转染H 1299细胞,并进行p53R175H结构突变和免疫沉淀分析。如附图所示。3E所有转染的蛋白与Pontin具有相同的亲和力。

为了评估这种关联是否发生在‘自然’细胞背景中,∆133p53β亚型在原始细胞中表达,并进行相同的分析。即在MCF-7细胞中转染WTΔ133p53β,在SK-Br-3细胞系中转染Δ133 p53βR280K,转染MD-MB-231D3HLN,转染Δ133p53βR175H。所有Δ133p53β蛋白在其自然细胞背景中与Pontin和HSP 70相互作用,与其突变状态无关(补充图)。3F,g对于庞丁,补充图。3H-j(用于HSP 70)。

最后,我们评估了Pontin和HSP 70是否参与了Δ133p53β亚型的聚集。为了验证这一点,我们使用ShRNAs对这些蛋白质进行了消减,并在此细胞背景下检测了Δ133p53β的聚集。如附图所示。[图1.3k-m(对于Pontin)和3n-p(HSP 70)]这些蛋白的缺失对Δ133 p53β聚集能力没有重要影响。

所有这些数据都表明CCT复合物对Δ133p53β聚集能力的关键参与,进而对Δ133p53β促进的细胞迁移起关键作用。另一方面,虽然与Δ133p53β亚型相互作用,但Pontin和HSP 70并不参与Δ133p53β聚集。

与p63家族成员的相互作用降低Δ133p53β的聚集

突变型p53聚集体的特点之一是与相互作用的伙伴共同聚集,这严重影响了癌细胞生物学。这就是p53与家族成员p63和p73共同聚集的情况。10。为了研究∆133p53β是否能与p53共同聚集,我们首先评估它是否与该蛋白相互作用。为此,进行了免疫沉淀分析。与WT相关的不同乳腺癌细胞株及突变型p53的∆133 p53α均未检测到∆133 P53β与p53的相互作用(如图1所示)。4A-C)。此外,我们还将此分析扩展到结肠癌细胞株HCT 116(WT,p53)和SW 480(R273H/P309S突变株)。在HCT 116和SW 480细胞株中,∆133p53β与乳腺癌细胞有相同的相互作用伙伴,尤其是CCT复合物和HSP 70,而与p53又没有相互作用(附图)。5A).

图4:与p63家族成员相互作用后WTΔ133p53β的聚集性丢失。

aWTΔ133p53α和WTΔ133 p53β与内源性p53相互作用对MCF-7细胞表达的共同免疫共沉淀分析。n=5。b突变的Δ133p53α和Δ133p53β与内源性p53相互作用对MD-MB-231D3H2LN细胞表达的共沉淀分析。n=5。c突变型Δ133 p53α和Δ133 p53β与内源性p53相互作用对SK-Br-3细胞表达的免疫共沉淀分析。n=5。dWT、Δ、133p53、β和ΔNp 63α共沉淀对H 1299细胞共表达的影响。n=3。eWesternblot分析WTΔ133p53β与ΔNp 63α蛋白共表达对H 1299细胞可溶性蛋白组分聚集形成能力的影响。n=3。fWesternblot分析WTΔ133p53β与ΔNp 63α蛋白共表达对H 1299细胞不溶性蛋白组分聚集形成能力的影响。n=3。g与ΔNp 63α共表达于H 1299细胞共聚焦Z-栈三维重建后WT、Np 63、p53、β聚合体的免疫荧光分析。红色:α-旗帜(Δ133p53β),绿色:ΔNp 63α,蓝色:Hoechst.标尺8μm。n=3。hWT、Δ、133p53、β和TAP 63α共沉淀对H 1299细胞共表达的影响。n=3。iWTΔ133p53β在H 1299细胞可溶性蛋白组分中聚集形成能力的Westernblot分析与TAp63α蛋白共表达。n=3。jWesternblot分析WTΔ133p53β与TAp63α蛋白共表达对H 1299细胞不溶性蛋白组分聚集形成能力的影响。n=3.箭头表示聚集。分子量以kDa表示。源数据作为源数据文件提供。

由于∆133 p5 3β与p5 3不相关,因此我们进一步评估了它与p63家族的同源物的相互作用。P63蛋白异构体,由TP 63P53基因家族的成员也属于两个主要的亚类:Tap 63(αtoε)亚类,包含N-末端反活化结构域,ΔNp 63(αtoε)亚类,缺失于N-末端反活化结构域的一部分。有人声称tap 63亚型具有抑制肿瘤和转移的活性,而Δnp 63亚型则促进肿瘤的进展。40。目前的观点是,Δnp 63亚型作为显性阴性变异体,抵消tap 63亚型的转录活性。40,41。在H 1299细胞中共同表达时,WTΔ133p53β与ΔNp 63α相互结合。4D)。有趣的是,CCT 3蛋白也与这一复合体有关(如图所示)。4D)。其次,采用改良的westernblot和免疫荧光分析方法,评价WTΔ133p53β对ΔNp 63α共表达的聚集状态。ΔNp 63α的共表达显著降低了WTΔ133p53β在可溶性中的聚集(如图1所示)。4E)和不溶性蛋白质组分(如图所示)。4F)。此外,共聚焦显微镜和z叠三维重建的免疫荧光分析表明,WTΔ133p53β与ΔNp 63α共表达时,没有聚集体。此外,这一分析表明这两种蛋白质在细胞核中共定位(图1)。4G)。最后,我们对共表达wtΔ133p53β和Δnp 63α的细胞进行了时间推移显微镜观察。3)或表达WTΔ133p53β(补充电影)1或ΔNp 63α(补充电影)2)独自一人。ΔNp 63α(与樱桃融合)的存在降低了WTΔ133p53β的聚集形成能力。值得注意的是,即使在过度表达的情况下,也没有观察到ΔNp 63α或TAp63α的聚集。4E和G,i主板“WB p63”和“ΔNp 63α”和补充电影23),提示这一现象是WTΔ133p53β的标志之一。

接下来我们将研究p63家族的其他成员是否对WTΔ133p53β的聚集能力产生类似的影响。为此,我们检测了TAp63α蛋白是否与WTΔ133p53β相互作用。如图所示。4H通过共表达和共沉淀分析,我们检测了这两种蛋白的相互作用。CCT 3蛋白与WTΔ133p53β单独及在TAp63α存在时均有相关性。与ΔNp 63α相似,TAp63α影响WTΔ133p53β的聚集状态。TAp63α的共表达完全阻断了WTΔ133p53β在可溶性和不溶性蛋白质组分中的共同表达(如图所示)。4i,j).

Δ133p53β通过p63亚型具有侵袭性和EMT特征

这些数据证实了p63家族成员与WTΔ133p53β相互作用,并对其聚集能力有很强的影响。因此,我们测试了这些相互作用是否影响癌细胞的运动。我们首先用RT-PCR技术检测了p63亚型在不同癌细胞株中的表达.用补充表中列出的引物检测p63亚型6并根据补充表中所示引物的组合进行套式PCR。7。这一分析表明,除TAp63ε外,只有MCF-7细胞表达p63家族成员。5A)。接下来,我们评估WTΔ133p53β是否与MCF-7细胞中的某些蛋白相互作用。共表达分析表明,WTΔ133p53β与ΔNp 63α和ΔNp 63γ亚型相关。5B)。最后,我们评估了这种相互作用是否影响MCF-7细胞的侵袭能力.仅wtΔ133 p5 3β的表达就能提高mcf-7细胞的侵袭能力,这与先前发表的数据是一致的。22。此外,WTΔ133p53β与ΔNp 63α或ΔNp 63γ共转染显示出高度协同作用。5C)。由于wtΔ133p5β的过表达会对mcf-7细胞产生影响,这些细胞的表型与间充质过渡上皮相似(见补充影片)。49)我们评价了这一现象在WT、Δ、133p53、β和ΔNp 63亚型共表达方面的特征。如图所示。5D单独表达WTΔ133p53β对E-cadherin表达影响较小,而ΔNp 63α和ΔNp 63γ单独表达对E-cadherin表达无影响。而WTΔ133p53β和ΔNp 63α的共表达强烈降低了E-cadherin,提高了N-cadherin水平,完全符合这两种亚型的协同作用。有趣的是,内源性ΔNp 63亚型的缺失显著降低了Δ133p53β在MCF-7细胞中的表达,提示WtΔ133p53β介导的侵袭力依赖于MCF-7细胞内源性ΔNp 63。5E,f)。这些数据表明WTΔ133p53β与ΔNp 63α或ΔNp 63γ形成了一个蛋白复合物,并与它们协同作用推动EMT,其特点是失去上皮特征,并在MCF-7细胞中获得侵袭性。

图5:WT∆133p53β与p63家族成员的相互作用改变癌细胞侵袭能力。
figure5

a不同癌细胞株p63亚型表达的RT-PCR分析。n=3。bGFP-WTΔ133p53β与ΔNp 63α或ΔNp 63γ在MCF-7细胞共表达的共沉淀分析。n=2。c表达Δ133p53β,ΔNp 63α或ΔNp 63γ的MCF-7乳腺癌细胞可单独或联合表达。蛋白表达情况进行侵袭试验48 h。结果表示为与对照相比的褶皱变化。该值是五个独立实验的±SEM(误差条)的平均值。用非参数Mann-Whitney进行统计分析。t用棱镜软件(GraphPad)进行测试。p值按图中外观的顺序分别为0,0075、0,0317和0,0159。d。表达绿色荧光蛋白标记的Δ133p53β,ΔNp 63α或ΔNp 63γ的MCF-7细胞E-和N-钙粘蛋白的Westernblot分析表明,无论是单独表达还是联合表达。n=2。eΔNp 63缺失的Westernblot分析在MCF-7细胞中的应用。图5F的3个实验中有一个是有代表性的免疫印迹。fΔ133p53β和ΔNp 63缺失背景对MCF-7乳腺癌细胞的侵袭作用。对mcf-7细胞进行48 h的检测,并分析细胞浸润的变化。c)。结果表示为与对照相比的折叠变化率。绘制的数值为四个独立实验的平均值±扫描电镜。用非参数Mann-Whitney进行统计分析。t用棱镜软件(GraphPad)进行测试。p值分别为0.0211和0.286。gTAP 63和Δ133p53、TAP 63和β背景下MCF-7乳腺癌细胞的侵袭。对Mcf-7细胞进行48 h的检测,并分析细胞浸润的变化。c)。结果表示为与对照相比的折叠变化率。绘制的数值为四个独立实验的平均值±扫描电镜。用非参数Mann-Whitney进行统计分析。t用棱镜软件(GraphPad)进行测试。hTAp63α过表达条件下MDA-MB-231D3H2LN乳腺癌细胞的侵袭作用。对细胞进行48h的检测,并对其侵袭性变化进行分析,如(C)。结果表示为与对照相比的折叠变化率。绘制的数值为四个独立实验的平均值±扫描电镜。用非参数Mann-Whitney进行统计分析。t用棱镜软件(GraphPad)进行测试。p价值是0.0211。iTAp63α和Δ133p53缺失背景及双重缺失背景对MD-231D3H2LN乳腺癌细胞的侵袭作用。对细胞进行48h的检测,并对其侵袭性变化进行分析。c)。结果表示为与对照相比的折叠变化率。绘制的数值为四个独立实验的平均值±扫描电镜。用非参数Mann-Whitney进行统计分析。t用棱镜软件(GraphPad)进行测试。第一p值为0,0061,而其他两个值均<0.0001。分子量以kDa表示。源数据作为源数据文件提供。

有趣的是,TAp63的缺失,无论是单独的还是伴随着∆133p53或β亚型的缺失,都没有改变侵袭力,说明TAP 63的表达并没有改变MCF-7细胞的侵袭性(如图6所示)。5G)。TAp63亚型或∆133p53缺失可能是由于MCF-7侵袭能力极低和MCF-7中∆133p53β基础水平低所致。4A)研究TAp63和∆133p53β是否参与了高侵袭性MD-MB-231D3H2LN细胞的侵袭性。MDA-MB-231D3H2LN细胞内源性表达TAp63α和TAP 63β,但不表达∆Np 63亚型。5A)。此外,mda-mbb-231 d3h2ln细胞的侵袭性明显高于mcf-7细胞。22与MCF-7相比,它们表达的Δ133p53β亚型水平增加。4A)。与弱侵袭性MCF-7细胞相比,高侵袭性MDA-231D3HL2N细胞的CCT复合物亚基水平也增加(补充图1)。4B).

TAp63α的异位表达降低了细胞的侵袭能力,而内源性TAp63亚型的缺失则显著增强了MDA-MB-231-D3H2LN细胞的侵袭力,说明这些细胞的侵袭力依赖于内源性TAP 63。5H,i)。不出所料,内源性∆133p53亚型的缺失降低了侵袭力(如图所示)。5I)。然而,内源性∆133p53亚型缺失所引起的侵袭性减少不再受内源性TAp63亚型缺失的影响,提示这两种蛋白可能在同一信号通路上运作。然而,内源性Δ133p53亚型的缺失却大大降低了内源性TAp63亚型的耗竭引起的侵袭力增加(图1)。5I)。这些数据表明,Δ133 p53介导的侵袭力依赖于三阴性mDA-231D3H2LN细胞内源性TAp63蛋白亚型。此外,我们的数据支持了从文献中观察到tap 63和Δnp 63在癌细胞侵袭中起着相反的作用。40.

总之,这些数据表明,在与p63家族成员相互作用时,Δ133p53β聚集性的缺失会显著影响癌细胞的关键功能,如侵袭能力。这些实验表明,Δ133 p53β的活性依赖于其聚集状态,而聚集状态受与蛋白伴侣相互作用的调控。

与p63家族成员相互作用提高细胞内Δ133p53β动力学

为了支持Δ133p53β聚集的动力学依赖于其合作伙伴的存在这一观点,我们应用了光漂白后荧光恢复技术(FRAP)。这种方法评估了分子重新填充细胞的光漂白区域的动力学。在H 1299细胞中表达Δ133 p53βEGFP和mCherry∆Np 63α。测定了表达EGFP(对照组)、Δ133p53βEGFP(聚合条件)或Δ133p53βEGFP与mCherry∆Np 63α(聚集溶解条件)的光漂白样品的荧光回收率。FRAP实验的流程图如图所示。6A。如图所示。6BΔ133 p53βEGFP在mCherry∆Np 63α存在下,光漂白的回收率明显高于Δ133 p53βEGFP。Δ133 p53βEGFP的细胞内迁移率随mCherry∆Np 63α的共同表达而增加,并达到接近以弥漫性蛋白GFP为对照的水平(图1)。6B)。此外,具有R的线性回归因子2在不少于0.95的情况下,Δ133p53、β、EGFP单独或在mCherry∆Np 63α伙伴的存在下有显着性差异(图1)。6C)。免疫荧光分析6dΔ133p53、β和∆Np 63α与荧光标记融合后,与无标记有相同的共定位(图1)。4G).

图6:Δ133p53β分子动力学在ΔNp 63α蛋白伙伴的存在下显著增强。

aFRAP实验流程图。b从三个独立的实验中得到了用于背景荧光的归一化荧光恢复曲线的图形表示。扫描电镜未显示清楚。c回归因子的量化R2从三个独立的实验中得到了不少于0.95的结果。绘制的值为±SEM(误差条)的平均值。用非参数Mann-Whitney进行统计分析。t用棱镜软件(GraphPad)进行测试。第一p值<0.0001,第二值为0.0003。d共聚焦Z-栈三维重建H1299细胞株中EGFP、WTΔ133p53βEGFP及共表达WTΔ133p53βEGFP和mCherryΔNp 63α的免疫荧光分析。绿色:绿色(Δ133p53β),红色:樱桃(ΔNp 63α),蓝色:Hoechst。标度为10μm,显示了三个独立实验中的一个具有代表性的图像。e补充电影中的延时图像1012FRAP实验表明,在H 1299细胞中,WTΔ133p53βEGFP和共表达WTΔ133p53βEGFP和mCherryΔNp 63α。箭头表示FRAP区域。n=3用于FRAP实验。源数据作为源数据文件提供。

为了确定漂白区荧光随时间的恢复情况,对漂白前后的图像进行了分析。图形6E在核子光漂白上显示时间延迟恢复30秒(从补充电影中)1012)。Δ133p53βEGFP的Frap分析表明,漂白聚集体内的荧光恢复缓慢。

这些结果完全证实了以前的观察结果,即Δ133p53β亚型(如ΔNp 63α)的伙伴正在从聚集体中招募这种异构体,增加其细胞内移动性,从而使其可用于迁移和侵袭等不同的细胞功能。

分辩

TP 53编码至少12种不同的蛋白质亚型。最近的研究表明,Δ133p53β参与了肿瘤进展的几个方面,如侵袭、迁移和肿瘤干细胞表型。22,26。与此相一致的是,多项研究报告称,在不同的人类癌症中,高水平的Δ133p53β与生存率降低和预后恶化相关。20,22,23,24,25。然而,Δ133p53β发挥其致癌作用的机制尚不清楚。在这里,我们发现了一种与p53无关的∆133p53β的侵袭机制,它依赖于这种蛋白的聚集状态以及与特定的合作伙伴如cct复合物和∆np 63的相互作用。我们发现Δ133 p53β蛋白聚合体存在于多个人癌细胞株中。这一观察充分证实了在广泛的人类肿瘤活检和淋巴瘤组织中的聚集物的检测。Δ122TP53老鼠。此外,我们还证实了体外重组WTΔ133p53β蛋白能在溶液中形成大小不等的大寡聚体。实验和计算结果表明,Δ133 P53β的聚集形成能力与其DBD的展开有关,这很可能是由于该区域其余部分的结构稳定性很低所致。N端部分的缺失,特别是DBD的39个残基的缺失,严重影响了与dna接触的DBD和α螺旋的双β片构象。计算分析在WT∆133p53β蛋白中检测到几个可能的结构域,该蛋白具有生成淀粉样聚集体的能力。这与最近的一篇报道一致,表明∆40 p5 3亚型的聚集是由于p5 3 N端反活化结构域的丢失所致。42.

蛋白质结构的展开通常是聚集形成的先决条件。采用高通量蛋白质组学方法,我们鉴定了CCT伴侣复合物与WTΔ133p53亚型的关联。重要的是,我们的数据表明,Δ133p53亚型的N端是结合CCT复合物的关键。这种伴侣被证明参与了正确的p5 3折叠。11。与p53类似,CCT复合物的缺失导致WTΔ133 p53β聚集在细胞内。值得注意的是,CCT复合物的缺失也导致WTΔ133p53β诱导的细胞迁移。这些结果表明CCT复合物在WTΔ133p53β的激活中起着积极的作用,而其缺失则导致Δ133p53β诱导的细胞迁移聚集和丢失。有趣的是,我们还发现Pontin和HSP 70是Δ133p53β的合作伙伴。这两种蛋白质都被认为具有伴侣活性。43,44,45对WTΔ133p53β聚集能力无影响。

越来越多的疾病与不正确的蛋白质积累和聚集有关。46。这种机制主要用于阿尔茨海默病、帕金森氏症或亨廷顿病等神经退行性疾病,但它正在成为肿瘤发生的关键机制。47。最近的研究表明突变的p5 3能够产生聚集物。48,49。有趣的是,并非所有类型的突变对p53聚集都有相同的影响。所谓的“接触”突变影响负责DNA相互作用的残基,通常对聚集倾向有轻微的影响。相反,影响dna结合区球状折叠的结构突变对聚集有强烈的影响。10。其中一个可能的解释是DNA结合域的展开导致了埋在WT结构中的新的结构域的暴露。这些新暴露的结构域通常负责获得结构变异的p53蛋白的功能,聚集可能是造成这一现象的原因之一。252-258位的表位被认为是特别容易聚集的。50。突变型p53聚集、功能丧失与肿瘤生长也有相关性。51,52,53。有趣的是,突变型p53聚集被证明是治疗癌症的潜在靶点。Soragni和他的同事最近的一项研究表明,抑制突变型p53聚集显着地减少了肿瘤的进展。50。具有致癌功能的突变体p5 3是与不同的抑癌因子(包括p5 3及其类似物p63和p73)共同聚集的结果。10。有趣的是,wt p5 3不与p63及其亚型相互作用,而p53r175h与上述蛋白质有很强的亲和力。54.

我们还注意到WTΔ133p53亚型重复了突变型p53的相似的原癌基因功能,特别是在肿瘤进展过程中结构突变的p53。即WT、Δ、133、p53、β和结构突变的p53由于未折叠的蛋白质构象而具有聚集形成能力。此外,这些蛋白具有相同的细胞定位,都存在于细胞质和细胞核中,与仅在细胞核中检测到的WT p53相反。我们的研究表明,wtΔ133 p5 3β和结构突变的p5 3也有特定的蛋白伴侣(Pontin、HSP 70和p63家族成员),它们不与wt p5 3结合。36,39,54。有趣的是,该异构体还具有典型的p53R175H功能,如刺激癌细胞迁移。该展开事件为WTΔ133p53β提供了类似于p53R175H突变体功能增益的特征。通常,新暴露的结构域可与不与WT p53结合的蛋白伙伴联系,从而导致新的转录或信号通路的激活。这表明WT、Δ、133、p53、β和结构突变的p53具有相同的功能和调控机制。

然而,其他特征表明突变型p53和WTΔ133p53β聚合体在结构和功能上是不同的。首先,人们普遍认为wtp 3的显性阴性失活是由于与突变体p5 3共同聚集,抑制了wt p5 3的活性,并解释了突变p5 3的显性阴性效应。10。由于我们的数据表明∆133 p53β不能与WT p53相互作用,因此∆133 p53β依赖的肿瘤中WT p53抑癌功能的消失不能用同样的共聚集机制来解释。另一种解释∆133 p53β依赖性肿瘤野生型p53功能丧失的可能机制是∆133 p53β可能与WT p53竞争以结合p53反应元件。最近的观察证实了这一假说,表明∆133 p5 3β能结合p5 3特异性dna。25,55.

发现WTΔ133p53β与不同细胞背景下的p63亚型有关联,影响其聚集状态。与p63和p53R175H的共同聚集相比,p63亚型与WTΔ133p53β的结合大大降低了p63的聚集能力。令人惊讶的是,这些蛋白的结合对乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231 D3H2LN的侵袭能力有很强的影响。WTΔ133p53β与ΔNp 63α的联合作用导致聚集体的丢失,进而诱导癌细胞的侵袭。这些作用之后,MCF-7细胞的表型发生了变化,类似的上皮间充质转换(EMT)。两种蛋白的单独表达对E和N钙黏蛋白水平没有影响,但它们的共同表达导致前者的丢失和后者的诱导。钙粘蛋白开关是EMT的一个经典特征。这些实验共同证明了Δ133p53β侵袭活性的激活和与ΔNp 63α亚型共表达的总丢失。这些结果与以前的报道一致,证明了∆133p53和∆np 63之间的相互作用。56,这与p63在与突变体p53共聚集时的失活相反。与突变型p53相比,∆133 p53β与p63亚型的结合破坏了∆133 p53β的聚集并刺激其致癌特性。总之,我们的研究表明,∆133 p53β聚集体在生物化学和功能上不同于突变型p53聚合体。相反,TAp63的过表达虽然类似地导致了Δ133 p53β聚合体的丢失,但导致mada-mB-231 D3H2LN的侵袭力降低。这与已发表的数据一致,表明tap 63和Δnp 63蛋白在癌症进展中扮演着相反的角色。40.

最后,与ΔNp 63α蛋白的相互作用可从聚集物中释放Δ133 p53β,从而增加Δ133 p53β细胞内的迁移率。这一观察结果与Δ133p53β的存在完全一致,这些聚集体冻结了这种p53亚型的迁移率。最近的研究表明,突变的p5 3在聚集形成之前经历了液态缩合和固相转变。57,58。用Frap分析法分别对快速荧光恢复法和慢荧光恢复法检测的相分离液体与凝胶或固体状液滴进行了鉴别。它们的恢复动力学比较表明WT p53的液体特性,这与突变型p53的典型的固相相变形成了鲜明的对比。同样,我们检测到两种不同的Δ133p53β亚型,它们在聚集体中不动,在没有相互作用的情况下具有类似固体的特征,在∆Np 63α等蛋白质伙伴的存在下,具有流动性和液态的特征。这些结果提示在蛋白伴体存在的情况下,Δ133p53β亚型在非活跃状态和活动状态之间的相变。

我们的实验提出了一个WTΔ133p53β活性调节的模型(图1)。7)。我们建议WTΔ133p53β存储在一个聚集的,不活跃的状态。像CCT复合物这样的伴侣负责维持参与某些细胞功能的活性异构体的基本水平。Δ133p53β在聚集体中的固存作用可以作为一种储存机制,直到该异构体的活性被要求为止。如果有足够的蛋白伙伴,如p63家族成员,Δ133p53β就会从聚集物中被招募出来,并激活癌细胞的侵袭。综上所述,这项研究表明,癌细胞的功能,如侵袭,取决于p63家族成员等特定蛋白伙伴的p5 3亚型水平、伴侣数量和是否存在。最后,开发CCT和p63与Δ133p53β相互作用的抑制剂并评价其对转移的影响是非常有诱惑力的。

图7:Δ133p53β活性通过聚集调节的示意图。
figure7

Δ133 p53β在癌细胞中的表达增加,导致其聚集和聚集。Δ133 p53β主要由于其未折叠的构象而形成稳定的聚集体。Δ133p53β在聚集体中的固存将以不活跃的形式存储异构体。当需要此异构体活动时,招聘合作伙伴将其从聚合中释放。招聘伙伴是伴侣,如CCT复合体或p53家族成员,如p63亚型。招聘伙伴的存在增加了癌细胞的侵袭。与CCT复合物的相互作用可激活Δ133p53β介导的侵袭力。Δ133p53β与p63亚型的结合进一步促进了∆Np 63亚型活性的协同作用,或抑制了TAp63亚型的抗侵袭作用。


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