一种用于实时荧光成像的前列腺特异性膜抗原活化分子转子

手术是治疗局限性前列腺癌(PCA)的一种有效方法，但由于现有的肿瘤检测方法很少实时进行，术中如何快速、准确地标定肿瘤边界是一项艰巨的任务。为了克服这些限制，我们开发了一种荧光分子转子，专门针对前列腺特异性膜抗原(PSMA)，这是一种已建立的PCA标记物。探针具有小分子亲和力(IC)。五十=63~118 pm)，产生与PSMA探针复合物浓度成正比的强荧光信号的瞬时启动。利用PCA细胞株和临床标本进行的体外和体外实验表明，该探针在生物医学应用中的应用，包括实时监测细胞内吞和肿瘤分期。在PCa异种移植模型中进行的实验显示了该探针在体内成像应用的适用性。

前列腺癌(PCA)是男性癌症相关死亡的第二大原因.局限性肿瘤患者可以从前列腺根治术中获益良多。1,2。如果肿瘤阳性边缘完全切除，则可实现长期控制。然而，除非有一种可靠的方法来显示切除后仍存在于边缘的极少量肿瘤，否则这可能是一项挑战。目前，组织病理学是最可靠的方法，以确定一个积极的边缘，但它是耗时的，而且往往是不公开的，直到术后的时期。一种能在术中可靠地识别阳性边缘的显像剂可以实时改变手术计划，并有助于取得更好的结果。

前列腺特异性膜抗原(Psma)是Ⅱ型跨膜糖蛋白在大多数pca中的过度表达，在正常组织中表达有限。3,4。它被认为是PCa的一种高价值的生物标志物，在PCA的诊断和治疗方面受到全世界的关注。PSMA-靶向配体已成功地引导了各种功能基团，包括放射性核素、荧光团、光敏剂、Gd(Iii)等。5,6,7,8,9,10,11,12。随着高质量近红外染料的发展，PSMA靶向荧光配体正受到人们的积极关注。5,13。给药后，PSMA靶向荧光染料可在PCA内特异保留，清除血池背景信号(通常需要数小时)后，可实现PSMA特异性肿瘤成像，并可为外科手术提供指导。迄今为止，针对前列腺癌的光学探针主要是基于荧光染料(Cy7，IRDye800CW，吲哚青绿等)。这是“永远”，需要大量的时间来实现适当的图像对比度。14。PSMA-可激活的荧光探针，具有关闭响应，将是可取的，因为他们可能有较少的背景比荧光剂的荧光激发，但只有少数的例子已经被报道。15,16,17。Kobayashi等人以荧光染料(如吲哚青绿)与抗体或小体结合时的猝灭效应为基础，开展了开创性的研究，表明psma激活和内化该试剂时，荧光量增加了30倍。15,16。基于这种激活效应，他们可以在注射后6h特异性检测PSMA阳性肿瘤，并与吲哚青绿结合。然而，由于对激活的内在化要求，以及从血池中提取的单克隆抗体的清除时间较长，因此无法在给药后不久进行成像。Urano等人最近报道了一种利用PSMA羧肽酶活性进行荧光合成的新方法。该方法可用于手术切除临床标本的体外荧光成像。17。该方法具有较高的荧光增强能力，而信号的产生依赖于PSMA的酶活性，样品染色至少需要30 min。总的来说，现有的方法至少需要几十分钟到几个小时才能达到合适的图像对比度，这鼓励我们开发能够在较短时间内在给药后成像的探测器。

荧光分子转子(FMRs)是一类对局部微环境(如极性和粘度)敏感的荧光分子。18,19,20。在光激发下，分子形成一个低能态，称为扭曲分子内电荷转移(TICT)态，因此激发能可以伴随着红移发射或非辐射弛豫而消散。应用fmr的策略是限制tICT态的形成，在这种情况下可以获得特定的荧光增强(通常是量子产率和荧光寿命)。21。FMRs的荧光响应比其它特定化学反应介导的开关探针更灵敏、更快。22，实现实时和现场检测。在这方面，已经开发了一些用于检测微环境中粘度的fmr，例如julolid的衍生物(dcvj，ccvj)。23,24，中苯基取代的BODIPY衍生物25,26,27，卟啉衍生物28，以及硫氰酸染料29。FMR越来越多地被用于成像生物分子(蛋白质、DNA、RNA、肽聚糖)和生物分子间的相互作用。30,31,32,33,34,35,36,37,38。我们假设，通过与一种低分子量的psma抑制剂结合，fmr可以与酶入口漏斗内衬的残基相互作用，从而发生活化。12,39(无花果)1A)。由于这一过程只是通过与PSMA结合而触发的，而不涉及其他步骤，例如内吞作用和催化作用，因此预计它将迅速而具体地作出反应。在此，我们报告了由PSMA特异性激活的FMR探针的发现。我们揭示了荧光激活探针-PSMA结合的潜在机制。此外，这些探针被成功地应用于PSMA介导的细胞增生症的实时监测、前列腺癌组织的快速染色和PCa的体内成像。

PSMA靶向活性探针的设计与合成

基于苯甲腈和焦立定基的FMR是众所周知的。24。最近，Yen-PangHsu等人成功地对其进行了修改。和波长接近近红外区域的fmr(λ)。前/λ埃姆=490/660 nm)。这些修饰使组织能更好地穿透荧光信号在体外或体内成像中的应用。37。在本研究中，我们通过将苯甲腈荧光转子连接到lys-urea-glu支架上，设计了一种可活化的探针，该支架是临床上应用于pca成像和放射治疗的一种固定的psma靶向元件。39。为了使苯甲腈荧光转子与配体结合蛋白之间的临界相互作用最大化，荧光载体直接与赖氨酸ε胺上的Lys-尿素-Glu支架结合，得到Glu-490(附图)。1)。此外，我们还合成了ODAP-490和ODAP-436，Lys-脲-草酰二氨基丙酸类似物，以提高其水溶性，减少非特异性相互作用。(无花果)1B)12.

探针的生化和生物物理表征

为了评估分子环境对fmr探针的荧光增强作用，我们最初使用甘油溶液模拟psma结合时可能出现的旋转约束条件，并收集了化合物的荧光和紫外可见光谱。37。ODAP-436分别在436 nm和490 nm处表现出紫外吸收和荧光发射极大值。Glu-490和ODAP-490分别在490 nm和660 nm处表现出紫外吸收和荧光发射极大值。1B)。所有探针均表现出明显的甘油依赖性荧光增强，与纯缓冲液相比，当甘油浓度为80%时，其信号增强幅度超过27倍。1C).

利用重组人PSMA(RhPSMA)，测定了探针在溶液中与酶的络合作用后的关键生物物理和生化参数。第一，集成电路50用建立的NAAG水解法测定探针的值。40。对Glu-490、ODAP-490和ODAP-436的抑制常数分别为63.1、99.6和118.4 pm。1D)，分别将这些化合物鉴定为有效的PSMA特异性抑制剂.其次，我们评价了探针对rhPSMA结合的化学计量和荧光增强作用。为此，用rhPSMA稀释法对浓度为500 nm的探针进行了滴定，得到了预期的1：1结合化学计量比(图1)。1E)。此外，我们观察到荧光强度增加了29.9至38.3倍(如图所示)。1F)，指出在PSMA结合上对荧光团施加的有效旋转约束。最后，我们评估了PSMA激活探针所需的时间。在此，500 nm浓度的探针与10倍摩尔过量的PSMA混合，在30 min时间间隔内测量到荧光信号(如图所示)。1g)。荧光信号在不到30秒内达到最大值，这是混合成分和开始测量所需的时间，并在整个实验期间保持稳定。

总之，化合物Glu-490、ODAP-490和ODAP-436在rhPSMA结合上提供了几乎瞬时和稳定的荧光.这些特性的结合使这些探测器成为生物和生物医学应用的理想选择，而时间分辨率是至关重要的。

荧光激活探针-PSMA结合的机理

为了为Glu-490在rhPSMA结合上的荧光增强提供力学基础，我们解决了rhPSMA/Glu-490复合物的晶体结构，并将其细化到了1.73个分辨率极限(表)。1)。活动地点范围的glu-490安装在定义良好的可解释性中。FO-FC电子密度峰值在细化的最后阶段(图1)。2B)。Lys-Urea-Glu基序的定位与先前报道的rhPSMA/尿素配体复合物几乎没有区别。41。P1‘-谷氨酸分子以“典型”方式与s1’口袋结合，尿素连接体在活性位锌离子附近与几个残基结合，在非素侧，最显著的接触涉及psma的arginine贴片和glu-490赖氨酸功能的p1α-羧化功能。42,43.

FMR结构由远端N-取代四氢喹啉给体基、噻吩环间隔剂和腈受体基团组成。2A)。在我们的结构中，这三个子组采用了一个近平面的结构(图)。2B，c)这是通过与PSMA残基的分子间相互作用来维持的。这种空间排列防止了分子内相对于其他亚基的扭曲运动，而这种刚性对于FMR光激发下有效的荧光发射至关重要。44。将腈基插入一个深口袋，勾勒出G206-F209的主链和Y 700侧链。此外，FMR环系统是支撑在PSMA表面描绘的残基N 698-G702的“戊二酸盐传感器”(图1)。二维空间)45。其中最明显的是噻吩环与Y 700亚甲基基(4.0a)、四氢喹啉基和A 701侧链甲基之间的CH-π相互作用。2C).

可以推测，frm单元也间歇性地与入口盖上的残馀f 546和s 547接触，这是进入内部PSMA腔(氨基酸Y541-g548)入口处的一个柔性段。42。然而，越弱越不连续FO-FC电子密度图使我们无法以很高的置信度生成模型的这一部分(补充图)。6).

活细胞受体结合和内吞的实时监测

由于Glu-490和ODAP-490在我们的生物物理实验中几乎无法区分，ODAP-490显示的非特异性染色少于Glu-490(补充图)。8)，我们选择ODAP-490作为后续生物应用。利用LNCaP、22Rv1和pc 3细胞株表达高、中、低、可忽略的PSMA水平。46,47我们首先用一种基于mtd的活性测定法来评估odap-490的细胞毒性。48，该探针被证明是无毒的，浓度可达25μM(如图所示)。3A，补充图。7)。用10μM ODAP-490孵育2 h，用荧光显微镜观察PSMA-表达细胞。3B)。荧光信号的定量显示PSMA表达水平和荧光强度与LNCaP和22Rv1之间的相关性，显示出比PC3高4.4倍和2.3倍的信号(图3)。3C).

为实时监测细胞内吞，用10μM ODAP-490处理LNCaP细胞，37°C共聚焦显微镜观察2 h，间隔3 min。3E，补充电影1)。荧光强度在前6 min内迅速升高，随后在剩余时间内逐渐增强，在90 min左右达到稳定状态。时间剖面很可能反映了探针在前6分钟内快速结合到质膜上的PSMA分子，然后持续的PSMA内化和循环回质膜(图1)。第三代)。荧光监测的特异性用已建立的有效的psma抑制剂zj-43进行了验证。49。用100 MZJ-43预处理LNCaP细胞后，荧光信号明显降低(15倍)，符合探针与ZJ-43进行PSMA结合的竞争(图1)。3F，g，补充电影2).

然后利用几种已知的内吞调节剂来评价PSMA的贩运机制。细胞在4℃孵育后，细胞内吞功能几乎完全被阻断，但细胞表面仍有较强的荧光信号。三维空间)。氯丙嗪、制霉菌素和5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利(Eipa)被用来作为氯硫蛋白依赖的靶标。50、依赖于洞穴的51，和大细胞症52分别是路径。每种抑制剂10μM浓度预处理30 min后，再加入ODAP-490，监测细胞的荧光信号。CPZ对PSMA介导的ODAP-490摄取有最显著的抑制作用(86%)，与粘附素依赖性途径PSMA内吞起主要作用(补充图)。9，补充电影3).

PCA组织的活体快速简便染色

以人组织学标本为实验材料，评价ODAP-490检测PSMA表达水平的可行性。我们首先用抗PSMA抗体和ODAP-490共染PCa手术标本。4A)，并观察到抗体的绿色荧光与ODAP-490的红色荧光之间的相关性，其Pearson系数为0.88。4B).

取6例前列腺切除术标本，行ODAP-490染色。荧光强度在每个样本的焦点区域都有差异，可能反映了PSMA表达的异质性(如图所示)。4C)。对每个样本，选择三个感兴趣的区域，切除，并由病理学家检查PSMA表达和Gleason评分，与Pearson系数0.69相关(图)。4C，d，e)。不需要额外的干预，如固定或清洗，该方法可以方便地识别患者标本中的PCA。

PCA在体成像

结合ODAP-490的荧光开关特性，推测该探针能在体内早期检测PCA。我们检测了ODAP-490在荷PSMA表达的前列腺肿瘤小鼠静脉注射后检测PCA的能力。选择PSMA表达中、低水平的22Rv1肿瘤作为阴性对照，挑战检测限。注射25 nmol ODAP-490后，肿瘤在注射后2h可清晰显示，肿瘤内有特异性信号激活和血池背景信号清除的联合作用(图1)。5A，b)。在相同条件下，PC3异种移植物中没有明显的荧光信号积累。结果表明，ODAP-490适合于PSMA表达肿瘤的体内特异性成像.

a22Rv1和PC3肿瘤的荧光显像小鼠静脉注射ODAP-490，分别于1h、2h和4h获得图像，白色箭头和虚线圈显示肿瘤的位置。b面板内22Rv1和PC3肿瘤荧光强度的定量分析a。数据以平均±S.D表示。(n=4只不依赖生物的小鼠)。双尾未配对学生t-测试。c注射ODAP-490或ODAP-800 CW 4h后PSMA 22Rv1肿瘤的荧光显像。上下面板上的白色箭头分别表示肾脏和肝脏。白色箭头和圆点表示肿瘤的位置。d面板22Rv1肿瘤背景比的定量分析c。以明亮的视野划定肿瘤区域，并在另一侧划定相同大小的区域作为背景。数据以平均±S.D表示。(n=4只不依赖生物的小鼠)。双尾未配对学生t-测试。源数据在源数据文件中提供。

全尺寸图像

接下来，我们将ODAP-490的pca在体成像能力与已建立的“始终对”PSMA靶向探针ODAP-800 CW进行了比较。12。给小鼠注射ODAP-490或ODAP-800 CW，于注射后4h采集图像.ODAP-490具有肿瘤特异性活化特性，可达到29.1倍的肿瘤背景比，而ODAP-800 CW仅能达到2.4倍。5C，d)。这些初步的体内实验结果证明了PSMA可激活探针在快速检测肿瘤方面的潜在优势，尽管可激活染料的波长仍需进一步改进。

PSMA在几乎所有正常组织中均有高表达，在正常组织中表达有限，是一种理想的高灵敏度、高特异性的PCA成像生物标志物。为了克服荧光PSMA检测所需的时间限制，我们设计了一系列PSMA激活的荧光探针，通过FMR与PSMA靶标分子的简单共轭来实现。探针与PSMA结合，具有很高的效价(63~118 pm)。结果表明，在PSMA结合后，FMR紧密结合在限制荧光团构象的入口漏斗中(PDB代码：7BFZ)，从而激发荧光信号(29.9~38.3倍)。由于这一过程是由PSMA/探针复合物形成直接触发的，因此在30秒内就能实现即时信号的开启，这是迄今为止发现的最快的PSMA激活探针。高的PSMA结合亲和力和快速的信号响应使我们能够测试一系列的生物医学应用。

PSMA在活细胞上的表达只需与探针孵育即可使用方便的免清洗协议。利用该方案，我们能够实时监测和量化整个PSMA/探针复合物的形成和细胞内吞过程。通过定量研究不同类型的内吞抑制剂对psma介导的内吞作用的影响，证实clathrin依赖的内吞途径在psma的内吞过程中起着最重要的作用。53,54而小孔蛋白依赖性和微胞吞途径的作用是有限的。这与现有的结果一致，即大多数跨膜受体是通过clathrin依赖性机制内化的，最近matthias等人使用刺激发射耗尽(Sted)纳米镜证明了这一点。55.

同时，一种类似的无清洗方案可用于PCa手术标本的染色，并能在10 min内实现快速、准确的PSMA定量，这与癌的存在和Gleason评分有关。与传统的费时组织学相比，免洗法在手术中具有潜在的应用价值.此外，ODAP-490在小鼠异种移植体内可在几小时内获得特异性成像。与“始终打开”的PSMA靶向染料ODAP-800 CW相比12，ODAP-490在早期时间点取得了明显的肿瘤对背景的对比改善，使其在成像时间至关重要时成为术中手术指导的特殊选择。

总之，我们开发了一系列PSMA激活的荧光探针，与PSMA结合后荧光强度迅速增强。该探针成功应用于实时监测PSMA配体结合和介导活细胞内吞的全过程，快速无洗涤染色PCa手术标本。在体内，PCa的成像也被成功地证明，具有早期时间点检测的优势。进一步提高PSMA可激活探针波长的努力目前正在调查中.