肯塔基州路易斯维尔首次大流行期间SARS-CoV-2感染的血清学评估

用于诊断、血清流行病学评估和在感染或接种疫苗时检测保护性抗体滴度的血清学检测对于管理SARS-CoV-2大流行至关重要。血清学检测SARS-CoV-2抗原的抗体反应是现成的.然而，也有一些缺乏准确测定SARS-CoV-2抗体滴度和中和性的特性.我们建立了一种酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，用于检测SARS-CoV-2、Spike(S)、受体结合域(RBD)和核衣壳蛋白(N)对IgG、IgA和IgM的反应。定义了灵敏度和特异性的性能特征。ELISA结果与传染性SARS-CoV-2的微量化和斑块减少中性试验呈显著正相关.在2020年5月和7月第一波当地大流行期间，我们的ELISA被用于筛查肯塔基州路易斯维尔(Louisville，KY)的医护人员。我们发现血清阳性率分别约为1.4%和2.3%。我们的分析显示个体间有广泛的免疫反应，并提示一些非RBD特异性的SIgG和IgA抗体可以中和SARS-CoV-2。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)迅速蔓延，导致全世界范围内1.76多万人感染，近400万人死亡(截至2021年6月16日)。Sars-cov-2感染包括一系列症状，从无症状到严重新冠肺炎，其特征是发烧、严重咳嗽、缺氧、胃肠道症状、高凝状态、炎症并发症、急性呼吸窘迫综合症和死亡。1,2,3,4。目前，虽然人们认为个体的免疫反应起着重要的作用，但缺乏对各种症状的生理基础的证据。此外，许多人认为，由于对这种病毒的现有免疫力有限，导致这种病毒在世界各地迅速蔓延。从历史上看，真正的感染流行率超过了呼吸道病毒流行中检测到的病例。3,5这意味着个人可能不知道自己感染了SARS-CoV-2，社区可能低估了流行率。有证据表明，先前的感染提供了免疫(持续时间不明)，但在传染性非典型肺炎-CoV-2的传播和群体免疫方面仍然存在重要的知识差距。针对SARS-CoV-2的许可疫苗直到最近才出现，导致决策者们努力解决最有效和最公平的疫苗分配问题。大家普遍同意应优先为前线医护人员接种疫苗，但鉴于感染的发病率迅速上升，有合理理由使用历史感染的血清学标记，作为优先接种免疫天真疫苗的方法之一。5,6,7。因此，迫切需要高质量的血清学检测，以帮助人们了解感染和免疫的传播，以及SARS-CoV-2疫苗的开发和部署。

Sars-cov-2基因组编码4种结构蛋白：包膜蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白(N)和膜糖蛋白(S)。8,9。N蛋白通过病毒RNA进入宿主细胞，并随着病毒颗粒的组装和释放而促进病毒复制。10,11。N蛋白已被证明具有高度的免疫原性，并已被用于疫苗的研制。11,12,13。S直接介导与宿主细胞的结合，特别是通过它与人受体血管紧张素转换酶2(ACE 2)的相互作用。9。S蛋白S1区含有受体结合区(RBD)8，许多中和抗体的靶标9。中和抗体作为一种免疫产品，在病毒疾病的保护和治疗中发挥着重要的作用。2。中和抗体水平以前曾被用作评估疫苗疗效的标准，以及利用血浆输液作为被动抗体治疗的标准。2。血清中和可以用金标准菌斑减少中和试验(PRNT)和/或更高通量的微整化试验来测定。酶联免疫吸附试验(ELISA)与重组抗原底物的应用简单，不需要使用生物安全三级(BSL-3)实验室，且可与中和相关。因此，酶联免疫吸附试验可以作为一种简便的筛选工具，用于检测有可能中和感染的抗体。

目前，ELISAs正在开发以检测和测量抗SARS-CoV-2抗体的存在.最近的研究评估了病人血清中抗S、N和RBD的IgG、IgA和IgM抗体的不同组合。5,9,14,15,16,17。然而，有必要在不同人群中持续评估抗S、N和RBD的IgG、IgA和IgM抗体，以便更好地了解新冠肺炎，并评估对自然感染的抗体应答的持续时间和程度。本文报道了检测SARS-CoV-2病毒S蛋白、RBD和N抗原IgG、IgM和IgA抗体的ELISA方法的建立和鉴定。利用S和RBD ELISAs，评价了SARS-CoV-2中和作用的相关性.这些测试被用于分析大约2300名来自肯塔基州路易斯维尔大学医院的医护人员，这两个月是当地新冠肺炎大流行的第一波，即2020年5月和7月。本研究的目的是：(1)进行SARS-CoV-2抗体的ELISA检测；(2)了解初级病毒中和与微量化和ELISA分析的关系；(3)测定当地医护人员的血清转化率和免疫应答的寿命；(4)确定可能是恢复期血清有用供体的医护人员。

方法验证

利用商用纯化的SARS-CoV-2重组抗原，对1：100稀释人血清样品中SARS-CoV-2抗体的检测进行了优化。ELISAs包括检测抗S、RBD和N抗原的IgG、IgA或IgM抗体。对38例SARS-CoV-2阳性和29例SARS-CoV-2阴性患者血清进行IgG、IgA或IgM对S、RBD和N蛋白的检测。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测活动性病毒阳性，并采用高级生物技术新冠肺炎IgG/IgM快速检测盒检测SARS-CoV-2抗体。阴性组包括29例活动性病毒阴性血清(用RT-PCR方法检测)和SARS-CoV-2抗体，采用高级生物技术新冠肺炎IgG/IgM快速检测盒进行检测。ROC分析以确定OD临界值，为每个ELISA提供最佳的诊断特异性和敏感性(表)。1)。除NIgM外，所有ELISA方法在阳性组和阴性组之间均有统计学差异(图1)。1)。热图分析(图1.2(A)1：100稀释度的样本提供了SARS-CoV-2阳性患者免疫反应变化的半定量图像。

真阳性和真阴性患者标本的ELISA分析。患者血清按1：100稀释，n=2，绘制平均吸光度值。*P<0.05，双尾t检验(GraphPad Prism 8.0)。

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38例SARS-CoV-2阳性患者分析(a)ELISA OD值热图。样品稀释倍数为1：100。(b)ELISA法(n=2)、微量化法(n=6)和PRNT法测定抗体终点滴度。50(n=2)。抗原包被在微滴度板上，阻断，加入血清系列稀释法，用标记类特异性二次抗体检测。(c,d)与PRNT的相关性(Pearson，p=0.05)和微整化(P=0.05)。50.

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为了提高S IgG和RBD IgG ELISAs的质量，又增加了阴性患者。除上述29份阴性样本外，还分析了9份RTPCR阴性个体和42份新冠肺炎前血清。SIgGELISA的检测下限为0.418吸光度单位(AU)，灵敏度为100%，特异性为98.8%。该方法的灵敏度为95%，特异性为100%(表)。1).

与中和相关

抗体滴度与中和率的相关性是根据患者的抗体效价划分为各级的。用ELISA鉴定的RBD IgG ELISA结果进行分级：阴性(<0.22 AU，低0.22~0.50 AU)，中等(0.50-1.25 AU)和高(>1.25 AU)。对38例患者血清进行S IgG ELISA、S IgA、RBD IgG ELISA、RBD IgA、微量化试验和PRNT试验(表)。2；图1.2b)。用皮尔逊秩试验测定Pad棱镜中ELISA和微整化终点与PRNT的相关性(图1)。2c，D)。所有抗体类型与中和均呈正相关。微整化与PRNT呈正相关r值为0.78，以PRNT为对照，微整化率分别为百分之九十七和百分负一致性为百分之八十三。

在阴性的RBD IgG ELISA检测中，有5例患者存在中和抗体(表)。2)。这些患者均有较高的S IgG滴度，表明除RBD外，还有一个表位可引起中和抗体的产生。18。有趣的是，这5例患者中有3例有较高的SIgA滴度，而这3例患者的中和抗体明显高于两例单用SIgG的患者。在这一层中，中和效价最高的患者30和34也有RBDIgA。

在低RBD IgG ELISA水平中，患者27没有中和抗体。该患者的RBD IgG水平仅略高于临界值，且有少量的SIgG。其余8例患者血清均有不同程度的中和抗体。仅对这8例患者进行分析，发现S IgG终点滴度和微量化滴度的皮尔逊R值为0.9198，表明在不存在RBDIgG的情况下，SIgG与中和抗体之间存在显著的相关性。患者21-25显示出很高的中和效价。这些患者均有明显的IgA抗体水平。值得注意的是，患者23的S和RBDIgA水平显著高于低层组(表1：6502)。2).

培养基RBDIgG水平与中和点无相关性，与中和度呈轻度正相关(Pearson r=0.26)。患者18有最高的中和终点，没有最高的S或RBD IgG端点，再次表明特异性S中和抗体或由于SIgA中和。患者13和16产生相同的S和RBD IgG终点滴度，而患者16的中和终点比患者13高出两倍，尽管患者13的血清含有更多的S和RBDIgA。这可归因于患者16的S中和抗体。

患者6血清中和活性最高，与高S、RBD IgG终点滴度及大量IgA有关。在比较患者10(高层底部)和病人11(中层高)时，他们的S和RBD IgG终点滴度是相同的，而病人11的中和终点几乎增加了两倍。同样，患者11血清中的SIgA含量明显高于患者10。

医护人员分析

从2020年5月8日到2020年5月21日，我们对肯塔基州路易斯维尔的医护人员捐赠的血清样本进行了ELISA检测。对医护人员进行了SIgG、SIgA、SIgM、RBDIgG、RBDIgA和RBDIgM的初步筛选。在1244份充分样本中，19份被确认为S-IgG和/或RBD IgG阳性(表)3)。在这项研究中，两名患者(19名和20名)的活性病毒呈阳性。经PCR证实为活性病毒的初指，未检出抗体，病毒诊断后第6天和第7天检测抗体。确定19名医护人员中有13人具有中和抗体滴度≥1：128，因此是潜在的恢复期血浆供体。酶联免疫吸附试验(ELISA)结果与中和结果比较，与上述38例阳性患者的趋势一致。RBD IgG水平低的患者，除非有明显的S抗体存在，否则不存在中和抗体。这证实了含有中和表位的S的假设。当RBD IgG和S IgG水平中等到高时，与中和终点没有直接相关性，提示不同的S IgG抗体和IgA抗体的中和潜力。

在第二轮医疗工作者的血清样本分析中，在2020年7月6日至20日期间，932人被检测出SARS-CoV-2抗体；893份阴性；22份阳性，17份样本不足。阳性率约为2.3%。来自第一轮的血清阳性医护人员中有74%返回进行抗体分析。在14名返港的血清学阳性人士中，78.5%(14人中有11人)维持高水平的sars-cov-2特异性抗体(表)。3)。对于5个个体，生成并比较了所有终点滴度的数据(图1)。3)。总滴度没有明显下降，表明抗体反应在恢复期前几个月的稳定性。在第2轮中，3人通过RT-PCR检测出活性病毒呈阳性.对于所有有活动性感染的个体，在与鼻腔拭子相同的一天，手指棒中没有检测到抗体。在PCR确认感染后第4、9、14天检测抗体。3).

第1轮和第2轮医护人员血清SARS-CoV-2抗体的比较。血清阳性医护人员的日志终点滴度(n=5)。点阵图显示5~7月的穗型IgG、RBD型IgG和微球化率的比较。颜色对应于每个医护人员。

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合格的血清学检测是SARS-CoV-2流行病学研究的关键.血清学检测不仅需要了解免疫反应的性质，而且还可以更准确地估计流行率，包括无症状感染的比率和更准确的感染死亡率估计，加强接触追踪，协助评估疫苗试验，并为产生恢复期血清/血浆疗法确定供者。血清学检测是由于不同的测试方法的性能特点，包括抗原的选择，抗原的来源，血清转换时间，以及同类型转换。高免疫原性的S蛋白，尤其是RBD，是中和抗体的靶点8,19,20。重组S蛋白和rbd蛋白已在哺乳动物或昆虫细胞中产生，而哺乳动物细胞产生的抗原与sars-cov-2血清有较好的反应性。21。N蛋白具有免疫原性，但N在冠状病毒中具有高度同源性，因此有望诱导出更多的交叉反应抗体。Long等人发现部分新冠肺炎患者对SARS-CoV N有交叉反应，而对SARS-CoV S无交叉反应。6。分析抗体时必须考虑血清转换时间。最近的研究显示，人们很少在症状出现的前7天内产生针对SARS-CoV-2的特异性抗体。然而，从第7天到第14天，IgM和IgG抗体迅速增加。6,22,23。因此，为了消除时间限制，我们为ELISA的发展设置了我们的阳性患者队列，因为RT-PCR加上抗体阳性确认所有患者都已发生血清转换。

在本研究中，我们通过研究IgG、IgM、IgA到S、RBD和N，对同一批患者进行检测，以了解不同SARS-CoV-2抗原的血清学反应的差异。所有SARS-CoV-2抗原都是在哺乳动物细胞中制造的，并得到了类似程度的纯化。ROC分析显示，S和RBD的敏感性和特异性优于N.免疫球蛋白对N的反应差异最大。IgG、IgA和IgM均表现出较低的敏感性和特异性，结合IgG和IgM的联合阳性预测值(PPV)仅为29.2%，因此N不是SARS-CoV-2诊断的最佳抗原。与其他研究相一致，这表明N与S和RBD相比具有更高的交叉反应性，可能不是临床诊断的最佳抗原。

IgG、IgM或总抗体通常用于诊断具有相似性能特征的疾病，但很少有研究使用sars-cov-2特异性IgA进行诊断。1,24。IgM抗体的检测可能预示着最近的感染和IgG的检测在检查免疫反应的持续时间。对SARS-CoV-2特异性IgA的了解较少，但更多有关IgA免疫应答的信息对于了解SARS-CoV-2感染有一定的参考价值。总之，我们的分析表明，S可能是最健壮的检测抗原，-IgG和IgM都是有价值的诊断免疫球蛋白。感染SARS-CoV-2的志愿者均出现IgG和IgM抗体，未发现假阴性。IgG/S特异性为96.6%，少数为假阳性。同时分析IgG和IgM的阳性预测值为100%。抗SIgA敏感性为94.7%，并非所有SARS-CoV-2患者均能检测到抗S.IgG抗体，对RBD的敏感性为94.7%，提示部分SARS-CoV-2阳性患者在检测限以上未出现IgG抗体。

在我们的研究中，RBDIgM和IgA ELISAs的敏感性和特异性并不理想，但这可以归因于IgM只是在感染的早期瞬间产生，并且可能不是所有个体都产生可检测的IgA。其他ELISA研究表明，IgA和IgG检测方法在敏感性和特异性上存在差异。最近的一项研究发现，在症状出现后4-10天，RBDIgA比RBDIgG更敏感，而RBDIgG的敏感性在症状出现后16天增加，因此采血时机非常重要。24。因此，IgM ELISAs可作为RT-PCR的补充分析，以提高对最近SARS-CoV-2感染的诊断水平。IGA可用于辅助诊断，IgA反应值得进一步研究。

血清学标本的病毒中和活性证实了中和特异性的ELISA结果，确定了免疫球蛋白水平需要“免疫”，并确定了康复血清捐献的个体。有趣的是，我们发现的病人是阴性或低滴度的RBD IgG，但有高滴度的S IgG，有中和抗体，提示可能的另一个表位，除了RBD产生中和。此外，在RBD滴度低的患者中，SIgG与中和抗体之间存在显著的相关性。这些数据表明，SIgG抗体具有很强的抗SARS-CoV-2的中和能力.虽然许多研究报告说，针对S蛋白的RBD的抗SARS-CoV-2的中和抗体25,26,27,28,29，最近发表在科学在SARS-CoV-2中，发现针对S蛋白N端结构域(Ntd)上的一个表位的中和抗体，该抗原与RBD无关。18。总的来说，这支持我们的发现，高滴度的S-IgG显示中和SARS-CoV-2.

我们已经证明了依赖于更高水平的S-IgG的中和性的差异，以及当低滴度的S-IgG和S-RBD发生时，S-IgA抗体被中和的可能性。最近的血清学研究为IgA和IgG抗体中和SARS-CoV-2提供了进一步的见解。众所周知，IgG和IgA在预防呼吸道病毒感染方面起着重要作用。30,31,32。IgG是系统产生的主要抗体类型，IgA是黏膜表面最常见的抗体类型，对呼吸道病原体有保护作用。30,31,32。先前的研究表明，IgA在预防小鼠和人类感染流感方面比IgG更有效。30,32,33,34,35。此外，IgA可能在SARS-CoV感染和免疫中起作用.在小鼠鼻内传递sars-cov蛋白比肌肉注射sars-cov更有效地保护肺内的病毒复制。30,36。此外，经鼻MERS衍生疫苗报告了小鼠支气管肺泡灌洗液中IgA抗体的中和作用。30,37。最近的一项研究评估了一种编码sars-cov-2稳定尖峰蛋白的黑猩猩腺病毒疫苗在小鼠体内的有效性。38。本研究比较了疫苗的鼻内和肌肉注射，并得出结论：两种途径均能保护小鼠免受sars-cov-2肺部感染和肺炎的影响。38。鼻内注射可诱导小鼠产生抗IgA和中和抗体反应，保护小鼠免受上、下呼吸道sars-cov-2感染，并产生绝育免疫。38。另一方面，肌肉注射不会引起IgA反应或导致免疫绝育。38。相比较而言，我们的研究发现有中和抗体的患者没有极高的S或RBD IgG效价。这表明病毒中和可能是由于较高的SIgA效价所致。例如，血清IgA水平高得多的病人11，与病人10相比，病毒中和率几乎增加了两倍(见表)。2)。此外，最近的一项研究发现，sars-cov-2感染导致患者血清中IgA中和抗体滴度早期升高，血清IgA中和抗体随时间的推移迅速下降。30。只有两名患者被研究，我们已经看到了同样的趋势(数据没有显示)，需要进一步的研究来阐明这一观察。

医护人员被认为是感染SARS-CoV-2的高危人群.在2020年5月，我们注册了来自肯塔基州路易斯维尔三个医疗保健系统的医护人员，负责同时检测病毒载量和抗体检测。该工人自用鼻拭子进行RT-PCR分析，并用手指棒采集血清。2名医护人员活动性病毒感染阳性，19人血清S或RBD IgG抗体阳性，血清阳性率为1.4%。在进行这项研究时，肯塔基州的发病率很低(每10万居民中有4.020人)，因此1.4%并不令人惊讶。与我们所发现的相似，发表的研究发现医疗工作者的各种阳性率从1.6%到31.6%不等。39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51。此外，并非所有研究都包括与整个社区感染率的比较，但范围从社区传播到社区报告数值的几倍不等。48,49,50,51与社区相比，医护人员的感染率更高。

对医护人员的病毒中和分析显示，19份阳性血清中有13份含有中和抗体。一些医护人员在微量化分析中没有中和SAR-CoV-2。这些人都有抗SARS-CoV-2S的IgG抗体，而没有IgA或IgM，也没有任何抗RBD的免疫球蛋白。造成这种情况的两个原因是交叉反应抗体的存在，尤其是对医护人员14或较低水平的IgG到S。医护人员5是一个非常罕见的发现，因为在这个个体中，S IgG水平并不表示血清呈阳性，然而，有明显的RBD IgG和抗体很好地中和了病毒。需要进一步的研究来证实这些发现。两名工作人员在研究中呈阳性，我们在病毒诊断后第6天和第7天能够检测到S、IgG和IgM的存在。1例患者有很强的免疫反应，显示出高水平的S免疫球蛋白，RBD免疫球蛋白和病毒中和。这一阶段研究的一个局限性是，由于128名工人没有足够的样本进行检测，而在一些阳性患者中，没有足够的样本来完成分析、终点滴度或重复分析。

在我们的医护人员第二轮研究中，我们对932人进行了SARS-CoV-2抗体检测。我们发现，在第2轮中，阳性率从1.4%上升到2.3%，与7月肯塔基州增加的事件率(每10万居民11.847起)相对应。值得注意的是，78.5%(11/14)的医护人员返回第二轮保持高水平的SARS-CoV-2抗体。例如，医护人员2在5月至7月期间维持高水平的S和RBDIgG、IgA和IgM水平以及病毒中和。在第2轮中，我们用RT-PCR技术检测了3名医护人员的活性病毒阳性.这些人的手指上没有检测到抗体，这是在同一天采取的鼻腔拭子，但个人发展到可检测的抗体在第4，9和14天后，病毒诊断。在未来，我们将跟进以前阳性的抗体或CPR医护人员，并跟踪他们的抗体发展。

我们的研究的一个局限性是，我们检查的大多数血清呈阳性的个体都有较强的免疫应答(ELISA Aus大于1.0)。在解剖图中。1除N IgM外，阴性抗体反应与阳性抗体反应有显着性差异。例如，S IgG数据(图1)。1)显示只有3例患者在0.2~1.0AU之间。因此，在我们的中华民国分析中，敏感性和特异性有很大的区别。然而，对医护人员研究的分析显示，阳性患者的值在0.2到1.0AU之间。例如，我们的研究中PCR阳性的患者18在感染后第6天和第7天的值分别为0.52和0.59 AU。这一灰色区域(在0.2到1.0Aus之间)显示了一些个体有中和反应，而有些则没有，因此增加SARS-CoV-2阳性队列将为ROC分析提供改进。此外，观察IgM和IgA水平，以确定血清阳性患者和预测中和活性是有用的。为了确定这一灰色区域的根本原因，我们正在实验室进行进一步的分析，因为我们分析了更多的血清阳性个体。疾病的严重程度和感染后的时间可能影响诊断效果。最近的一项研究表明，有症状者和无症状者之间有明显的区别，有症状者的RBD IgG滴度在统计学上更高。此外，研究还发现，在考虑症状性和无症状患者以及感染后检测抗体的时间时，诊断的敏感性和特异性值是不同的。52.

合格的血清学检测将继续是一个重要的工具，是在SARS-CoV-2大流行期间披露准确信息的核心。我们的阳性组和阴性组的样本数量是平均的，因此，当我们继续收集病人样本时，我们打算更新我们的ROC分析，以不断改善ELISA的阈值和性能特征。检测和了解针对SARS-CoV-2的抗体反应的血清学工具箱，对于了解当前的大流行和监测疫苗研制的免疫状况一直是至关重要的。本研究为医护人员的ELISA血清学检测、中和、了解SARS-CoV-2的广泛免疫应答及血清学阳性率提供了有价值的数据。