NK细胞成熟和活化过程中Eomes与T-BET的相互平衡 为了探讨T-BET和Eomes在NK细胞中的作用，我们首先测定了两种TFs在成熟过程中的表达。为了明确分析NK细胞，排除ILC1s，我们将NK细胞定义为CD49B。 + CD49A − NK1.1 + CD3 − 并根据CD11b/CD 27分类进行成熟分析(附图)。 1A )。流式细胞仪检测表明，脾脏NK细胞Eomes在1~2期表达较相似，在第3期NK细胞中表达较低，而T-BET则呈倒数表达(图1)。 1A )。在骨髓中，Eomes水平与脾脏相同，而T-BET水平明显低于脾脏NK细胞(补充图)。 1B )，正如我们以前所观察到的 4
图1：NK细胞成熟过程中Eomes和T-BET相互平衡. a 流式细胞术检测WT门控NK细胞T-BET和Eomes Tbx 21 +/− Tbx 21 −/− 、Ncr1 CRE/+ 埃梅斯 +/+ Ncr1 CRE/+ 埃梅斯 LOX/+ 埃梅斯 +/− )和 Ncr1 CRE/+ 埃梅斯 LOX/LOX 埃梅斯 −/− )老鼠，如所示。BAR图显示脾门控NK细胞Eomes和T-BET染色的平均±SD荧光强度(MFI)。数据代表3个实验，每组3只小鼠。 b 用流式细胞仪检测WT脾细胞O/N的表达，流式细胞仪检测T-BET和Eomes的表达。BAR图显示门控NK细胞Eomes和T-BET染色的平均±SD荧光强度(MFI)。数据代表2个实验，每组3只小鼠。 c 图像流X(ISX)分析门控NK细胞T-BET和Eomes的表达.有代表性的图像显示了三个NK细胞亚群。CD 122染色显示膜。 d 用IDEA软件分析门控NK细胞亚群中核T-BET和Eomes的定量。条形图显示所述亚群的T-BET和Eomes的核MFI，并与未成熟CD11b-NK细胞中每个TF的水平标准化。 N CD11b-、DP和CD 27-亚群的分析分别为1232、5157和22403。 e NK细胞以未成熟或成熟的亚群从WT小鼠中分离出来，然后进行细胞核(DAPI)、T-BET、Eomes和CD 122共聚焦显微镜分析。所示为未成熟NK细胞的每种染色和组合的代表性图像。图像是三个单独实验的代表。未配对t 试验(双尾)用于对图中数据的统计分析。
我们用 Tbx 21 −/− 老鼠和 NCR 1-iCre +/− 埃梅斯 Fl/fl 老鼠(称为 NK-Eomes −/− 研究T-BET或Eomes缺陷对NK细胞发育的影响.我们注意到在老鼠身上 埃梅斯 ，NK细胞有接近正常水平的Eomes蛋白，而在只有一份拷贝的小鼠中 Tbx 21 ，该TF水平约为WT小鼠的一半(图1)。 1A )。T-BET缺陷NK细胞(即 Tbx 21 −/− 小鼠)，Eomes在所有亚群中也有较高的表达，而Eomes缺乏的NK细胞(即 NK-Eomes −/− 小鼠有较高的T-BET表达(如图所示)。 1A )。这表明Eomes和T-BET在NK细胞中相互抑制，或一个TF的缺失使另一个TF的蛋白表达稳定。细胞因子体外刺激后，IL-15维持T-BET和Eomes水平，而IL-12和IL-18(与IL-15联合作用)则使T-BET的调节增强，Eomes减少，进一步支持NK细胞成熟或激活时Eomes与T-BET相互平衡的概念(图1)。 1B ).
以前的一篇文章报道T-bet和Eomes同时存在于记忆CD8的细胞核和细胞质中。 + T细胞 35 这增加了对这两个信托基金的另一层监管。为了分析Eomes和T-BET的核表达情况，我们采用图像流式细胞术(Image-Stream)和共聚焦显微镜技术。图像流分析使我们能够量化Eomes和T-BET的核分数，这是由DAPI染色确定的(如图所示)。 1C )。用这种方法，我们发现NK细胞的成熟与Eomes和T-BET之间的核比率逐渐变化有关，从高Eomes/低T-BET到低Eomes/高T-BET(图1)。 1D )。共聚焦显微镜分析表明，Eomes和T-BET在NK细胞中主要是核的，并提示它们在未成熟的核区域都定位在相同的核区域(图1)。 1E )和成熟的NK细胞(补充图)。 1C ，另见补充图中的相关分析。 1D ).
Eomes对NK细胞的早期发育和T-BET诱导的终末成熟具有重要的抑制作用。 先前对T-BET和Eomes在NK细胞发育中的作用的分析被一项不区分NK细胞和ILC 1的门控分析所阻碍。 22 。因此，我们重新探讨了这两种肿瘤因子在NK细胞发育和成熟中的作用。 Tbx 21 −/− NK-Eomes −/− 和适当的对照小鼠通过仔细地门控NK细胞(CD49B) + CD49A − 不包括ILC 1(CD49A) + CD49B − )(见附图。 1 )。T-BET和Eomes对NK细胞的稳态有重要作用(图1). 2A )。但Eomes在NK细胞数量上比T-BET起着更重要的作用，即Eomes的缺乏使骨髓和脾脏中的NK细胞数量下降了5~10倍，而T-BET的缺乏反而增加了BM-NK细胞的数量，使脾脏NK细胞的数量减少了2倍(图二)。 2B )。在观察成熟阶段时，Eomes对所有NK细胞亚群的积累是必不可少的，尤其是DP，与对照组相比，DP在BM和脾脏NK细胞总数中所占的比例均有所下降(图1)。 2C )。未成熟CD11b数量大幅减少 − 与T-BET不同，在缺乏Eomes的BM中，NK细胞在NK细胞的早期发育中起着重要的作用。值得注意的是， NK-Eomes −/− CD49A对小鼠没有补偿作用 + ILC 1或CD49B + 或CD49B − (补充图。 2A ).
图2：Eomes和T-BET促进NK细胞在不同细胞转变过程中的存活和分化. a 流式细胞术检测小鼠骨髓或脾淋巴细胞NK细胞百分比。每个点对应于一个鼠标( n =5~6只小鼠，每组2只)。 b 根据下列数据计算的NK细胞数量： a )与相应器官的计数相结合( n =5-6，由2个实验汇集而成)。 c 小鼠骨髓和脾淋巴细胞NK细胞亚群的比例和数量。每个点对应于一个鼠标( n =5~6只小鼠，每组2只)。 d 用流式细胞术(FACS)对所述亚群(CD11b-或DP)的NK细胞进行FACS分类，然后过继转入未辐照的Ly5aXB6小鼠(CD45.1/2)。2周后，纯化小鼠脾NK细胞，流式细胞仪检测转移的NK细胞CD11b/CD 27表型(CD 45.2表达)。 n =2-6，由2个实验汇集而成)。在图中的所有图中。 2 ，给出了平均测量值±SD。未配对 t 试验(双尾)用于对图中数据的统计分析。
T-bet缺乏导致dp在bm中的百分比和数量上的积累，并且几乎缺乏cd 27。 − 分析两个器官中的细胞。 2C )，如先前所示 4 ,21 证实了该TF在NK细胞终末成熟中的重要作用。我们还观察到了klrg 1的反向表达模式，在没有Eomes和t-bet的情况下，klrg 1在终端成熟的NK细胞中高表达，即klrg 1的百分比增加。 + NK细胞和NK细胞在NK细胞亚群中所占比例分别低于对照组，提示T-BET促进了NK细胞的成熟，Eomes则抑制了NK细胞的成熟。 2B )。为了进一步测试这一点，我们在成熟阶段1和2中对NK细胞进行了分类。 Tbx 21 −/− NK-Eomes −/− 并将其转入未经照射的Ly5aXB6(CD45.1/2)小鼠。转移后的NK细胞在脾成熟状态分析前接受2周的驯化。与对照组相比，Eomes和T-BET缺乏的NK细胞的回收率均较低(补充图)。 2C )。但是， NK-Eomes −/− 无论是第一阶段还是第二阶段的NK细胞仍然存在。 埃梅斯 -不足(附图) 二维空间 )，未分化为ILC1s(附图)。 2E )，对CD27-CD11b有加速成熟的作用。 + 第三阶段与对照相比，同时 Tbx 21 −/− NK细胞有相反的行为(图)。 二维空间 证实了两种TFs对NK细胞成熟率的拮抗作用。这些结果共同证明了Eomes和T-BET在NK细胞分化中的序贯作用.此外，他们还表明，在缺乏Eomes的情况下，少数正在发育的NK细胞会变得更加成熟，这可能是由于过量的T-BET所致。
Eomes和T-BET促进NK细胞在不同成熟阶段的存活 为了进一步记录Eomes和T-BET在NK细胞发育和动态平衡中的作用，我们接下来评估NK细胞亚群在没有任何一种因素的情况下的增殖和存活。用EDU掺入法或Ki 67染色法检测NK细胞增殖情况。NK细胞的主要增殖爆发通常发生在获得bm中的cd11b整合素之前。 36 。令人惊讶的是， 埃梅斯 缺失不改变未成熟CD11b的增殖水平 - NK细胞在BM中增加，而DP在此室增加。在脾脏里，所有的 NK-Eomes −/− NK细胞亚群增殖率增加，尤其是CD11b-和DP(图1)。 3A 和补充图。 3A ). Tbx 21 缺失可提高CD 27成熟细胞的增殖率 − 在骨髓和脾脏中，NK细胞和DP的作用较小，而CD11b-NK细胞几乎不受影响。
图3：Eomes和T-BET对NK细胞的增殖和存活有不同程度的调节. a 在两天内给小鼠注射两次EDU，最后一次注射后第一天用流式细胞仪测定小鼠NK细胞的EDU掺入量。每个点对应于一个鼠标( n =6，由2个实验汇总而成)，图表显示平均百分比±SD。 b Annexin-V染色流式细胞术检测骨髓和脾脏NK细胞亚群的体外凋亡 n =5-6，由2个实验汇集而成)。条形图显示每个子集内Annexin-V+细胞的平均百分比±SD，点对应于被分析的小鼠个体。c NK细胞总活性。BAR图显示在一定浓度下用IL-15培养48 h后Annexin-V阴性细胞的平均百分比±SD。数据来源于2组独立实验的3只小鼠。 d 流式细胞术检测NK细胞CD 122的表达条形图显示MFI±SD(每只鼠标分析一个符号)。成对t 对图中所列数据进行了统计分析。数据来源于2组独立实验的3只小鼠。未配对 t 试验(双尾)用于对图中数据的统计分析。
两种基因敲除模型小鼠外周血NK细胞增殖的增加可能与NK细胞缺乏消耗IL-15的作用有关。为了解决这种可能性，我们转移了ctv标记。 埃梅斯 −/− 或 Tbx 21 −/− 3B , Tbx 21 −/− 埃梅斯 −/− NK细胞的增殖接近正常，说明Eomes对NK细胞的增殖没有本质的调节作用.
为了解释这两种因子缺失后NK细胞的减少，我们假设这两种因子都能调节它们的存活。的确，Annexin-V的凋亡百分比 + Dp细胞在脾和骨髓中均无Eomes的情况下增加。同样，凋亡的Annexin-V百分比 + CD 27 − 在无T-BET的情况下，NK细胞在BM和脾脏中均增加(图1). 3B )。IL-15是NK细胞存活的主要介质。 37 我们接下来评估Eomes和T-BET是如何调节对这种细胞因子的反应的.与IL-15共培养48h后，Eomes和T-BET缺陷NK细胞的存活率均较对照组降低(图1)。 3C )表明Eomes和T-BET的平衡表达对于对IL-15的最佳反应是必要的.在子集水平上，T-bet缺陷CD 27的存活率下降。 − NK细胞，和Eomes缺陷的DP NK细胞(补充图.) 3C )。T-BET缺失组CD 122表面水平高于对照组，Eomes缺陷NK细胞CD 122表面水平低于对照组(图4)。 三维空间 T-BET和Eomes调节IL-15介导的存活，而不仅仅是通过调控CD 122的表达。总之，这些数据表明，Eomes和T-BET以顺序的方式促进成熟的NK细胞的存活，这可能涉及对IL-15的反应性进行微调。
Eomes和T-BET在指导NK细胞成熟过程中的互补作用 其次，为了了解T-bet和Eomes在NK细胞发育和成熟过程中的作用机制，我们在未成熟的CD11b和成熟的CD 27中进行了rna-seq。 − NK细胞 Tbx 21 −/− NK-Eomes −/− 和控制老鼠。根据Eomes在未成熟细胞中的优势表达(见图)。 1 我们发现Eomes的缺失而T-BET的缺失对未成熟NK细胞的基因表达有很强的影响(图1)。 4A，B 和补充数据 1 )。相反，在成熟的NK细胞中，T-BET在基因转录方面的作用要比Eomes显著得多。 4A，B )。在检测差异表达基因(DEGS)时，Eomes更多的是基因表达的反式激活物(未成熟NK细胞为84%，成熟NK细胞为52%)，而T-BET更常抑制基因表达(成熟NK细胞中DEG的63%)。 4B )。我们查询了Immgen数据库。 38 观察Eomes和T-BET调控基因在整个免疫系统中的表达模式。Eomes诱导的基因是NK特异性的，而T-BET激活的基因有一个更广泛的表达模式(补充图)。 4A )。Eomes抑制基因和T-BET抑制基因的表达模式比较相似，而T-BET在抑制造血祖细胞或B和T细胞祖细胞表达的基因方面更具有特异性(附图)。 4B )。值得注意的是，在未成熟的NK细胞中有23/91的基因决定了以前由Immgen财团定义的NK细胞特征。 38 ,39 ，而在这个列表中，只有4个基因受到T-BET的调控(如图所示)。 4C )。相反，在成熟的NK细胞中，有25和6个基因分别受到T-BET和Eomes的调控。 4C )，表明Eomes和T-BET都有助于界定NK细胞的身份，但以顺序的方式进行。
图4：Eomes和T-BET在NK细胞成熟过程中对NK细胞的转录有不同的作用. 排序的RNA-seq分析 Tbx 21 −/− 埃梅斯 −/− 和适当的控制CD11b-和CD 27。 − NK细胞( n =每组3人，共三种)。DEG是根据调整后选择的。 p < 0.05 (as determined by use of negative binomial generalized linear models). a 未成熟CD11b或成熟CD 27基因表达的火山图 − NK细胞与正常对照比较T-BET或Eomes缺陷细胞。选定的基因用它们的名字突出显示。 b 条形直方图显示T-BET或Eomes诱导或抑制的基因在未成熟和成熟的NK细胞中的数目。 c Venn图显示未成熟和成熟NK细胞的Immgen定义NK细胞标记与Eomes激活和T-BET激活基因之间的重叠。 d Venn图显示未成熟和成熟NK细胞中T-BET调控基因与Eomes调控基因的重叠。 e 比较WT未成熟NK细胞和成熟NK细胞T-BET或Eomes依赖基因的表达。选定的基因用它们的名字突出显示。DEG是根据调整后选择的。 p < 0.05 (as determined by use of negative binomial generalized linear models). f Venn图显示了T-BET依赖基因、Eomes依赖基因和成熟调控基因之间的重叠.
总之，在未成熟和成熟的NK细胞中，T-BET和Eomes依赖基因之间有有限的重叠(图一)。 4D ，补充数据 1 114/166(68%)Eomes依赖基因不受T-BET调控，691/744(92%)T-BET依赖基因不受Eomes调控。我们还观察了Eomes和T-BET之间的相互调节.在没有T-BET的情况下，EomesmRNA有增加的趋势，反之亦然(补充图)。 4C )但这在统计学上并不显著，表明转录后机制可能有助于解释图中观察到的结果。 1 蛋白质水平。
在NK细胞成熟过程中，82/166 Eomes依赖性基因(52%)和250/744 T-BET依赖基因(35%)受到调控。 4E、F )。反过来，在NK细胞成熟过程中，294/699个正常调控基因依赖于Eomes或T-BET(42%)。 4F )，证实这两种因素都是NK细胞成熟的主要驱动因素，起着互补的作用。
T-BET和Eomes对NK细胞转录体的特异和共同作用 为了确定Eomes和T-BET赋予NK细胞的哪些特性，我们对图中描述的基因模块进行了功能注释。 4 .
在未成熟和成熟的NK细胞中，T-BET和Eomes只有一个基因共同调控：Cym，它编码NK细胞中一种未知功能的肥大细胞酶(图1)。 4D )。另外52个基因在至少一个比较中受到T-BET和Eomes的调控(图1)。 4D )。此基因模块在图中详细展示。 5 包括三个子集：两个TFs抑制的基因(图1)。 5A，B )，由T-BET和Eomes诱导的基因。 5C-F )或由Eomes诱导但被T-BET抑制的基因(如图所示)。 5G-I ).
图5：NK细胞中T-BET和Eomes的共同转录活性。 排序的RNA-seq分析 Tbx 21 −/− 埃梅斯 −/− 和适当的控制CD11b-和CD 27。 − NK细胞( n =每组3人，共三种)。DEGS是根据调整后的 p < 0.05. a T-BET/Eomes共抑制基因在未成熟或成熟NK细胞中的表达。条形图显示正常小鼠和T-BET或Eomes缺陷小鼠之间基因的log 2转化的翻倍变化，如所示。 b 用流式细胞仪检测各基因型NK细胞IL7R表达的平均±SD值。每个基因型的不同控件在图中被合并并注释为“WT”，这对于以下图来说是相同的( d , h –j ). N =3。 c 在未成熟或成熟的NK细胞中T-BET/Eomes共诱导基因，条形图显示正常小鼠与T-BET或Eomes缺陷小鼠之间基因的转化倍数变化。 d 用流式细胞仪检测各基因型NK细胞GZMA表达的平均±SD值。 N =3。 e T-BET/Eomes诱导基因集的功能注释。条形图显示了最重要的术语中的选定术语。 f 细胞毒性试验 Tbx 21 −/− 埃梅斯 −/− 和适当的控制CD 27 − NK细胞为效应细胞，RMA-KR-Nano-Luc细胞为靶细胞.细胞毒性的平均值为±SD。数据来自每组3只老鼠，来自两个独立实验。 g 如图所示，log 2转化了T-BET和Eomes以相反方式调控的基因在对照组和T-BET或Eomes缺陷小鼠之间的折叠变化。 N =3-6。 h –j 显示CD 27平均±SD的条形图( h )、CD 69( i )和dNaM-1( j )流式细胞仪检测所述基因型NK细胞的表达。 N =3.未配对 t 试验(双尾)用于对图中数据的统计分析。
T-BET/Eomes-共抑制基因(图1)。 5A )值得注意的是，包括一组与细胞周期有关的基因( TOP2A , Ccna 2 等等)，以及 Il7r ，是淋巴祖细胞和ILCs的标记基因。IL7R在两种蛋白水平上的表达也较高。 Tbx 21 −/− 和 NK-Eomes −/− NK细胞与对照组比较(图1)。 5B ).
T-BET/Eomes共诱导基因(图1)。 5C )在未成熟NK细胞中含有Eomes诱导的基因，在成熟NK细胞中包含T-BET诱导的基因。这一组由颗粒依赖性细胞毒性的关键介质组成，如 Prf 1 , 格兹马 和 Serpinb9b ，“细胞杀伤”是该基因集功能注释中的重要术语之一(图1)。 5E )使用Metasscape 40 。在蛋白水平上，我们证实GZMA在T-BET和Eomes缺乏的NK细胞中都有很强的降低作用。 5D ). CMA 1 编码另一种肥大细胞蛋白酶，存在于颗粒中，也可能参与细胞毒性。我们使用一种适应低细胞数的新技术评估了Eomes和T-BET缺陷成熟NK细胞的细胞毒性潜力。 41 。T-BET缺陷的NK细胞具有正常的细胞毒性，而Eomes缺乏的NK细胞与对照组相比细胞毒性较弱(图1)。 5F )。T-BET/Eomes共诱导基因集也包括 S1pr5 这对于NK细胞从骨髓中流出是必不可少的。 10 ,42 。为了研究T-BET和Eomes是如何促成这一出口的，我们给T-BET和Eomes缺陷小鼠注射了抗CD45.2Ab 5分钟，因此只染出血液窦中的细胞。T-BET缺乏的小鼠骨髓和LN NK细胞的窦状部分减少，而Eomes缺乏的小鼠则无此现象(附图)。 5A )，表明即使两个信托基金都管理 S1pr5 T-BET是促进NK细胞血液循环的主要因素.缺乏T-BET和Eomes的情况下，NK细胞明显减少。然而，在T-BET缺乏的小鼠中，NK细胞仅在血液中减少(附图). 5B、C )而不是在BM中(如图所示)。 2A )，证实了T-BET在NK细胞血液循环中的特殊作用.
然而，有几个基因显示了T-BET和Eomes的相反的调节作用。 5G )，例如 CD 27 和 镉69 用Eomes诱导NK细胞，T-BET抑制NK细胞，我们也可以在蛋白水平上证实这一点(见图)。 5H，i )。这些基因通常在未成熟的NK细胞中高表达，在成熟的NK细胞中被抑制。 26 提示，当T-BET在末端成熟时被上调，它取代了这些基因启动子上的Eomes，并抑制了它们的表达。其他基因可能以相互作用的方式调控，即Eomes的抑制和T-BET的诱导。这就是 镉226 DNAM 1编码，其表达在mRNA水平上与KO之间没有统计学差异(补充数据) 1 )，但在蛋白质水平上却明显不同(如图所示)。 5J ).
Eomes-在标记NK细胞基因诱导中的作用 Eomes特异性基因(即在未成熟NK细胞或成熟NK细胞中受Eomes而非T-BET调控)主要包括Eomes诱导的基因(如图1所示)。 6A )。Eomes激活基因的功能注释提示NK细胞的激活、细胞毒性和干扰素γ的产生之间存在联系(见图)。 6B )。事实上，这个模块包含了大量的NK细胞受体( Klra 8，Klre 1，Klra 4，Klrc 2，Klrg 1 )和信令适配器SAP(由 Sh2d1a )，表明Eomes参与了NK细胞受体的诱导及相关信号和功能的发挥。事实上，当我们在蛋白质水平上观察一系列NK细胞受体的表达时，我们观察到一些LY 49或SLAM受体在缺乏Eomes的未成熟NK细胞中的表达缺陷(如图所示)。 6C ).
图6：Eomes-在NK细胞基因的诱导中的特异性作用。 排序的RNA-seq分析 Tbx 21 −/− 埃梅斯 −/− 和适当的控制CD11b-和CD 27。 − NK细胞( N =每组3人，共三种)。DEGS是根据调整后的 p < 0.05. a 在未成熟或成熟的NK细胞中由Eomes调控的基因。条形图显示正常人与Eomes缺乏的NK细胞之间的log 2转化的折叠变化，如所示。列出了几个选定的基因名称。 b Eomes诱导基因集的功能注释。条形图显示了最重要的术语中的选定术语。 c –e FACS直方图显示Eomes缺陷的表面分子与控制未成熟NK细胞的表达有关。灰度直方图显示对照染色。 f 热图显示log2改变了正常人和Eomes缺陷NK细胞之间所指示的TF表达的折叠变化。 g 方法中详细分析了所指示的亚组，并对其进行了scRNA-seq分析。热图显示了每个样本的平均剖面之间的相关性，这是在前100位最易变基因上计算的。
Eomes还激活CD11b整合素的表达(由 ITGAM 、图1. 6d )，以及与细胞毒性功能相关的基因，如 FasL 和 GzmK 或贩运活动，如CD62L(编码为CD62L) 卖 、图1. 6E )或含有CCL 5颗粒的趋化因子。最后，Eomes诱导了许多功能未知的基因的表达，如 Khdc1a 和 Khdc1b 和几个印度RNA( 奇迹1，Gm 12596 等，见补充数据 1 ).
为了确定Eomes转录活性的下游介质，我们还检测了依赖于Eomes的TFs的表达。我们发现 Kcnip 3，Lzts 1 和 Bhlhe 40 在未成熟或成熟的NK细胞中，在Eomes缺失的情况下受到下调(如图所示)。 6f ). Bhlhe 40 在记忆T细胞中促进线粒体代谢。 43 因此也可以调节NK细胞的发育。Eomes也是TFs子集的一个特定的抑制者，包括 Cebpg，Cbx 2，Zfp 689 和 Zfp 683 。后者，也被称为霍比特，以前被证明是ILC 1开发的关键。 44
这表明 埃梅斯 −/− NK细胞与白细胞介素1(ILC1s)密切相关，尽管它们被控为CD49B+CD49A−。为了解决这一点，我们对cd11b进行了单细胞rna-seq分析。 − 和CD11b + NK细胞及来自WT和NK的ILC1s 埃梅斯 −/− 老鼠。结果如图所示。 6g ，补充图。 6 和补充数据 2 显示 埃梅斯 −/− NK细胞除ILC1s外，还与WT NK细胞聚集，说明Eomes的丢失不足以诱导NK细胞在发育过程中重编程为ILC1s。
T-BET在抑制多能性和细胞增殖中的作用 T-BET特异性基因代表一大群基因，其中三分之二的基因被T-BET抑制，而其他的基因则被这个TF所诱导(如图1所示)。 7A 选择的基因和补充数据 1 关于完整的清单)。T-BET抑制基因的功能注释检索到“细胞周期”和相关术语为最重要的术语(图1)。 7b )。“适应性免疫”、“造血细胞谱系”、“T细胞活化”和“髓系细胞分化”是反映T-BET抑制其他免疫系表达的祖/多能基因或基因的重要术语。例如，T-BET强烈抑制 Tcf7 或CD3亚基。 CSF 2 GM-CSF的编码也被T-BET所特异抑制，而不被Eomes所改变.
图7：t-BET在抑制多能性和细胞增殖中的特异性作用。 排序的RNA-seq分析 Tbx 21 −/− 埃梅斯 −/− 和适当的控制CD11b-和CD 27。 − NK细胞( n =每组3人，共三种)。DEGS是根据调整后的 p < 0.05. a 成熟CD 27中T-BET特异性调控基因 − NK细胞条形图显示正常小鼠和T-BET缺陷小鼠之间的log 2转化折叠变化，如所示。列出了几个选定的基因名称。 b T-BET抑制和T-BET诱导基因集的功能注释.条形图显示了最重要的术语中的选定术语。 c 转录因子、组蛋白亚基或组蛋白修饰酶，其表达依赖于T-BET.热图显示对照组与T-BET缺乏的成熟NK细胞表达的log 2转化倍数变化。 d 流式细胞术分析白细胞介素-12(IL-12)刺激1 h后WT与T-BET缺陷NK细胞STAT 4磷酸化的变化，结果显示MFI±SD。数据来源于两组实验的3只小鼠。 e –f 流式细胞术分析表明基因型的门控脾NK细胞在添加或不加IL-12和IL-18的培养基中细胞内IFNγ的表达。BAR图显示IFNγ阳性NK细胞的平均百分比±SD。 N =6只小鼠。未配对 t 试验(双尾)用于对图中数据的统计分析。
基因抑制可能是通过T-BET诱导的其他TFs直接或间接的。事实上，与T-BET诱导基因相关的最重要的功能术语是“基因表达的负调控，表观遗传”。事实上，T-BET诱导了一大群组蛋白亚基的表达( 组织1h1c，组织1h1e，组织1h3a 或组蛋白甲基化酶( Phf 1，HDAC 5，Ezh1，Epc 1 、图1. 7C )。此外，T-BET还特异性地诱导了许多转录抑制子的表达。 7C )，其中一些已经知道可以调节NK细胞的成熟，例如 ZEB 2 26 和飞艇(由 Prdm 1 )45 ，还有其他一些类似的 波克 或 塞塔德1 在NK细胞中没有被描述的作用。
T-BET诱导基因的功能分析(图)。 7b )还检索到白细胞介素-12通路和白细胞介素-12信号通路，这反映了T-BET赋予NK细胞对细胞因子特异性反应的能力。特别是T-BET诱导了IL-12和IL-21受体的表达.因此， Tbx 21 −/− 用STAT 4磷酸化法测定NK细胞对IL-12的反应能力有缺陷(图1)。 7D )，以及 Tbx 21 −/− 但不是 埃梅斯 −/− IL-12/18刺激后，干扰素γ分泌受损(图1)。 7E、F )。“大自噬”也与T-BET诱导的基因有关。 7b )而与合成途径相关的几个术语则与T-BET抑制基因有关。这与已知的自噬在NK细胞发育和存活中的作用有关。 46 ，随着细胞凋亡的增加，在T-BET的作用下观察到的凋亡增加。 19 (无花果) 3 ).
重要的是，即使t-bet在NK细胞中高表达，我们也不能排除在 Tbx 21 −/− NK细胞可能与T-BET在NK细胞环境中的作用有关.为了解决这种可能性，我们从Ly5a(CD45.1)和 Tbx 21 −/− 小鼠(CD 45.2)分为亚致死照射的Ly5axC57BL/6小鼠(CD 45.1/2)。移植后8周，我们对Ly5a进行了23参数流式细胞仪表征。 Tbx 21 −/− Tbx 21 −/− )。如附图所示。 7 ，测量到的各参数的表达率与WT值之间存在着很强的相关性。 Tbx 21 −/− 提示T-BET对NK细胞的作用主要是细胞内的作用。
Eomes和T-BET共享它们的大部分DNA结合位点。 为了补充RNA-seq分析，我们试图识别NK细胞中的T-BET和Eomes结合位点.为了减少实验的可变性，避免与使用不同抗体有关的偏见，我们建立了两种小鼠模型，允许使用相同的抗体对T-BET和Eomes进行芯片-seq分析。在这些模型中，在 Tbx 21 和 埃梅斯 编码序列(图1. 8A ，见“方法”)。流式细胞仪和WB分析证实了标记的T-BET和Eomes在NK细胞中的表达，尽管HA-V5标记在一定程度上降低了Eomes和T-BET的表达(附图)。 8A，B )。在HA-V5标记的小鼠株中均有正常频率的NK细胞存在(附图)。 8C )，但HA-V5标记影响T-BET-HA-V5小鼠NK细胞的成熟(附图)。 8D )。然而，后者的影响远不如在 Tbx 21 −/− 因此，我们使用HA抗体对这两种模型中的NK细胞进行了Eomes和T-BET的芯片-seq检测。我们验证了Eomes和T-BET可以被HA抗体通过Eomes和T-BET Westernblotting(补充图)而降低。 8E )。T-BET在Eomes被拉下来时没有共同免疫共沉淀，反之亦然(补充图)。 8E 表明这些TFs不相互作用，至少在静止的NK细胞中是如此。
图8：用新型Ki小鼠鉴定直接T-BET和Eomes靶标。 a 破门而入计划 埃梅斯 和 T-打赌 HAV 5结构。 b Eomes和T-BET峰的分布与不同的基因组特征有关。“上游调控区”是指位于−20 kb/−1 KB的区域，“启动子-TSS”是指位于TSS周围−1 KB/+100 bp的区域，“TSS”是指在TSS周围−100 kb/+1KB的区域。 c 维恩图显示Eomes和T-BET芯片-seq峰之间的重叠。 d Venn图显示了Eomes附近基因与T-BET芯片-seq峰之间的重叠。 e –f 与( e )Eomes或( f )T-BET峰和相应的TFs( E -数值是显示的，而不是排序的)。 g 由T-BET和/或Eomes(芯片-seq数据)结合的基因的表达(RNA-seq数据)。没有任何一种基因的表达作为参考。所分析的基因数目如图所示。给出了极小值和极大值。中心给出平均表达式，盒子给出10-90百分位数. P 数值用Wilcoxon符号秩检验计算。 h 维恩图显示了Eomes结合基因(片-seq)和Eomes调控基因(rna-seq)之间的重叠。 i Venn图显示T-BET结合基因(芯片-seq)与T-BET调控基因(RNA-seq)之间的重叠.在小组内( c , d , h , i ) p 数值是通过超几何测试计算的， p 分别为0；0；5.61133e-40；6.440556e-96。
芯片-seq实验在每种基因型的两个重复上进行，以C57BL/6 NK细胞为对照，对对照细胞进行峰值呼叫。我们控制了每个芯片的两个复制的相似性-seq(补充图)。 9A )。T-BET和Eomes都被发现常常与假定的启动子或内含子区域结合，相对于转录起始点则很少被绑定到更远的位置(图一)。 8B )。我们发现Eomes和T-BET的结合位点数目相当(分别为5682和4774，图1). 8C )。大约一半的峰值是在两个信托基金之间共享的(如图所示)。 8C )根据片-seq峰值调用算法。在用最近的TSS方法给每个峰分配基因时，保持相同的比例(如图所示)。 8D )。这表明T-BET和Eomes竞争它们的许多结合位点.这一结论在可视化所有Eomes和T-BET峰的热图时更加明显(补充图)。 9B )或这些峰的平均轮廓(附图)。 9C )表明大多数结合位点实际上是T-BET和Eomes之间共享的.重要的是，控制芯片-seq只在T-BET和Eomes结合位点的位置产生背景值(补充图). 9B、C )，验证了芯片-seq分析的特异性。此外，在我们的研究中发现的Eomes和T-BET峰也在以前使用抗Eomes或抗T-BET抗体的NK或活化CD8 T细胞的研究中被发现。 S9D，E )。最后，我们用fimo工具扫描了eome和t-bet芯片seq峰。 47 发现T盒基序出现在973个Eomes峰和786个T-BET峰(每种情况下约占20%)。为了以无偏的方式确认这一点，我们使用模因芯片motif发现套件，对t-bet和eomes芯片seq峰下的tf结合基元进行了新的检测。 48 。正如预期的那样，典型的T盒基序在Eomes和T-BET峰下都得到了丰富，尽管对Eomes来说更显着(如图所示)。 8E、F )。在EMES和T-BET峰下也普遍富集其他基元，如RREB 1、RUNX 1/3、SP1和PBX 3基序。然而，也有一些特定的基因，如FLI 1，以前被发现可以调节NK细胞的发育。 49 和T-bet特异性结构，如STAT 4，它在IL-12下游运行，是NK细胞活化的表观遗传调节因子。 50
然后，我们结合芯片-seq分析和我们的RNA-seq结果，试图识别直接的T-BET和Eomes目标基因。与T-BET或Eomes结合相关的基因在一般情况下比没有结合的基因表达要高得多(如图所示)。 8g )，并没有进一步影响这一表达。在我们发现附近Eomes芯片-seq峰的基因中，wt和wt之间有79个差异表达。 NK-Eomes −/− NK细胞 8H )。这组功能性Eomes靶标在大多数情况下(58/79，73%)是由Eomes(补充图)诱导的。 10A 和补充数据中的完整列表 3 )，特别是含有许多与细胞毒性有关的基因( FasL，GzmA，Prf 1 )、NK细胞受体( Klre 1，Klrg 1 )、NK细胞贩运( S1pr5，出售 )，化学吸引( CXCR 3，CCR 5 )或转录( Bhlhe 40，Prdm 1 )，而直接被抑制的基因包括 Zfp 683 (霍比特)和 Ptpn 6 (SHP 1)直接Eomes目标的芯片-seq轨迹的例子显示在补充图中. 10b .
在我们所发现的T-bet芯片-seq峰附近的基因中，有225种基因在WT和wt之间有差异表达。 Tbx 21 −/− 成熟NK细胞 8I ，补充图。 10C 和补充数据 3 )。其中97条与T-BET诱导的基因相对应，主要包括TF( ZEB 2，Blimp 1，Id2，IRF 8 )，许多细胞因子和细胞因子受体( IFNG，IL18r1，IL21r，IL12rb2 )，但也涉及细胞毒性的基因( FasL，Gzma，Gzmb，Prf 1 )或贩运( S1pr5 )。直接T-BET目标的芯片-seq轨迹的例子显示在补充图中. 10d .
最后，我们试图确定Eomes和T-BET结合是否与染色质重塑有关.为了解决这个问题，我们重新分析了一组已发表的关于NK细胞前体(NKP)、bm未成熟NK细胞(INK)和脾脏NK细胞(成熟或mnk)的atac-seq数据。 15 ...然后，我们比较了ATAC-seq剖面在Eomes或T-BET芯片-seq峰值位置之间的所有三个条件.补充图中的结果。 11A，B 表明ATAC在油墨或MNK中的分布与NKP相比，在这些位置上平均要强烈得多，这表明在Eomes或T-BET占位时NK细胞分化过程中染色质的开放。接下来，我们使用Tobias工具对atac-seq数据进行了足迹分析。 51 在ATAC-seq“脚印”中识别TF结合的主题。利用Tobias进行了NKP与油墨或NKP与MNK的差异TF结合分析。在这两种比较中，最显著的差异结合是针对一组T盒因子，与NKP、Eomes和T-BET组成的组分相比，它们在油墨或MNK中富集(补充图1)。 11C，D )。当比较油墨与MNK(补充图)。 11E )，该簇没有差异，说明T盒因子诱导的染色质重构主要发生在NKP向油墨的转变，即Eomes在T-BET中占主导地位。
