AAV8.CII注射液减轻DBA 1小鼠CII特异性免疫应答
到目前为止，AAV抑制抗体介导的自身免疫的能力还没有被测试过.在此，我们试图评价av 8在由胶原自身反应抗体介导致病性的小鼠CIA模型中的治疗效果。21。然而，由于AAV包装尺寸有限，无法使用天然的CII cDNA序列。相反，一个目标cDNA结构被设计成包含所有已知的CII-T细胞表位.我们预计，由此产生的AAV8.CII将产生调节性T细胞特异性的胶原Ⅱ，能够抑制细胞和体液对这个表位的反应。
首先，我们评价了AAV8.CII对同一CII表位进行Ad5.CII编码时，能防止胶原特异性体液和细胞反应的能力。Ad5.CII已被证明能激发对CII的免疫力，以模拟针对这种抗原的自身免疫状态。小鼠第一次接受尾静脉注射10。11AAV8.CII或AAV8.GFP的VG，后者用作非特异性抗原对照。14天后，以10只老鼠为攻击对象。10副总裁(图5)1(A)如前所述14。分别于Ad5、CII刺激后10d和28d检测T细胞和抗体反应。1a)。在Ad5.CII之前用AAV8.CII处理动物时，干扰素γ-ELIPOST只检测到T细胞对CII的反应水平(~25个点形成单位/10)。6)。这与Ad5.CII挑战前小鼠接受AAV8.GFP或PBS控制时形成对比，CII特异性T细胞(200和180 SFU/10)没有差异。6细胞)在这些动物中被注意到(如图所示)。1b)。对CII的体液反应在接受AAV8.CII预防的动物中表现出类似的减少模式，在那里他们显示了背景水平的抗CII IgG(19 ng/ml)。AAV8.GFP或PBS小鼠在Ad5攻击前，其抗CII IgG浓度(分别为30 ng/ml和28 ng/ml)无明显差异(图5)。1c)。这些结果表明，AAV8.CII对DBA 1小鼠的细胞和体液反应均能被抑制。这些结果也表明AAV 8的免疫调节是转基因特异性的，因为相同的AAV8.GFP没有表现出T细胞或体液反应的减少。
图1AAV 8介导的耐受是抗原特异性的。(A)小鼠(n=3/组)静脉注射10只。11AAV8.CII或AAV8.GFP的VG。第14天，小鼠静脉注射10只。10对照组小鼠注射磷酸盐缓冲液生理盐水(PBS)。(BAd5.CII注射后10d，用CII刺激肝非实质细胞，ELISPOT法测定IFN-γ的生成。使用iSpot软件(Version 7，Https://www.elispot.com/products/software/)。背景SFU值由水平虚线表示。(C第28天用ELISA法检测CII注射液抗CII IgG水平。背景CII反应性用水平虚线表示。给出了不同组间的平均扫描电镜(SEM)图。
Treg是AAV8.CII介导的自身免疫抑制的关键介质
肝脏Treg曾参与AAV 8介导的免疫抑制。18。为探讨CII免疫应答的抑制作用，采用流式细胞仪检测对照组和AAV8.CII处理小鼠肝Tregs的频率。用CD 45、CD3、CD4、CD 25和Foxp 3+的共表达和活/死染料染色不染色来定义活Treg(附图)。沙一)。与对照组相比，在接受AAV8.CII预防的小鼠中，Treg平均频率从CD4+T细胞的6%增加到12%。沙一).
在AAV8.CII治疗小鼠之前进行了Tregs的耗竭，以评估这种扩大的种群对T和B细胞反应的作用。对于Treg耗竭，小鼠在AAV8.CII注射后7天，腹腔注射了0.75毫克的PC 61，这是一种抗CD 25抗体(补充图)。S2)。7天后，小鼠注射Ad5。2a)。小鼠只注射Ad5，CII作为阳性反应对照。用干扰素γELISPOT分析CII特异性T细胞在Ad5.CII注射后10d的频率。用CII酶联免疫吸附试验(CII ELISA)分析小鼠注射Ad5后第28天体液对CII的反应程度(图5)。2b、c)。AAV8.CII预处理小鼠经Ad5.CII后，CII特异性T细胞及CII特异性IgG显著升高(P<0.0 5)。p分别=0.001和0.001)。事实上，CII特异性T细胞从109 sfu/10增加到6(SEM 13.47)模拟处理185 SFU/106耗竭小鼠细胞(扫描电镜17.27)2b)。同样，CII特异性IgG的数量几乎翻了一番，从90 ng/ml增加到150 ng/ml，在模拟治疗和Treg耗竭小鼠之间(图1)。2c)。值得注意的是，即使在未注射Ad5的情况下，PC 61处理的小鼠体内CII特异性细胞和体液反应也有所增加(补充图5)。S3).
图2AAV8.CII诱导的Tregs是耐受性的关键。(A)小鼠(n=3/组)静脉注射10只。11第7天腹腔注射生理盐水或0.75 mg的PC 61抗CD 25抗体。PC 61小鼠静脉注射10只后第7天10对照组仅注射磷酸盐缓冲液生理盐水(PBS)。(B)注射PC 61后10天，用CII法分离和刺激肝非实质细胞，ELISPOT法测定干扰素γ的生成，用iSpot软件进行斑点检测(Version 7，Https://www.elispot.com/products/software/). (C注射PC 61后第28天，用ELISA法检测血清抗CII IgG水平.背景值由水平虚线表示。平均值±扫描电镜(B、C).
总体而言，在接受PC 61的小鼠中，Treg细胞显著减少，而Tregs的减少伴随着CII特异性细胞和体液反应的增加。综上所述，这些数据表明Tregs参与了AAV8.CII介导的抑制CII免疫应答。
IL-10对AAV8具有调节和重要作用。CII介导的抑制CII特异性免疫
为了更好地理解AAV8.CII依赖于Treg的免疫调节过程中所涉及的可溶性介质。用免疫印迹法检测CII刺激对照组和AAV8小鼠肝非实质细胞的细胞因子谱。为此，小鼠在注射Ad5前14天接受生理盐水或AAV8，10天后进行安乐死。用Ficoll法从肝匀浆中分离出非实质细胞，共10株。6细胞在收集上清液前用0.1ug/mlCII刺激4天。3a)。然后用细胞因子蛋白质组轮廓仪分析22种细胞因子的表达情况。总的来说，与只接受Ad5.CII的小鼠相比，接受AAV8.CII预防的小鼠细胞因子反应似乎略有升高。然而，只有IL-10的表达水平增加了两倍以上(如图1所示)。3a)。
图3IL-10升高对CII的耐受性至关重要.(A)小鼠(n=3/组)静脉注射10只。11第14天，小鼠静脉注射10只。10Ad5.CII注射后10d，在CII存在下，用抗CD3和抗CD 28培养肝非实质细胞，96~h后收集培养上清液，进行细胞因子合成分析。CII刺激肝非实质细胞产生细胞因子的斑点杂交分析。用ImageJ软件测量像素密度(1.51版)；Https://imagej.nih.gov/ij/). (B用ELISA法测定细胞培养上清液中IL-10的含量。除部分小鼠在AAV8给药后7d内注射0.75 mg的PC 61抗CD 25抗体外，其余均为A组。CAd5.CII注射后10d，用CII刺激肝非实质细胞，ELISPOT法测定IFN-γ的生成。使用iSpot软件(版本7，Https://www.elispot.com/products/software/)。除一组小鼠在AAV8.CII注射前2天和注射后2天腹腔注射1 B1.3A抗IL-10R抗体0.75 mg外，其余均为A组。(A-C)各组平均±扫描电镜。
为了进一步探讨IL-10的起源，我们重复了上述实验，并添加了一组Tregs用PC 61进行耗尽。ELISA法检测CII刺激肝非实质细胞上清液中IL-10的水平。来源于AAV8.CII而非Treg耗尽或模拟处理的小鼠肝非实质细胞培养中，IL-10的产生随着OD从背景水平增加到OD值为0.35而升高。在AAV8.CII后接受PC 61的小鼠体内刺激后，IL-10水平没有增加。3b)。这些结果表明，在对CII的反应中检测到的IL-10的产生与Treg细胞有关。
最后，我们试图评估IL-10在AAV8.CII介导的抑制CII特异性细胞反应中的重要性。为了做到这一点，小鼠接受了如图所示的治疗。3用ELISPOT法检测C和CII特异性干扰素γ的产生。一组单独接受Ad5.CII的小鼠作为对照组(图1)。3c)。仅在接受Ad5.CII的小鼠中，大约有150 SFU/106CII特异性T细胞被检测到，而在AAV 8中，CII特异性T细胞反应仅出现在背景水平(20 sfu/10)。6)。有趣的是，AAV8.CII预防性注射IL-10R阻断mAb的小鼠在平均125 sfu/10的情况下显示出CII特异性T细胞应答。6细胞。这些结果共同提示AAV8.CII抑制CII特异性免疫至少在很大程度上是由IL-10介导的，而且这种IL-10主要来源于Treg细胞对CII的反应。
AAV 8介导的肝基因表达减轻胶原性关节炎的进展
在上述AAV8.CII抑制CII特异性体液和细胞反应的基础上，我们探讨了AAV8.CII抑制DBA 1小鼠CIA严重程度的可能性。小鼠在发病前14天接受AAV8.CII或生理盐水预防治疗，并在LPS引起的疾病发作后随访15天(图1)。4a)。如前面所述，疾病的进展是根据关节炎症进行分级的。26而对CII的IgG反应则采用ELISA法检测。在接受AAV8.CII预防的小鼠中，足底炎症大约减少了35%(附图)。S4)。此外，AAV8.CII处理小鼠抗CII IgG从模拟处理小鼠的60 ng/ml下降到接受AAV8.CII的小鼠的20 ng/ml。4b)。这些数据表明，预防性使用AAV8.CII可以减缓CIA模型中关节炎的进展，减少自身抗体的产生。
图4AAV8.CII预防通过诱导Tregs和IL-10的产生降低CIA的严重程度。(阿-H)小鼠(n=5/组)静脉注射10只。1114天后，用皮下注射法将100μg的CII乳化在100μg的CFA中。21d后腹腔注射LPS 50μg。术后15天及安乐死前均观察外周炎症反应。(A)实验时间表如图所示(B用ELISA法检测LPS注射后15d血清抗CII IgG水平。(C)LPS注射后15天，分离肝非实质细胞，流式细胞仪检测CD4、CD 25和FoxP 3抗体，用Flujo 10.7版比较三重阳性细胞的百分率。Www.flowjo.com). (D)注射AAV8.CII并进行疾病诱导。A)在第2天加服PC 61。(E)每2~3天测定一次关节炎小鼠爪子周围炎症。所提供的数据是四只爪子的总和，最大炎症评分为每天16分。(F用ELISA法检测LPS注射后15d血清抗CII IgG水平。ELISA法检测细胞上清液中G&H、IFN、γ和IL-10的水平。(B、C、F-H)对不同的检测方法进行了分析。
Treg细胞和IL-10参与AAV8对关节炎的抑制作用
接下来，我们将研究Treg和IL-10是否参与了AAV8.CII介导的关节炎表型的降低。首先，在AAV8.CII存在或不存在的情况下，用流式细胞术(FACS)对CIA诱导的小鼠在安乐死时肝脏非实质细胞中Treg的频率进行了监测，与生理盐水对照组相比，AAV8.CII组小鼠肝Tregs从7.3%增加到10.1%(P<0.01)。4c)。这种Treg细胞的扩增与Ad5.CII刺激模型中观察到的情况一致，即在Ad5.CII之前，肝脏Tregs增加了5%，提示CII特异性应答中的免疫调节机制在Ad5.CII模型之间是共同的。
为了证实Treg在缓解AAV8.CII关节炎中的可疑作用，在用PC 61诱导关节炎之前，对AAV8.CII治疗的小鼠进行了Treg耗竭(图6 1)。4d)。监测疾病进展和CII特异性IgG水平。AAV8.CII治疗小鼠Tregs的耗竭使疾病进展减少，导致周围神经炎症比关节炎对照组更严重(图一)。4e)。Tregs的消除也使CII特异性IgG水平恢复到单独CIA诱导小鼠的水平(图1)。4f)。
最后，在CIA模型中评估了Treg耗竭对干扰素γ和IL-10产生的影响。为了做到这一点，中情局诱导的小鼠肝非实质细胞被分离出来，并以上述的CII刺激体外。与关节炎对照组相比，接受AAV8.CII预防的小鼠，促炎型干扰素γ的OD下降约50%，IL-10水平增加2.5倍。与PC 61的Treg耗竭恢复了CII特异性的干扰素γ反应，并消除了AAV8.CII预防通常观察到的IL-10的增加(如图所示)。4G，H)。这种炎症严重程度的增加、CII特异性抗体的增加、促炎细胞因子产生的增加和免疫调节因子表达的降低，强烈表明外周诱导的Tregs是CIA小鼠接受AAV8.CII预防后免疫调节反应的主要介导因子之一。
