鞭毛素作为疫苗佐剂重复使用的脱毒作用

鞭毛素是一种蛋白质类Toll受体激动剂，是一种适用于多种疫苗和免疫治疗的多功能佐剂.鉴于对免疫生物药物的反复治疗应导致抗体应答，避免重复使用，鞭毛素的开发将大大增加临床应用的机会。在这里，我们计算出了免疫原性区域。创伤弧菌鞭毛素B通过简单去除B细胞表位区而去免疫。重组脱免疫FLAB(DFlaB)具有稳定的TLR 5刺激活性.DFlaB的多次免疫并不能诱导小鼠产生特异性的B细胞反应。经鼻联合应用dFlaB和流感疫苗可增强缺乏抗脂抗体产生的全身和粘膜区的强抗原特异性免疫应答。值得注意的是，与野生型FLAB相比，dFlaB对致命病毒攻击有更好的免疫保护作用。脱免疫B细胞表位缺失不影响稳定性和佐剂性，同时抑制重复接种时可能对疫苗抗原导向免疫产生负面影响的不想要的抗体反应。我们用分子动力学分析方法解释了去免疫的机理。

鞭毛素是Toll样受体-5(Toll-like receptor-5，TLR 5)认知识别的一种具有代表性的基于蛋白质的病原体相关分子模式(Pamp)。1, 2]。同源激动剂对TLRs的识别激活了天然免疫反应，进而调节了适应性免疫。TLR配体作为佐剂加入疫苗制剂中，有效地诱导对共同配制的疫苗抗原作出有效的保护性免疫反应。3]。最近，有人提出，天然免疫系统的非特异性激活表现出足以保护宿主免受随后出现的感染(如新冠肺炎)的适应性特征，表达了一种新的术语“受过训练的先天免疫”。4,5,6]。在这方面，模式识别受体(Prr)靶向疫苗佐剂可能为双重玩家服务，增强抗原特异性免疫反应，同时训练宿主天然免疫。我们之前报道过细菌鞭毛，创伤弧菌是一种多用途的佐剂，适用于广泛的疫苗和免疫疗法[7,8,9,10]。当以抗原(AGS)作为混合制剂或作为内建佐剂时，FUB强烈诱导抗原特异性保护性免疫应答。鼻内给鞭毛素不积聚在嗅觉神经和嗅球中，保证中枢神经系统不吸收[11]。我们还报告了脂肪分泌鼠伤寒沙门氏菌通过将肿瘤微环境转化为肿瘤抑制条件，有效抑制小鼠肿瘤模型的生长和转移，延长生存期。7]。此外，鞭毛素流感疫苗已在I/II期临床试验中试验[12, 13]，表明鞭毛素在人体应用中的有效性和安全性。由于鞭毛素不仅是一种强的免疫调节剂，而且本身也是一种免疫原，体内注射鞭毛素佐剂很可能会诱导鞭毛素特异性免疫反应。当重复注射疫苗时，鞭毛素组分可诱导B细胞活化和抗体(Ab)产生，干扰随后注射鞭毛素佐剂疫苗或免疫治疗药物的功能，并引起不必要的反应反应[14]。因此，在不影响佐剂活性的情况下，不诱导鞭毛素特异性抗体的鞭毛素衍生物的开发将加速临床应用。

在本研究中，我们假设FIB中B细胞表位的缺失会抑制重复给药引起的宿主抗体应答，从而使鞭毛素可以很好地应用于临床级疫苗和免疫治疗。在不影响稳定结构和TLR 5刺激活性的情况下，修饰或删除合适的氨基酸序列或结构域是研制脱免疫佐剂的关键。据报道，鼠伤寒沙门氏菌Fic鞭毛素由四个结构域(D0、D1、D2和D3)组成，TLR 5结合位点位于D1结构域。鞭毛素单体是在鞭毛菌的细胞质中合成的，并被转运到细胞质膜上，在细菌表面自发聚合成丝状鞭毛结构。当鞭毛丝状结构形成时，D1区保守的TLR 5识别的短序列被埋藏在鞭毛纤维结构中，这表明单聚鞭毛素(而不是聚合物丝状分子)刺激了TLR 5[15]。螺旋D0和D1结构域相对保守，而D2和D3结构域在不同的鞭毛菌属和种间差异较大。D2和D3结构域向外暴露并诱导特异性抗体应答[16, 17]. 五.创伤一种嗜盐致病菌，共有6个鞭毛素基因和6个鞭毛素基因，防弹是促进鞭毛生物发生和功能的主要亚基，说明在漫长的自然进化历史中，亚麻应该具有保守的物理化学稳定性。18]。在这里，我们使用计算预测B细胞表位，以确定免疫原性决定因素诱导特异性抗体反应在高变异型D2-D3结构域。我们生成了一个d2d3结构域耗尽的flb(Flb)。ΔD2D3)和基于In预测的截断变量(DFlaB)。新纯化的重组dFlaB是一种较少自聚突变蛋白，能诱导稳定的TLR 5刺激活性.然而，ΔD2D3蛋白质出现不稳定，导致在环境挑战下TLR 5刺激活性受损。

在这里，我们报告了一种脱免疫稳定鞭毛蛋白(DFlaB)，具有类似的TLR 5刺激效力和显着的治疗效益的dFlaB作为免疫调节剂。结果表明，通过小鼠免疫模型，dFlaB的多重免疫并不能诱导出特异性的抗体应答。当评估鞭毛素的黏膜佐剂活性时，dFlaB和野生型(WT)亚基的佐剂活性水平相当。为了推测dFlaB的临床疗效，我们采用了致命流感病毒挑战实验。值得注意的是，三次接种dFlaB-佐剂H1N1黏膜疫苗，对致命病毒挑战的保护明显强于Lib+H1N1疫苗。有趣的是，dFlaB佐剂免疫后动物的存活率显著提高，而诱导抗体滴度和抗血清中和活性分别与WT减肥药佐剂疫苗相当或较低，表明抗体不诱导dFlaB具有其他优势。

在FAB可变区删除B细胞表位制备去免疫FIB

鞭毛素是一种很强的免疫调节剂，它能增强对共同给药的ags的特异性免疫反应，并容易将蛋白质抗原作为内建佐剂来设计。10, 19]。由于鞭毛蛋白作为一种免疫原蛋白被广泛用作疫苗抗原或先前感染的诊断靶点，因此鞭毛素特异性抗体的产生是反复给药作为佐剂或免疫治疗的一个主要问题。为了研制一种可下药的鞭毛素，我们尝试了五.创伤我们小组一直在研究作为各种疫苗抗原的佐剂。首先，应用BepiPred-2.0对FIB的B细胞表位进行了预测，其阈值>0.6[20]。预测了可变区2和3(Nd2-D3-CD2)存在优势B细胞表位。1一个,B)。因为大多数B细胞表位都是构象表位[21]，为了验证预测的B细胞表位，我们使用建模器[22]具有两个同源结构模板(PDB ID 3K8V和6JY0)。同调模型被进一步的能量最小化使用修补[23]分子动力学软件包(AMBER99sb)[24]采用GB/SA隐式溶剂模型[25]。模型单体被组装并排列成一个复杂的结构香菇鞭毛素(PDB ID：6JY0)。结构分析表明，D2和D3的表位区是以络合和单体形式存在的溶剂(补充图1)。因此，我们将整个d2和d3从脂肪中去除，以进行去免疫(Flb)。ΔD2D3)。除了ΔD2D3变异体外，我们还在Nd2和D3中确定了一个特定的区域(175个SYQAEEGKDKNWNVAAGDN 193)，该区域具有较高的表位评分和帕克亲水性(图1)。1C) [26]但最低的能量影响，根据一个硅丙氨酸扫描使用FoldX(图)。1D) [27]。为了研制去免疫鞭毛蛋白，我们构建了一种仅缺失19种氨基酸的鞭毛素变异体(DFlaB)。

a去免疫脂肪变体的原理图。野生型创伤弧菌FLAB是鞭毛生物发生所需的保守N端和C端结构域。DFlaB和flbΔD2D3通过删除ND2、D3和CD2中潜在的B细胞表位，在不同的细菌属和种之间进行了脱免疫。bBepiPred2.0预测ND2至CD2结构域的免疫原性最强。c帕克亲水性预测，大部分Nd2结构域也可能具有免疫原性。d在硅丙氨酸扫描中，FoldX还发现了与其他区域相互作用较小的残基(接近于零)。根据这三个指标，我们选择了一个由19个氨基酸组成的线性区域(175个SYQAEEGKDKNWNVAAGDN 193，蓝色阴影)进行去免疫。ND1中的红色框代表TLR 5结合基序，而CD0中的蓝色框分别代表NLRC4结合基序。6H代表6xHis-标签，用于纯化重组dFlaB和flb。ΔD2D3.

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我们构建了表达质粒以产生重组的dFlaB和flb。ΔD2D3蛋白质(表)1)。通过宏根在线测序系统，用二脱氧链终止测序法确定了表达载体的dna序列。Http://dna.macrogen.com/kor/)(补充图2)。重组蛋白经亲和层析纯化后，经SDS-PAGE、天然PAGE和westernblot分析，以亚麻特异性小鼠抗血清为载体，经皮下免疫和完全弗氏佐剂混合培养。尽管dFlaB(40.7kDa)的分子质量小于野生型FLAB(41.47kDa)，但DFlaB在SDS-PAGE上的迁移率低于野生型FLAB(图1)。2A)。通过MALDI-TOF分析证实了重组dFaB突变体的正确表达(补充图3)。当同样数量的蛋白质被负载时，dFlaB和flbΔD2D3SDS-PAGE和本地PAGE的westernblot分析均显示较弱的条带强度(如图所示)。2A)。结果表明，flb D2和D3结构域具有较强的抗原性，19个氨基酸(175~193)在诱导抗脂特异性抗体反应中起主导作用。为了检测这些蛋白的TLR 5刺激活性，我们用新鲜纯化的蛋白，用磷酸缓冲液溶液改变后立即用磷酸缓冲液检测TLR 5依赖的NF-κB信号。如图所示。2B，新鲜的dFlaB和flbΔD2D3以剂量依赖性的方式诱导TLR 5刺激活性。半最大有效浓度(EC 50)ΔD2D3每种蛋白浓度在不同蛋白质浓度范围内(0.03719~76.16nm)，用OD 620值一式三份计算。计算的EC 50值分别为：dflab为4.183 nM，dflab为9.0131 nM，dflab为13.1615 nM。ΔD2D3。这个结果表明dFlaB和flbΔD2D3与脂肪相比，活动略有下降。值得注意的是，在蛋白质浓度高于9.52nM时，flb和dFlaB之间TLR 5依赖的NF-kB活性差异不显著(P>0.0 5)。P=0.2064)。本机页面数据显示，新纯化的dflab和flb。ΔD2D3PBS中蛋白质的聚合倾向低于WT FLAB。当重组蛋白在不同的环境条件下长期保存时，ΔD2D3蛋白质容易聚集，导致TLR 5刺激活性下降(补充图4)。这些结果表明，dFlaB，其中最免疫原性的19个氨基酸B细胞表位被删除，保持了理化稳定性和TLR 5-刺激活性。

aDFlaB和flb的表征ΔD2D3采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、自然聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫小鼠抗血清蛋白印迹(Westernblot)分析，制备了完全的弗氏佐剂。bFLAB、dFlaB和FAB对TLR 5依赖的NF-κB刺激活性的测定ΔD2D3。用HEK-Blue分析NF-κB的相对活性。TMHTLR 5细胞与HEK蓝TM检测分析系统每种蛋白浓度在广泛的蛋白质浓度范围内(0.03719到76.16nm)，在AATBioquest网站上使用OD 620 nm一式三份的数值计算EC 50。Https://www.aatbio.com/tools/ec50-calculator)。采用相同的蛋白质摩尔比，以PBS为阴性对照。

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重复免疫dFlaB不会诱导鞭毛素特异性抗体。

接下来，为了测试基因工程的dflab蛋白在体内是否能诱导出特异性的免疫应答，我们比较了重复免疫诱导的抗体应答与flb、dflab或flb的关系。ΔD2D3蛋白质。BALB/c小鼠每隔2周7次接种鞭毛蛋白。3A)并在适当的时间点测定脂肪特异性B细胞的反应。采用鼻内途径的原因是，我们在先前的研究中观察到，鞭毛素是一种很好的黏膜疫苗佐剂，可在粘膜和全身隔间诱导有效的免疫应答。10, 11, 28]。经3次免疫后，采用ELISPOT法检测脂肪特异性IgG分泌浆细胞和记忆B细胞。29]。如图所示。3B、肥肉、肥肉ΔD2D3或dFlaB在骨髓中产生16.50±1.19，2.50±0.87，0.75±0.25脂肪特异性IgG，在脾脏中分别产生14.75±1.80，0.50±0.29或0.25±0.25记忆B细胞。鉴于黏膜分泌型IgA(SIgA)对粘膜感染部位有较强的保护作用，我们还测定了分泌血浆和记忆B细胞的特异性IgA。三次免疫ΔD2D3或dFlaB在骨髓中产生17.75±3.63，1.41±0.82，0.50±0.29脂肪特异性IgA，脾中分别产生36.25±9.25，2.00±1.25，0.25±0.29记忆B细胞。为了确认dflab的多重免疫是否仍未诱导出特定的抗体，我们继续用flb、dflab或flb进行了七次免疫。ΔD2D3蛋白质。在6次免疫后，我们比较了脂肪、dflab或flb的抗原识别模式。ΔD2D3-Westernblotting诱导抗血清。第三次免疫后2周，检测黏膜分泌物中抗体的产生情况，收集BALF，用westernblot法检测其对脂肪特异性抗体的反应。的高变区的缺失鼠伤寒沙门氏菌抗体介导的中和16, 17)，我们使用了ΔD2D3作为对照蛋白，研究了19种氨基酸对抗体产生的影响以及Ag-Ab相互作用谱。如图所示。3C，抗-flb血清和BALF识别相应的flb、dflab和flb。ΔD2D3蛋白质。虽然我们在聚丙烯酰胺凝胶上负载了相同数量的蛋白质，但westernblot显示较dflaB和flb更强的wt flb蛋白带强度。ΔD2D3蛋白质，表明可变的D2和D3结构域主要诱导特异性抗体。抗dFlaB和抗脂肪ΔD2D3血清几乎检测不到flb-，dFlaB-或flbΔD2D3蛋白质。抗脂肪ΔD2D3血清与正常幼稚血清相似。在多次免疫后，我们测定了flb-，dflab-或flb。ΔD2D3-抗脂肪、抗dFlaB和抗-flb的特异性血清IgG效价。ΔD2D3-血清。七次WtFab免疫诱导了显著水平的脂肪、dFlaB和flb。ΔD2D3-特异性血清Log2IgG滴度(12.00±0.89，10.4±0.93，10.8±0.80)。而dFlaB和flbΔD2D3免疫后血清IgG滴度分别为6.0±0.0和5.8±0.2，提示dFlaB和flb。ΔD2D3即使在7次重复的鼻内免疫后，诱导血清特异性IgG的作用也明显减弱(图一)。三维空间)。这些结果共同表明，这19个氨基酸亲水结构域服务于一个基本的B细胞表位，以及抗-flb抗体主要结合的地方。此外，仅缺失19个氨基酸就足以抑制脂肪特异性抗体的产生，而不影响其稳定性。

体内生物分布-给药FLAB或dFlaB

为了可视化体内注射的flb或dflab，我们生成了荧光结合蛋白[8]测定引流淋巴结中的荧光信号，测定其生物分布。纯化的亚麻或dFlaB与FNR675-NHS酯(韩国BioActs)在4°C下混合，在黑暗中搅拌过夜。然后用离心过滤器(10 kDa截止值)将标记的flb-或dFlaB-FNR 675从未共轭染料中分离出来(Am图标Ultra-4，UFC 801024)，然后在PBS中洗涤(5x)。其次，用紫外-可见分光光度计(UV-2700，岛津，日本)从FNR 675-NHS酯的校准曲线中测定共轭蛋白的含量。BALB/c小鼠经鼻内或脚垫注射100μg的flb-FNR 675或dFlaB-FNR 675。经鼻给药后6h，分离颈淋巴结(CLN)检测荧光光子。与pbs组相比，两组小鼠均检测到明显的荧光信号，两组间差异无显着性(P>0.05)。P < 0.05 for PBS vs FlaB; P < 0.001 for PBS vs dFlaB; P>0.05对dFlaB)(如图所示)。4A)。同时测定足垫注射后腹股沟淋巴结(ILN)和窝淋巴结(PLN)中FLAB和dFlaB的生物分布。如图所示。4B，FLAB和dFlaB均定位于荧光强度相当的ILN和PLN中。P>0.05对dFaB)。这些结果清楚地表明，在体内给药的dFlaB类似地分布在DLN中，与WT FAB相比。

DflaB佐剂与WT flb在诱导流感疫苗特异性抗体应答中的作用相同

其次，为了证实dFlaB是否保持与WT亚基相同的粘膜佐剂活性，我们使用一种商用流感疫苗进行了体内免疫试验。我们用上述相同的方法比较了抗银抗体和抗脂抗体的反应。在此之前，我们曾证明过，降脂佐剂灭活流感疫苗在粘膜和系统隔间都能诱导出极好的保护性免疫。11]。据报道，甲型H3N2流感的发病率比H1N1流感或乙型流感更严重[30, 31]。2019-2020年季节的所有流感疫苗都含有两种甲型流感病毒(H1N1和H3N2)和一到两种乙型流感病毒。观察研究一直表明，H3N2的流感疫苗效力比H1 N1pdm09和B型低，而抗原匹配并不能完全解释这一点。32]。在本研究中，我们比较了联合应用灭活的H3N2 A/瑞士/9715293/2013NIB-88分裂疫苗(sH3N2；IL-Yang P氨)对dFlaB和flb的佐剂活性。(韩国永宁)为了评价dFlaB-佐剂H3N2裂解疫苗(SH3N2)黏膜免疫诱导的抗银抗体应答，我们分别测定了血液和BALF中H3N2特异性IgG和IgA滴度。BALB/c小鼠3次腹腔注射pBS，4μg dFlaB(DFlaB)，4μg FLAB(FLAB)，1.5μg sH3N2(SH3N2)，1.5μg sH3N2+4μg dFlaB(sH3N2+dFlaB)，1.5μg sH3N2+4μg dFlaB(sH3N2+FlaB)。最后一次免疫后2周，用ELISA法和Westernblot法检测全身(血清)和粘膜(BALF)室中sH3N2或flb特异性抗体的反应。

联合应用flb或dFaB与sH3n2Ag联合应用可显著提高抗sH3N2血清IgG水平(P < 0.01 for sH3N2 vs sH3N2 + FlaB; P < 0.001 for sH3N2 vs sH3N2 + dFlaB). The sH3N2-specific IgA was detected in the FlaB- or dFlaB-adjuvanted vaccination only, suggesting secretory IgA production is dependent on the mucosal adjuvant. The dFlaB exerted equivalent adjuvant activities with WT FlaB in both systemic IgG and mucosal IgA levels (P>0.05(sH3ns+flb vs sH3ns+dFlaB)(图1)。5A和补充图5)。为了确定ELISA结果，我们用抗血清和抗BALF分别对SDS-PAGE和天然PAGE进行了westernblot分析。如图所示。5B抗sH3N2血清检测到SDS变性和天然sH3N2 AGS的结合强度较弱。在1：1,000血清稀释下，抗dFlaB+sH3N2或抗-flb+sH3N2血清对变性和天然H3N2抗原的识别能力强于抗sH3N2血清。与抗-flb+sH3N2血清相比，抗dFlaB+sH3N2血清不能检测变性脂肪。抗dFlaB+sH3N2血清与非变性脂肪的反应最小。为了证实鼻内免疫是否能有效诱导相应的黏膜免疫应答，我们还用BALF免疫印迹法检测了sH3N2或亚类特异性抗体的应答。抗sH3N2的BALF几乎检测不到变性和天然的sH3N2。抗dFlaB+sH3N2或抗-flb+sH3N2 BALF同时检测到变性和天然H3N2抗原，表明dFlaB和flb均具有有效的粘膜佐剂活性，产生保护性分泌抗体反应。DFlaB-佐剂疫苗与WT+sH3N2疫苗相比，在BALF中未诱导出有效的脂肪识别IGs。在这种流感疫苗接种模型中，dFlaB维持粘膜佐剂活性，但不引起特异性抗体反应，表明dFlaB在未来的黏膜疫苗中对各种病毒感染的临床适用性。

a鼻内接种后AG特异性抗体反应。团体(n分别以pBS、4μg flb、4μg dFlaB(DFlaB)、1.5μg H3N2 A/9715293/2013NIB-88分裂疫苗(SH3N2)、1.5μg sH3N2+4μg Fab(sH3N2+亚麻)，或1.5μg sH3N2+4μg dFlaB(sH3N2+dFlaB)每隔2周接种3次。最后一次免疫后2周，取血清或BALF，用ELISA法检测sH3N2特异性血清IgG或BALFIgA滴度。bSH3N2或FAB特异性抗体生产的测定。最后一次免疫后2周采集血清或BALF。SDS-变性或非变性sH3N2或FLAB用PAGE法解析。用Westernblotting法检测血清和BALF中sH3N2或亚类特异性抗体。采用Man-Whitney试验对两组进行比较。***P < 0.001; ns, non-significant; ND, not detected (under the detection limit); M, marker; H, sH3N2; F, FlaB.

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DFlaB-佐剂疫苗增强了对致命流感挑战的保护

为了比较dFlaB和亚脂佐剂疫苗对致死性病毒感染的保护作用，我们用小鼠加毒强毒H1N1/Brisbane/59/07流感病毒进行了一项挑战研究[11]。我们测试了两个剂量的银，以复制充分和次优的免疫条件。Balb/c小鼠经鼻接种PBS、灭活的H1N1 A/Brisbane/59/07分离疫苗(韩国虎顺市绿十字)、0.2μg为足够剂量，0.0 8μg为次优剂量)+4μg dFlaB(sH1N1+dFlaB)，2周加4μg亚麻。最后一次免疫后两周，采集血清样本，接种A/Brisbane/59/07病毒致死量(2.4×LD)。50)。观察14天的生存率和体重变化。如图所示。6A在这两个挑战实验中，所有的载体免疫小鼠(PBS)在第7天时体重下降了30%，存活率为0%。0.2μg-sH1N1+dFlaB和0.2μg-sH1N1+亚型疫苗接种小鼠的最终存活率分别为90%和33.3%。0.2μg-sH1N1+dFlaB免疫小鼠的存活率明显高于用sh1n1+flb免疫的小鼠(P=0.0094)。在次优抗原剂量(0.08μg sH1N1)免疫条件下，dFlaB佐剂组14d存活率为60%，而0.08μg sH1N1+flb组存活率仅为20%。免疫组(0.08μg sH1N1+flb)中位生存期为8d。经dFlaB佐剂sh1n1疫苗接种的两组患者体重变化所决定的发病率均有显著下降(P < 0.05 for 0.2 μg sH1N1 + dFlaB vs 0.2 μg sH1N1 + FlaB; P < 0.001 for 0.08 μg sH1N1 + dFlaB vs 0.08 μg sH1N1 + FlaB) (Fig. 6A)。为了检测抗血清的病毒中和能力，我们进行了病毒菌斑减少中和试验(PRNT).如图所示。6B与单用0.2μg sh1n1相比，减肥药或dFlaB佐剂疫苗的效价显著提高(P < 0.05 for 0.2 μg sH1N1 vs 0.2 μg sH1N1 + FlaB; P < 0.001 for 0.2 μg sH1N1 vs 0.2 μg sH1N1 + dFlaB). Specifically, the sH1N1 + dFlaB groups showed significantly lower PRNT levels compared with sH1N1 + FlaB, suggesting the dFlaB-mediated adjuvanticity would employ other components of immunity than virus-specific neutralizing antibody responses. We also measured Ag-specific serum IgG titers. As shown in Supplementary Fig. 6, similar level of H1N1-specific serum IgG was detected in FlaB- or dFlaB- adjuvanted group. When we compared the body weight change, the sH1N1 + dFlaB groups showed severe body weight loss in earlier time points (until day 3 for 0.2 μg sH1N1 and day 5 for 0.08 μg sH1N1 Ag doses). Three- or five-days after the virus challenge, groups of mice immunized with dFlaB-adjuvanted vaccine showed faster body weight recovery (Fig. 6A)。这一结果清楚地表明，去免疫可以增强鞭毛素对致死性感染的免疫调节作用，而dFlaB作为疫苗佐剂，除了具有抗体非诱导性外，还具有优势。在今后的研究中，检查dFlaB诱导训练后的先天免疫的能力将是很有趣的。4,5,6]或细胞介导的对病毒抗原的免疫。

小鼠组(n分别用PBS、FIB、dFlaB、H1N1/Brisbane/59/07分离疫苗(SH1N1)、sH1N1+flb(sH1N1+flb)或sH1N1+dFlaB(sH1N1+dFlaB)3次，每隔2周免疫3次。免疫后两周，小鼠经鼻注射2.4×LD。50活A/布里斯班/59/07流感病毒挑战后，存活率和体重变化(a)监测2周。以幼稚小鼠为对照，测定体重变化。b活流感A/Brisbane/59/07病毒菌斑减少中和试验(PRNT)最后一次免疫后2周，从眶后丛采集血清。PRNT50以阳性对照病毒井为基础，测定其效价为50%的斑块中和率。采用Man-Whitney试验对两组进行比较。

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鞭毛素是鞭毛生物发生的主要结构成分[18，是一种独特的以蛋白质为基础的tlr激动剂，可作为各种黏膜疫苗和免疫治疗药物的有效佐剂。7,8,9,10,11, 19, 28]。对蛋白质疗法本身的免疫反应会损害疗效和安全性。虽然有报道称，在一项临床试验中，抗鞭毛素抗体与流感鞭毛素融合疫苗接种后的不良事件之间没有明显的关系。33]，因为鞭毛素是一种强免疫原。34]鞭毛素特异性抗体的生产一直引起人们对鞭毛素治疗学发展的关注。鞭毛素佐剂疫苗的重复免疫可诱导鞭毛素特异性抗体的高效价，从而干扰随后接种的鞭毛素佐剂疫苗，导致不必要的中和或反应应答。因此，去除保留佐剂活性的鞭毛素是制备药物优化鞭毛素的一种很有前途的选择。在漫长的进化过程中，蛋白质的修饰是高度优化的，常常导致物理化学稳定性的急剧恶化。在本研究中，我们报道了一种相当保守的方法，通过删除构成优势B细胞表位的少量氨基酸来去除高抗原蛋白鞭毛素。

在本研究中，我们产生了鞭毛素的去免疫版本(DFlaB)。为了获得去免疫的bb，我们用以下方法对B细胞表位进行了定位。硅中预测和结构建模工具。据报道，高变区的缺失鼠伤寒沙门氏菌抗体介导的中和16]。我们的计算分析还发现，最可能的B细胞表位位于超可变的D2D3区(170-284个氨基酸)。根据三维结构预测，D2D3缺失(Flb)ΔD2D3)不影响TLR 5结合基序(89-96个氨基酸).然而，我们注意到ΔD2D3由于药物在体外(补充图4)和体内稳定性差，其作用应该是有限的。据报道，D3结构域[医]斑疹伤寒菌Fic在D1和D2结构域的稳定中起着重要作用[35]。如图所示1由于dFlaB缺失的19个氨基酸包含17个Nd2氨基酸和2个D3结构域氨基酸，因此dFlaB很可能保留负责稳定鞭毛蛋白结构的必需氨基酸序列，而不破坏折叠动力学。通过对dFlaB的自然电泳和westernblot分析，我们发现在pbs条件下，dFlaB的聚合倾向较少(图1)。2B)。据报道，埋在聚合鞭毛丝中的一个短保守序列为TLR 5识别位点服务，这表明单聚鞭毛素(而不是聚合丝状分子)刺激了TLR 5[36]。如图所示。2ADFlaB在SDS-PAGE上的迁移率比WT FLAB慢，提示构象变化不影响TLR 5的结合。在我们的上一次报告中，我们观察到相同分子质量的flb-pspa和pspa-flb融合多肽在sds-page凝胶上的迁移率明显不同。19]。随后，如下文将讨论的那样，推测dFlaB中剩余D2D3区域的更强的分子动力学将归因于较慢的迁移率。由于细菌的单链鞭毛蛋白分子会自动组装成丝状的上层建筑，在体外和体内条件下，dFlaB可能在药物制造和可再生活性方面具有优势，因为它具有较低的聚合倾向。

虽然dFlaB降低抗原性的详细作用方式尚待研究，但已知B细胞表位的流动性较低。37, 38DFlaB的低抗原性可能是由于19种氨基酸的去除改变了结构的灵活性所致。为了解决这一假设，我们进行了短周期分子动力学(MD)模拟.DFlaB是同源的-使用与FIB相同的模板结构建模(带有AMBER99sb的Tinker包和GB/SA隐式溶剂模型)。每一目标单体运行MD一式三份。补充图7显示了Cα原子的均方根涨落。RMSF值总体相似，但在截短区后的残基上观察到明显的差异。在D3结束时，灵活性再次稳定。从这些观察中，我们推测19种氨基酸的去除会引起D2-D3的高度柔韧性，这可能阻碍了抗体的识别。39](补充录影带1及补充资料1).

鞭毛素是一种具有代表性的蛋白型TLR激动剂，鞭毛素的药代动力学特性可能决定该免疫调节剂的体内有效性。在我们以前的研究中，我们发现在4-6小时内，经鼻或阴道内途径给予FLAB的粘液转移到引流淋巴结(DLNs)，形成完整的蛋白质聚集体，或与抗原提呈细胞相关联。在本研究中，我们注意到经鼻给药dFlaB在诱导Ag特异性抗体反应方面表现出与WT FAB相当的佐剂活性，表明B细胞表位的缺失不会影响体内稳定性。据报道，重组蛋白疫苗的生物分布和抗原传递是研制最佳重组疫苗的关键。40]。我们还观察到，在体内注射dFlaB类似地分布在DLN中，与WT FAB相比(图1)。4).

在本研究中，我们通过删除FAB可变区的B细胞表位，开发了去免疫FLAB(DFlaB)。DFlaB具有稳定的TLR 5刺激活性。我们证实，重复免疫dFlaB并不能诱导鞭毛素特异性抗体，而dFlaB佐剂在诱导流感疫苗特异性抗体应答方面与WT FIB具有同等的效果。DFlaB佐剂疫苗增强了对致命流感挑战的保护。脱免疫B细胞表位缺失不影响稳定性和佐剂性，同时抑制重复接种时可能对疫苗抗原导向免疫产生负面影响的不想要的抗体反应。