异常翻转/STAT 3轴致致死性细胞因子释放综合征

炎症反应可迅速检测病原体的侵袭并引起调节反应。然而，调节失调的抗病原体免疫反应可引发危及生命的炎症病理，统称为细胞因子释放综合征(Crs)，在sars-cov-2大流行期间发现的关键临床表型就是例证。CRS的病理生理基础尚不清楚。我们发现反转蛋白，一种控制caspase-8死亡通路的蛋白，在新冠肺炎肺的髓系细胞中高表达。翻转控制CRS通过支持STAT 3依赖的炎症程序。事实上，病毒翻转同源基因在髓系细胞中的构成性表达引发了小鼠STAT 3连锁、进行性和致死性炎症综合征，其特征是细胞因子产量增加、淋巴细胞减少、肺损伤和多器官功能障碍，这些症状与人的CRS相似。当STAT 3靶向治疗这些小鼠的炎症、免疫紊乱和器官衰竭时，针对该途径的靶向干预可以抑制致死性CRS的炎症状态。

宿主对病原体的反应是有序的，时间依赖的，组织分裂的，由生长因子和炎症细胞因子等可溶性因子的释放来协调，这些因子参与、激活和调节先天免疫细胞。1]。由于免疫反应的大小与病原体的负荷基本一致，且受侵染区的限制，半衰期短的细胞因子在炎症部位的作用有限，有利于局部免疫细胞的活化。然而，持续感染或不受控制的微生物负担会导致更高的细胞因子产量，从而促进紧急造血，从骨髓中动员更多的白细胞，从而抵消周围髓系细胞的耗竭。2]。在这种情况下，超过正常阈值的细胞因子的增加可能导致一场称为细胞因子释放综合征(CRS)的灾难性细胞因子风暴，最终导致多器官衰竭[3]。这种全身性病理不仅与播散性细菌或病毒感染有关[4, 5也可通过肿瘤免疫治疗，即嵌合抗原受体(CAR)T细胞输注或抗体治疗而诱导。6,7,8,9,10]、干细胞移植设置[11，以及与自身免疫性或遗传性疾病相关的[12, 13]。CRS患者经常出现呼吸症状，包括呼吸暂停，进展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)[14、严重肾损伤、肝胆损害、心肌病、神经功能障碍[3].

越来越多的证据显示，CRS与严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的2019年(新冠肺炎)冠状病毒大流行有密切关系[15,16,17]。事实上，严重新冠肺炎患者的病理生理特征往往与肺部受累有关，这可能需要重症监护病房(ICU)的侵入性机械通气[18,19,20,21]。病毒进入后，sars-cov-2引起内皮细胞损伤、补体活化、凝血酶产生和纤溶抑制，导致肺血管内凝血、血管微血栓形成，并最终导致严重血管病变、急性心肌梗死和中风[22, 23]。此外，有多项研究报告了sars-cov-2在心肌、肾脏、神经和胃肠组织中的有机性，证实新冠肺炎是一种具有多种表现的复杂病理。24]。这些多器官损害可能与直接病毒毒性或病毒依赖性免疫系统失调有关。25,26,27,28,29,30]。因此，天然免疫系统的激活可被认为是sars-cov-2相关crs的主要特征。31]。的确，髓系细胞积极参与建立急性淋巴细胞减少症、微血管功能障碍和器官衰竭，这些都是新冠肺炎相关crs的主要特征[27, 32,33,34]。然而，到目前为止，对SARS-CoV-2依赖的髓系细胞重新编程的分子理解仍不清楚.

我们先前发现抗凋亡细胞和病毒FLICE(fdd样IL-1β转换酶)样抑制蛋白(以下分别为c-翻转和v-翻转)是一个能够重新编程单核细胞的因子。35]。翻转异构体通常被描述为控制细胞存活和增殖的caspase-8抑制剂和/或NF-κB激活物[36,37,38,39,40]。然而，翻转根据它们的蛋白质结构(例如，死亡效应结构域的存在)来调节不同的生物过程[41]或细胞定位(例如细胞核和细胞质之间的贩运)[42, 43]。单核细胞翻转蛋白的上调促进了非常规表型的获得，其特点是免疫抑制(如程序性死亡配体1(pd-l1)、白介素(IL)-10)和促炎(如IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α)的同时表达，这部分依赖于复杂的倒置/核因子kappa bp 50(NF-κB p 50)蛋白的核移位。35]。在转基因的ROSA26.vFLIP；LyzM-CRE小鼠中，Kaposi肉瘤病毒vFLIP在髓系细胞中表达，这是一种严重的致死性炎症病理，类似于卡波西肉瘤相关疱疹病毒炎性细胞因子综合征[35].

我们怀疑翻转和pSTAT 3表达的髓样细胞与新冠肺炎相关的CRS有关，因为它们的积累是由人(H)ACE 2基因表达的转基因小鼠和感染SARS-CoV-2的患者共同分享的。此外，从新冠肺炎患者中分离出的单核细胞表现出与其免疫抑制特性相关的c-翻转和pSTAT 3的高表达。我们发现vFLIP转基因小鼠反映了严重新冠肺炎患者的免疫功能障碍和支气管肺泡免疫景观。我们使用这种独特的模型来评估系统和髓系靶向STAT 3干扰方法，以解决不受控制的炎症和急性疾病的表现。

小鼠

所有转基因小鼠及其对照组均与性别和年龄相匹配(通常为3-10周)，本研究使用了雄性和雌性转基因小鼠。小鼠随机分为实验组。C57BL/6(H-2)b)小鼠最初是从查尔斯河实验室公司(CD45.1)购买的。+同型小鼠(H-2)b, B6.SJL-Ptrca百事b/Boyj)和LySM-CRE小鼠(H-2)b, B6.129P2-Lyz2Tm1(Cre)ifo/J)是从杰克逊实验室购买的；Rosa26.vFLIP(H-2)b)小鼠是Ethel Cesarman博士(Weill Cornell Medicine，纽约，美国)的礼物。在维罗纳大学的动物设施中，所有小鼠都在特定的无病原体条件下进行饲养。提供食物和水。动物实验是根据国家(经2020年7月24日第993/2020-PR号部长令批准的第C46F4.26号议定书)和2018年2月21日第207/2018-PR号部长令[PI：Vincenzo Bronte]批准的第C46F4.8号议定书和欧洲法律和条例进行的。所有动物实验均由维罗纳大学伦理委员会批准，并按照欧洲实验动物科学协会联合会(FELASA)的指导方针进行。所有动物实验都符合阿姆斯特丹动物保护和福利议定书：每天监测小鼠，并在表现出过度不适时对其进行安乐死。

伦理学与人体样本的获取

本研究中的48名新冠肺炎患者和4名健康献血者在2020年3月12日至4月20日期间被送往维罗纳大学医院或佩斯卡拉医院。在抽样时，疾病的阶段分为轻度(不需要非侵入性/机械通气和/或入院于ICU)或严重(需要进入ICU和/或非侵入性/机械通气)。

对4例非呼吸疾病(NRD)患者、4例细菌性肺炎(BP)患者和23例新冠肺炎患者进行肺尸检免疫组化(IHC)分析。临床特征见表。1和表2A，B.

对于分子数据(即单细胞转录分析)、表型分析(表现为免疫抑制标记的表达)和功能数据(髓系免疫抑制试验)，本研究包括14名重症新冠肺炎患者、11名轻度SARS-CoV-2患者和4名HDs患者。三组受试者的临床特征见补充资料表。2C.

所有患者(和/或最初的家属)在取样前和使用其临床和生物学数据之前都提供了书面知情同意。这项研究得到了当地伦理委员会的批准(协议17963；PI：Vincenzo Bronte；ClinicalTrials.gov标识符NCT 04438629)。所有临床调查均根据“赫尔辛基原则宣言”进行，并获得所有研究参与者的知情同意。

细胞因子和血清学的检测

ProcartaPlex小鼠细胞因子和趋化因子板1A(36复合：IFN-γ；IL-12p70；IL-13；IL-1β；IL-2；IL-4；IL-5；IL-6；TNF-α；GM-CSF；IL-18；IL-10；IL-17A；IL-22；IL-23；IL-27；IL-9；Gro-α；IP-10；MCP-1；MCP-3；MIP-1α；MIP-1β；MIP-2；RANTES；eotaxin；IFNα；IL-15/IL-15 R；IL-28；IL-31；IL-1α；IL-3；G-CSF；LIF；ENA-78/CXCL 5；(eBioscience，Thermo Fisher Science，Waltham，MA，USA)和细胞因子25-Plex人ProcartaPlex™1B(25丛：GM-CSF，IFN-γ，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-12p 70，IL-13，IL-18，TNFα，IL-9，IL-10，IL-17A(CTLA-8)，IL-21，IL-22，IL-23，IL-27，IL-α，IL-1α，IL-1 RA，IL-7，IL-15，IL-31，肿瘤坏死因子β(eBioscience，ThermoFisher Science，Waltham，MA，USA)是按照制造商的指示进行的。

流式细胞术

总计0.5-2×106细胞在PBS中洗涤，用FcReceptor阻滞剂CD 16/32(Biolegend)或FcReceptor阻断剂(Miltenyi Biotec)在染色缓冲液中(2%FBS)在4℃下浸泡10 min，使FCR饱和。然后用以下mAb进行细胞标记：抗小鼠CD3(17A2)、CD 45.1(A20)、CD11b(M1/70)、B 220(RA3-6b2)、CD45.2(104)、Ly6G(1A8)、Ly6C(HK1.4)、FOXP 3(NRRF-30)、CD3ξ(145-2C11)、CD 25(PC61.5)、CD62L(MEL-14)、CD8a(53-6.7)、CD4(RM4-5)、滞后3(C9B7W)、蒂姆-3(B8.2C12)、PD1(29F.1A12)、P-STAT 3(Ser727)(D4X3C)、NK1.1(PK 136)或抗小鼠/人CD 44(IM7)、P-STAT 3(PTyr 705)(LUVNKLA)或人CD 16(3G8)、CD3(UCHT 1)、HLA-DR(L 243)、CD 14(MφP9)、PD-L1(MIH1)和Aqua活/死染料。所有抗体都是从以下公司购买的：BD生物科学(美国圣何塞，CA，美国)，eBioscience(Thermo Fisher Science，Waltham，MA，USA)，Biolegend(圣迭戈，CA，USA)和细胞信号技术(Danvers，MA，USA)。细胞外抗原在4°C染色缓冲液中染色30 min。细胞因子和转录因子分析采用Foxp 3/转录因子染色缓冲液集(EBioscience)固定和渗透。细胞内抗原在适当的PERM/Wash缓冲液中染色1h。样本用FACSCanto II(BD，富兰克林湖，NJ，美国)采集，用Flowjo软件(Treestar Inc.)进行分析。

用克隆人LUVNKLA检测细胞内p-STAT 3(Tyr 705)水平，表面标记染色后，用2%多聚甲醛(Sigma-Aldrich)固定，90%冷甲醇渗透。所有步骤都是在冰中完成的。

用流式细胞仪间接扩增细胞内信号，检测FLIP蛋白的表达。在细节上，经过表面标记染色后，1×106用Foxp 3/转录因子染色缓冲液集(EBioscience)固定PBMC。在细胞内染色前，用FcReceptor阻断剂(Miltenyi Biotec)在合适的1x PERM/Wash缓冲液中用RT孵育10 min。兔抗翻转抗体(D5J1E；1：100；细胞信号传导技术)在4°C下加入2 h，用二次抗兔IgG(H+L)(#8885，细胞信号传递技术)在4°C下扩增30 min，使分析样品之间的表达水平正常化：归一化的MFI=(MFI样本−MFFMO)/MFI FMO。

VFLIP嵌合体小鼠的产生

为了建立vflip嵌合体小鼠模型，8周龄的c57bl/6雌性小鼠接受了9Gy全身照射(Tbi)。137CS源辐照器预处理后6小时，受照小鼠静脉注射5×10。6CD 45.1 WT和ROSAvFLIP TG(CD 45.2)供体小鼠不同比例(vFLIP/WT比值0/1；1/1；3/1；1/0)获得骨髓细胞。取ROSA26.vFLIPTG敲入小鼠骨髓细胞，在髓系室高表达Kaposi肉瘤病毒(VFLOP)的翻转蛋白。这些小鼠通过与表达Cre重组酶的小鼠杂交获得ROSA 26，vFLIP基因敲入小鼠，并在内源性调控下表达Cre重组酶。莱兹2启动子。在治疗研究中，用50%WT-50%vFLIP比产生vFLIP-嵌合体小鼠。骨髓移植后4周，对受体小鼠外周血进行供体来源细胞分析。

人细胞的分离与功能测定

从EDTA处理的试管(BD生物科学，NJ，美国)中分离细胞，用Ficoll-Hypaca(GE Healthcare)梯度离心法分离细胞。计数外周血单个核细胞(PBMC)和单核细胞比例(CD 14)。+)被CD 14-微珠(Miltenyi Biotec)进一步分离，并遵循制造商的指示。CD 14的纯度+用流式细胞仪测定各组分含量。对纯度>95%的样品进行了抑制能力鉴定。CD 14+收集细胞，用1μM细胞(热费舍尔科学)标记PBMC，用包被抗CD3(Okt-3)和可溶性抗CD 28(28.2)在37°C和8%CO中刺激4天。2孵化器。细胞采用3：1(靶标：效应剂)。培养结束时，用淋巴细胞的抗CD3(UCHT 1)和细胞追踪信号染色。样品用FACS-Canto II(BD，富兰克林湖，NJ，美国)使用TruCountTM管(BD，Franklin湖泊，NJ，美国)测定CD3的绝对细胞数。+样本中的细胞。数据用Flowjo软件(TreeStar，Inc.，Ashland，OR，USA)进行分析。

患者单核细胞释放的细胞因子用人ProcartaPlex™Panel 1复合定量。对纯度>95%的样品进行细胞因子的测定。简短，5×105CD 14+细胞在24孔板中培养12h，培养结束后用流式细胞仪检测细胞存活率。

免疫荧光(IF)和免疫组织化学(IHC)

为了确定pSTAT 3 Tyr 705和c-翻转在人类样本中的存在，CD 14+细胞贴壁(ibidiGmbH；Cat#80826)，4%甲醛固定10 min，RT用0.1%TritonX-100封闭10 min。用0.1%TritonX-100在PBS 1x和20%正常山羊血清(载体实验室)中进行细胞内信号检测，RT时用0.1%TritonX-100和20%正常山羊血清(载体实验室)进行渗透。原代mAb兔抗翻转抗体(D5J1E；1：100；细胞信号传递技术)和小鼠抗pSTAT 3(Try 705)(LUVNKLA；1：50；Invitrogen)在PBS 1x中稀释，加入0.05%吐温-20(Biorad，猫#1706531)液，4°C时，用山羊抗兔IgG亚叶酸488(1：1000；CAT#A 11034；Invitrogen)和驴抗小鼠IgG 647(1：1000)进行信号扩增；用0.1%的TritonX-100和20%的正常山羊血清在RT下培养1h，然后用Hoechst 33342(H 1399；1：500；Invitrogen)在PBS 1x中染色10 min。

组织固定在10%中性福尔马林中，石蜡包埋，包埋后切取5 m厚切片，用苏木精和伊红染色(意大利Bio-Optica)进行组织学检查。对标本进行免疫组织化学和免疫荧光分析，将小鼠抗人CD 68抗体(M 0814，DAKO)，小鼠抗人/鼠翻转抗体(MAB 8430，R&D)，兔抗CD3抗体(ab16669，abcm)，兔抗小鼠抗鼠4/80抗体(#70076，细胞信号传导)，兔抗CD62p抗体(ab255822，abcm)孵育。兔抗鼠中性粒细胞弹性蛋白酶抗体(ab68672，ABCAM)，兔抗小鼠CD4抗体(#25229，细胞信号传导)，大鼠抗鼠Foxp 3抗体(14-5773-82，eBioscience)，其次为次级抗体。免疫染色采用链霉亲和素过氧化物酶(STP)法和DAKO显色系统(DAKO)。显色剂孵育后，用苏木精(Bio-Optica)染色，用Leica DMRD光学显微镜(Leica)获得图像。免疫荧光用TSA+花菁3、TSA+花菁5、TSA+荧光素系统(NEL 744001KT、NEL 745001KT或NEL 741001KT)、山羊抗兔Alexa Fluor 488(A 11008，热Fisher)、山羊抗大鼠荧光素546(A 11081，热Fisher)、山羊抗小鼠Alexa Fluor Plus 647(A 32728，热Fisher)和细胞核染色。用Zeiss LSM 800共焦显微镜获取图像。

胶原沉积的组织学观察，采用马尾松蓝染色试剂盒(04~010802，Bio-Optica)进行三色染色。病理评分由两位双盲病理学家根据先前公布的标准指南独立评估[44].

在全重建脾脏切片(每样5~10×50视野)的数字图像上检测CD3、B 220或F4-80阳性细胞的百分率，用AdobePhotoshop的魔力棒筛选出清晰的棕色阳性细胞。对于每个脾脏，直方图窗口中显示的阳性细胞像素数在总脾面积(以像素表示)中所占比例为%。在免疫荧光切片数字图像上，以CD4阳性细胞百分比计算Foxp 3阳性细胞数。

WESTERNBLOTTING(WB)

纯化循环CD 14细胞裂解液+细胞在RIPA缓冲液中加入蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(Roche，Monza，意大利)和香草酸钠。用离心法去除不溶性物质。样品采用SDS-聚丙烯酰胺10%双三倍凝胶电泳，并在PVDF-膜(固定化P膜、微孔、Billerica、MA、美国)上进行印迹.用三倍缓冲液加0.05%吐温-20和5%脱脂牛奶阻断非特异性部位。在三倍盐水加0.05%吐温-20和5%脱脂牛奶中隔膜.用美国丹弗斯公司(Danvers，MA，美国)购买的抗翻转技术(D5J1E)孵育膜，然后与次级山羊抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶(HRP)结合(Milli孔隙，Billerica，MA，美国)孵育。以HRP-结合抗β肌动蛋白(细胞信号技术，丹佛斯，MA，美国)为参照.GGE ImageQuant LAS 400用Pico底物(热Fisher科学，Waltham，MA，USA)发现蛋白质。

体内STAT 3靶向

在骨髓细胞移植后4周，用vFLIP嵌合体小鼠模型观察药物治疗的体内效应。在开始治疗前，显示至少20%供体来源细胞的嵌合体小鼠被随机分为两组.用巴利西尼(10 mg/kg；开曼化学品)或水飞蓟素(100 mg/kg；Sigma-Aldrich)腹腔给药，每2天一次，共9次。如上文所述，shRNA每周三次，将载于4PD上的shRNA(抗STAT 3或扰码)注射到4PD上[45)，共进行9次处理。ShRNA STAT 3序列：5′-UAAUACGACUCACUAUAAGGAGGGUGUCAGAUCACAUGGGCUUUCAAGAGAUCUCAACGGACCAUGCUACUGCCUU-3′；shRNA置乱STAT 3序列：5′-UAAUACGACUCACUAUAAGGGCAGUAGCAUGGUCCGUUGAGAUUCAAGAGAUCUCAACGGACCAUGCUACUGCCUU-3′(波士顿开放实验室)。实验结束时(第一次治疗后2周)进行IHC和流式细胞仪分析。当减重达到体重的20%时，Chimera小鼠被安乐死，作为动物规程定义的终点。

器官细胞悬液的制备

CO对小鼠进行安乐死2吸入。肺流式细胞仪分析：小鼠立即灌流20 mL冰凉PBS.采集和加工器官如下。脾脏按机械分离和过滤(康宁公司)。用剪刀将肺切成小块，37°C下酶解45 min，加入胶原酶IV(1mg/ml)、透明质酸酶(0.1mg/ml)和DNase(4.5mg/ml)(Sigma-Aldrich)。骨髓用含10%热灭活FBS(Superior，Merck)、2mm L-谷氨酰胺、10 mm HEPES、1mm丙酮酸钠、150 U/mL链霉素、200 U/mL青霉素/链霉素(均来自欧洲克隆)的RPMI 1640冲洗。然后收集、过滤红细胞，用ACK裂解缓冲液(Lonza)在RT下裂解5 min。外周血用PBS洗涤，红细胞在RT下溶解两次，持续10 min。用流式细胞仪对单细胞悬液进行分析。

单细胞RNA测序

3只未处理嵌合体、3只水飞蓟宾、3只巴利西尼和3只vFLIP-TG小鼠的肺按“器官细胞悬液的制备”部分所述进行消化。单细胞悬浮液(104细胞)加载到GemCode单细胞仪(10倍铬系统)上产生单细胞宝石.

单细胞rna-seq数据预处理

原始的bcl文件用bcl2Quickqv2.20从Illumina中分离出来，用10xcellRanger v3.1.0进行处理。特别是，使用带有参数的“细胞计数”命令--Expect-cell=4000‘来量化映射到小鼠(MM 10)和人类(GRCH 38)基因组的读取，并获得唯一的分子标识符(UMI)计数表。

单细胞rna-seq数据质量控制

数据集成之前的质量控制步骤分别使用R包“Seurat”对每个样本执行。46,47,48]和细柄[49]用于移除假定的双数。特别是为了保持高质量的转录，根据以下参数对细胞进行筛选：线粒体计数百分比、最小表达基因数、最小/最大UMIS数和双重评分。无论是小鼠还是人类，线粒体基因解释的细胞数量都低于20%。选择Sroublet阈值，在观察到的转录序列和模拟双体的直方图上查看，这是作者指南推荐的(Https://github.com/AllonKleinLab/scrublet/blob/master/examples/scrublet_basics.ipynb)。选择其他过滤阈值，观察数据的分布情况，以删除具有潜在异常行为的细胞。数据集2概述了过滤阈值的完整列表。

单细胞rna-seq数据集成

对于小鼠和人类细胞，所有样本都采用标准的Seurat v3集成程序进行集成[48]。在数据集成之前，使用带有默认参数的Seurat包中的log-规范化来规范化原始计数矩阵。接下来，用典型相关分析(CCA)的前30个维度对小鼠和人的scRNA-seq数据进行整合。整合后，计数矩阵对基因总数、UMIS和线粒体基因表达率进行回归。其次，利用Seurat的“VST”程序对前2000位变量特征进行主成分分析(PCA)。前20个主成分用于执行t分布随机邻居嵌入(TSNE)算法，并将单元投射到一个二维空间中。

细胞型鉴定

数据集成后，利用多个基于引用的单元注释和人工检测，对鼠标和人进行细胞类型识别。给老鼠，歌手[50]免疫基因组计划的基因表达谱[51]和小鼠RNA-seq[52]与scMCA结合使用。53]。对于人类数据，Singler是使用Blueprint/ENCODE的参考基因签名执行的。54, 55]，人原代细胞图谱[56，以及摩纳哥的免疫数据[57]。在最终的细胞分类之前，对细胞标签进行了简化，以丢弃超稀有(<20个细胞)细胞注释，并协调以匹配不同参考数据集中相应的主要总体标签。以3个参考数据集中的2个确定的分类为最终的细胞标识，并将所有3个数据集标记为“未分类”的细胞批注为“未分类”。最后，进行手工检查，以检查最终批注，并解决部分未分类细胞，通过适当的点图查看已知标记基因的表达情况(图)。S4B和S4D)。总的来说，约2%的老鼠和人类细胞被标记为非分类。

中性粒细胞和单核/巨噬细胞的聚类分析

为了在子集聚类分析中获得更好的分辨率，从数据集中提取了小鼠和人的中性粒细胞和单核/巨噬细胞群体，并采用类似于上述的方法重新整合(参见“单细胞rna-seq数据集成”部分)，最后进行聚类。中性粒细胞用Seurat集成，共30个CCA维数，分别用10个主成分和12个人类主成分聚类，构建共享近邻图(SNN)。小鼠和人的分辨力分别为0.12和0.15，可以通过神经网络找到明显的簇(≥2%的细胞)。单核细胞/巨噬细胞同样被整合并聚集在一起，分别由11组分和10组分组成，分别用于小鼠和人，分辨率为0.15。对于人类样本，参数‘k.filter=80’被设置为查找Seurat集成锚。在集成和聚类之后，利用tsne算法将细胞投影到一个二维空间.

人与鼠基因的定位

为了将鼠标映射到人类基因符号，鼠标基因组信息学(MGI)中的正方根表，Http://www.informatics.jax.org/downloads/reports/HMD_HumanPhenotype.rpt)只在两个物种之间保持一对一的映射(数据集1)。

基因集分析

对scRNA-seq和大量rna-seq数据进行了基因集分析。58]进行预先排序的基因集富集分析(gsea，59)或使用执行基因集变异分析的“gsva”R包(GSVA，[60])。用seurat函数‘findMarkers’计算scRNA-seq数据的基因水平统计量，用Wilcoxon秩和检验，类散体分析的平均对数倍变化阈值为0，聚类分析为0.1。为了分析先前发表的sars-cov-2 ace 2转基因小鼠数据集(Gse 154104)的rna-seq，通过DESeq 2软件包获得基因水平统计[61]。特别是去除重复基因符号后，进行差异表达分析，比较Sars-CoV-2 ACE 2-转基因小鼠感染后第7天(Dpi)和模拟感染小鼠(0 Dpi)的对数2倍于0的变化。MSigDB的50个标记基因集[62]作为GSEA和GSVA的输入。对于gsea，只有上调或下调的基因集经过调整。p-数值<0.05被认为有统计学意义。

人BAL中性粒细胞的参考分类

用Singler标记人外周血中性粒细胞簇的细胞，以vFLIP小鼠中性粒细胞簇的基因表达为参照。特别是，创建了一个类似于批量的鼠标引用，将每个集群中每个基因的对数归一化平均表达，并在通过正交学将鼠标基因映射到人类基因符号之后，将其提供给Singler进行基于参考的分类(参见“人与鼠基因之间的映射”一节)。Singler被执行，在指定参数‘DE.N’(数据集1)的聚类比较之间，取前100个差异表达基因。

数据可视化

一般来说，生物信息学图是利用R包Seurat和ggplot 2的功能获得的。63].

统计分析

所有数据均报告为平均值的平均±标准差(SE)。用Pad棱镜进行统计学分析(8.0.2版)。学生t分别采用Wilcoxon-Mann-Whitney检验和Wilcoxon-Mann-Whitney检验，比较两组间差异的统计学意义。价值被认为是非常重要的P≤0.05。

Sars-cov-2感染诱导的c-翻转在新冠肺炎患者和hfh_4-hce 2转基因小鼠中的过度表达

病毒已经进化出无数种方法来逃避宿主的凋亡过程，从而保护受感染的细胞免于早期死亡，从而消除了复制的利基[64]。包括丙型肝炎病毒在内的数种病毒[65]、乙型肝炎病毒[66人T细胞白血病病毒-167]，人体免疫缺陷病毒1[68[爱泼斯坦巴尔病毒]69和甲型流感病毒[70]诱导抗凋亡蛋白c-倒置，从而阻断caspase介导的细胞死亡[40]。痘病毒和疱疹病毒编码的蛋白质与c-翻转有很高的同源性，例如Kaposi疱疹病毒K13/vFLIP和疱疹病毒saimiri orf 71，这两种病毒都有DED结构域，负责阻止蛋白酶分解，防止细胞凋亡，并有利于病毒潜伏期[36]。因此，翻转表达通过抑制宿主细胞死亡而与病毒复制相联系。

为了检测新冠肺炎的c-翻转改变，我们分析了SARS-CoV-2感染患者的肺尸检标本；n2 3例细菌性肺炎(BP)；n=4)或其他疾病(NRD)；n=4)(补充资料，表2A)。后一组患者呼吸道未见严重炎症改变，组织结构基本无病理改变(图一)。1A，第一行)。相比之下，新冠肺炎患者的肺组织病理表现为不同程度的炎症和组织损伤(补充资料，表)。1) [22, 71]。当我们评估CD 68的数量时+髓系细胞，包括肺泡巨噬细胞、单核/间质巨噬细胞和组织细胞[72, 73]，对于flp的表达，新冠肺炎样本显示了可变数量的翻转表达cd 68。+细胞(图1.1A(第二行)暗示翻转的积累+新冠肺炎进展过程中的髓系细胞。相反，新冠肺炎也显示中性粒细胞的中度和异质性浸润，这些中性粒细胞是中性粒细胞-弹性蛋白酶(NE)阳性细胞，也不是阳性细胞。补充资料、图1.S1a)。在此之前，我们发现强迫翻转表达通过异常激活几条分子途径，包括STAT 3依赖的信号通路，将髓系细胞重新编程成免疫调节元件。35]。由于STAT 3高活化是新冠肺炎最常见的相关特征，如快速凝固病、血栓形成、组织纤维化、炎性细胞因子和趋化因子的产生以及T淋巴细胞减少[74]，我们接下来评估pSTAT 3在选定的病理肺场中的表达。我们在NRD标本中检测到pSTAT 3的弱表达，而有限的pSTAT 3模式仅限于细菌性肺炎切片中的间质细胞。然而，pSTAT 3在新冠肺炎中的一致和弥漫性表达被多种细胞类型所共有，其中包括几种CD 68。+翻转+肺泡巨噬细胞1A，第三和第四系)，组织细胞(图)。1A和单核细胞/间质巨噬细胞(补充资料、图1.S1B)。有趣的是，CD 68+翻转+PSTAT 3+被分析病例中有56.5%(13/23)细胞存在，其存在与死亡时间显著相关(以住院天数(即没有CD 68)表示)。+翻转+PSTAT 3+细胞(n=10)25±14.4天VS。CD 68的存在+翻转+PSTAT 3+细胞(n=13)18±9.3天；p=0.0223)(补充资料，表2B)。相反，CD 68+表达本身并不是疾病进展的预测，因为它没有区分住院时间较短或更长的患者(补充信息，图1)。S1C).

A代表H&E染色的非呼吸系统疾病(NRD)、细菌性肺炎(BP)和新冠肺炎患者(上面板)肺组织的显微图像。200μm.肺泡巨噬细胞(第二、第三和第四系)和组织细胞(第五和第六线)的代表免疫荧光(IF)染色。细胞染色：CD 68(绿色)、c-翻转(红色)、pSTAT 3(白色)、DAPI(蓝色)。刻度棒，20μm。B循环单核细胞(CD 14)c翻转的定量及代表IF染色+从健康供体(HD，n=4)或新冠肺炎病人(n=5)。细胞染色为DAPI(蓝色)和c-翻转(红色)。标尺，10μm。C新冠肺炎患者循环c翻转表达率与抑制率的相关性(英文)n=16)。D循环单核细胞(CD 14)中pSTAT 3与c翻转规范化表达的相关性+从新冠肺炎患者中分离出细胞(n=10)。EIL-6或TNF-α细胞因子释放与单核细胞(CD 14)pSTAT 3表达的相关性+来自HD的细胞(红色，n=4)和新冠肺炎患者(黑色，n=13)。FHFH4-hACE 2转基因小鼠SARS-CoV-2感染或模拟感染小鼠肺组织典型苏木精和伊红(H&E)染色显微图像。用间接免疫荧光(IFA)法检测BAR，200μm，pSTAT 3，c-翻转和CD11b的表达水平。标度栏，100μm。用Spearman秩相关法进行相关分析。C–E).

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我们检测了新鲜循环单核细胞(CD 14)中c-翻转和pSTAT 3的表达。+)从SARS-CoV-2感染者中分离出的细胞(补充资料，表)2C)。免疫荧光分析显示c-倒置蛋白在循环CD 14中的表达增加。+从新冠肺炎患者中分离出的细胞与健康捐献者(HDs)相比较(见图)。1B)，以及单核细胞c翻转表达与其免疫抑制特性之间的线性相关关系(见图)。1C，补充资料，图1。S1D-E)。Pd-L1在c-翻转表达的CD 14中表达增强。+细胞(补充信息，图。S1F)，与我们先前在胰管腺癌(PDAC)患者中的发现一致[35]，暗示新冠肺炎和癌症中先天免疫调节的共同机制。

接下来我们试图确定c翻转表达的循环单核细胞是否伴随着STAT 3的激活.我们发现在循环CD 14中，pSTAT 3与c-倒置蛋白的表达有显著的直接相关性。+从新冠肺炎患者中分离出的细胞。1D提示不仅在肺部位，而且在周围，髓系细胞的翻转/STAT 3轴异常激活。髓系细胞中的STAT 3通路与获得免疫抑制功能有关[75,76,77在免疫紊乱期间促进细胞因子的产生[78]，两种条件共同建立严重淋巴细胞减少症，这是新冠肺炎患者临床严重程度的征象之一。从新冠肺炎患者中分离出的单核细胞分泌了大量的细胞因子，这与pSTAT 3的表达有关(见图)。1E以及补充信息，如图所示。S1G)，与已公布的单核细胞对细胞因子风暴贡献的数据一致[79, 80].

为了建立sars-cov-2感染后倒装和pSTAT 3失调之间的直接联系，我们分析了sars-cov-2或模拟病毒经鼻感染的hACE 2转基因小鼠(hfh 4-hACE 2小鼠)的肺[81]。病毒攻击后第7天的肺组织检查显示，sars-cov-2感染导致严重肺炎，其特征是cd11b升高。+髓系细胞在血管周围和肺泡周围的积聚(图。1F)。值得注意的是，SARS-CoV-2感染小鼠肺浸润性髓系细胞表达的p-STAT 3水平高于对照组(图1)。1F)。此外，我们还发现p-STAT 3在c-倒装中的表达增加。+SARS-CoV-2感染小鼠肺内的细胞形态与髓系细胞相似(见图)。1F)，如p-STAT 3的存在所示。+C-翻转+CD 68+SARS-CoV-2感染小鼠肺浸润细胞(补充信息，图1)。S1H)。总的来说，这些数据证实髓细胞亚群转化为翻转和pSTAT 3表达元件，其特征是在新冠肺炎中具有促炎和免疫抑制的特征。

VFLIP在髓系细胞诱导的CRS肺和全身病理特征中的过表达(包括致命性结果)

因为在髓系细胞中表达v-翻转的转基因小鼠由于全身免疫紊乱而在出生后4周内过早死亡[35]将ROSA26.vFLIP、LyzM-CRE(CD 45.2)和野生型小鼠(CD 45.1)的骨髓(BM)以不同比例混合移植到小鼠体内。所有移植小鼠均出现体重减轻(补充信息，图1)。S2A-B)，全身淋巴细胞减少，脾髓样细胞大量积聚，脾脏结构被破坏(补充信息，图1)。S2C)，以及在几个器官导致多器官损伤和纤维化领域的发展(补充信息，图1)。S2D)，包括肺。在本研究的后续分析中，我们使用了bm嵌合体(以下定义为vflip小鼠)，它是通过移植1：1的vflip而产生的。+和WT BM细胞。

由于肺部炎症是慢性呼吸道综合征(包括严重新冠肺炎)危及生命的主要原因[20]，我们观察了vFLIP小鼠的肺组织病理学。VFLIP小鼠肺表现为弥漫性间质髓样浸润和肺泡损伤，表现为肺纤维化、肺实变、多核细胞团簇及伴支气管周围和血管周围浸润并伴有血管内血栓的组织区。严重的病例也显示梗死和广泛的纤维化(图一)。2A，B，补充资料，图1。S3A-D)。与新冠肺炎crs一致，我们在两个单个核吞噬细胞中检测到pSTAT 3(下称CD 68)。+，F4/80+或Ly6C+细胞)和中性粒细胞(下称NE)+细胞或Ly6G+细胞)定位于vFLIP肺组织中，与正常小鼠相比(如图所示)。2C，补充资料，图1。S3C)。考虑免疫异常反应在新冠肺炎发病中的作用，通过促进肺泡炎症和肺血管的高凝状态[26, 82]评价内皮功能障碍标记物P-选择素(CD62P)在vFLIP小鼠肺环境中的表达。P-选择素通常储存在内皮细胞的Weibel-栅栏体中.组织损伤后暴露在血管腔内，介导血小板和白细胞的粘附和活化。83]。在vFLIP小鼠中，P-选择素在大、小口径发炎血管的管腔表面均有强表达，而在WT小鼠肺中未检测到P-选择素。二维空间).

AWt(上面板)或vFLIP嵌合体小鼠肺的典型H&E染色显微图像。标尺，200μm。B肺浸润中性粒细胞(NE)的代表IF染色+和单核吞噬细胞(CD 68)+(细胞)在WT或vFLIP小鼠中。细胞染色：DAPI(蓝色)，中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)(红，中板)，CD 68(绿色，底板)。标尺，200μm。CWT或vFLIP小鼠肺浸润中性粒细胞和单核吞噬细胞的代表IF染色。20μm.细胞染色：DAPI(蓝色)，NE(红色，中间板)或CD 68(绿色，底盘)，pSTAT 3 Tyr 705(灰色)。DH&E染色显示P-选择素(CD62P)在WT(上板)或vFLIP小鼠肺组织中的表达。标尺，100μm。E典型共聚焦分析：WT(左面板，50μm)或vFLIP小鼠(2 0 0μm)。DAPI(蓝色)、NE(红色)、H3cit(绿色)染色。F肺浸润单核吞噬细胞IL-6和TNF-α的点图(CD 45.2)+Ly6C+细胞和中性粒细胞(CD 45.2)+Ly6G+从vFLIP小鼠中分离出细胞(n=17)。G脾浸润中性粒细胞(NE)的代表IF染色+和单核吞噬细胞(F4/80)+(细胞)在WT或vFLIP小鼠中。细胞染色：DAPI(蓝色)，NE(红色，中间板)，F4/80(绿色，下板)。标尺，200μm。HWT或vFLIP小鼠脾浸润中性粒细胞和单核吞噬细胞的代表IF染色。细胞染色：DAPI(蓝色)，NE(红色，中间板)，F4/80(绿色，底部面板)和pSTAT 3 Tyr 705(灰色)。I白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α在单个核细胞(Ly6C)中的点图+细胞)和多形核(Ly6G)+脾髓样细胞n=8)或vFLIP小鼠(n=9)。数据报告为平均数±S.E.M.*p≤0.05，**p≤0.01和*p≤0.001由Mann-Whitney检验.

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在炎症过程中中性粒细胞的效应机制中，中性粒细胞源性细胞外陷阱(Nets)与新冠肺炎肺损伤的病理过程密切相关。82]。根据这一证据，经共聚焦显微镜鉴定为与NE和瓜氨酸化组蛋白H3(H3Cit)共定位的细胞外DNA染色[84]，未检出在WT小鼠肺中，而在v-翻转小鼠的肺内和肺泡中有表达(图1)。2E)。由于几种刺激可触发中性粒细胞活化和NET，包括炎性细胞因子和趋化因子[85, 86]，我们评估了髓系细胞是否是这些可溶性因子的来源。用细胞内染色法，计数肿瘤坏死因子-α-和产生IL-6的单核吞噬细胞(CD 45.2)。+Ly6C+细胞和中性粒细胞(CD 45.2)+Ly6G+)从vFLIP小鼠肺中分离出的细胞。我们不能从WT小鼠肺中分离出足够数量的髓样细胞。单核细胞中炎性细胞因子的生成高于中性粒细胞(图1)。2F)。值得注意的是，在vFLIP小鼠的脾脏中也发现了明显的髓样细胞聚集(如图所示)。2G)，其中pSTAT 3的百分比很高。+并检测炎性细胞因子产生的单核细胞。2H，i)。我们推测这些细胞可能会为T细胞和效应T细胞和辅助T细胞造成不利的环境，而T调节淋巴细胞(Tregs，被确认为CD4)则会大量收缩。+Foxp 3+细胞在vFLIP小鼠脾脏中明显扩张(补充信息，图)。S3E-F)，揭示了一种明显的系统性淋巴管减少症，它反映了新冠肺炎相关的CRS。

为了更广泛地了解vFLIP小鼠CRS的免疫前景，我们对肺浸润细胞进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。经过预处理、整合和细胞注释(见“材料/主题和方法”一节)，在WT和vFLIP小鼠上共获得31 274个小鼠细胞转录。所有细胞通过t分布随机邻居嵌入(t-SNE)可视化，评估不同小鼠样本的细胞比例，以获得细胞组成的总体概况(补充信息，图1)。S4A-B)。当我们比较每种细胞类型在WT和vFLIP条件下的百分比时(如图所示)。3AVFLIP小鼠中性粒细胞比例(~65%)高于WT小鼠(~23%)，T(~5%vFLIP；~17%WT)和B淋巴细胞(~3%vFLIP；~21%WT)明显减少，证实了上述有关中性粒细胞肺浸润的病理资料(图)。2C)。而单核细胞(~9%vFLIP；~12%WT)和巨噬细胞(~13%vFLIP；~16%WT)在两组间具有可比性。

A根据细胞类型对2WT和2个vFLIP小鼠样本(WT：9174；vFLIP：9847)的scRNA-seq的tSNE表示。在WT和vFLIP条件下表示单元类型比例的条形叠加图。B表示上调的条形图(NES>0，调整后)p-值<0.05)标记基因集在vFLIP与WT细胞的分析中通过GSEA分析得到。C小提琴图显示vFLIP小鼠肺组织中通过NF-κB和JAK-STAT 3信号通路上调炎症反应、TNF-κ信号转导通路的关键基因的表达。星号表示在vFLIP和WT条件比较中的显着性提升(*)。p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). D表示上调的条形图(NES>0，调整后)p-值<0.05)rna-seq数据中的标记基因集，通过对感染SARS-CoV-2的ACE2转基因小鼠的GSEA分析得到[88]比较感染后第7天(Dpi)和模拟感染(0 Dpi)。红条指的是在vFLIP和ACE 2转基因小鼠中富集的基因集。

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为了全面了解vFLIP小鼠体内激活的生物通路，我们对vFLIP和WT细胞进行了基因集富集分析(GSEA)。我们注意到炎症反应，肿瘤坏死因子-α信号通过NF-κB和JAK-STAT 3信号通路中的最高富集基因组显著上调(图一)。3B)。值得注意的是，这些过程与多种促炎介质如IL1b、CCRL 2、IL1a和TNF的过度表达有关。3C)。所有这些数据与pSTAT 3过表达和肿瘤坏死因子-α在vFLIP小鼠体内高分泌的结果是一致的(如图所示)。2F)，以及以前关于翻转控制NF-κB的数据[35, 87]。为了联系sars-cov-2感染vFLIP小鼠的结果，我们将vflip小鼠的gsea结果与sars-cov-2感染的hACE 2转基因小鼠的大量rna-seq数据进行了gsea分析。88]。HACE 2小鼠感染后(感染后第7天)vFLIP上调途径与富集途径的比较VS第0天，无花果。三维空间)，我们发现SARS-CoV-2诱导的炎症通路与vFLIP小鼠有共同之处.有趣的是，这些数据与其他SARS-CoV-2感染动物模型的转录分析一致[89]。这些结果共同支持了vFLIP小鼠模型中CRS综合征可能模仿新冠肺炎免疫病理的概念。

VFLIP小鼠和新冠肺炎患者在肺环境中表现出相似的炎性髓样细胞景观。

为了比较vFLIP小鼠和新冠肺炎患者的肺免疫景观，我们量化了小鼠肺浸润白细胞与重症患者支气管肺泡灌洗液(BAL)中19,996个免疫细胞的相似性。n=7；世卫组织序数评分7)被送往维罗纳医院重症监护病房[32]。一种类似于小鼠细胞整合和注释的程序被用来评估人BAL样本中的细胞组成(补充信息，图)。S4C-D)。在小鼠和人类数据集中，中性粒细胞和单核/巨噬细胞群体在聚类前被分离并重新整合，以便在子集识别和比较中获得更好的分辨率。

聚类后，小鼠中性粒细胞由4个典型的中性粒细胞标记组成，其中包括S 100家族基因和Adam 8(簇0)，炎性趋化因子Ccl 3和CCl 4(第1组)，高表达夏令营和NGP基因(第2组)和干扰素应答基因ISG 15/IsG 20(第3组)(图3)。4A和补充资料、数据集1)。同样，在新冠肺炎BAL中，我们列出了5个表达类似于小鼠中性粒细胞亚群的标记基因的不同簇。特别是，我们观察到了表达典型中性粒细胞标记物的簇，例如S100A8/S100A9基因(A组)，CCL 3/CCl 4趋化因子CTSB和CSTB基因(b组)，干扰素应答基因伊菲1, IFIT 2，和ISG 15/ISG20(c组)和其他两个表达核糖体(D)和热休克蛋白(HSP)基因的簇(E组)(图)。4B和补充资料、数据集1).

A小鼠肺组织scRNA-seq分析所得中性粒细胞的TSNE表现和堆积条图聚类分析。n=7)和B新冠肺炎病人bals(n=7)。通过tSNE投影显示小鼠(17,099)和人(15,366)的中性粒细胞，并对其进行聚类分析。C根据小鼠中性粒细胞的平均表达对BAL中性粒细胞团簇进行参考分类(见“材料/研究对象和方法”)。D小提琴图显示了关键的炎症和干扰素反应基因在小鼠中性粒细胞中的表达。星号表示在vFLIP和WT条件比较中的显着性提升(*)。p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). E小鼠单核/巨噬细胞亚群分析n=7)和F新冠肺炎(n=7)。通过tSNE投影显示小鼠(6115只)和人(3445只)的单核/巨噬细胞，并对其进行聚类分析。GGSVA评分：炎症反应，JAK-STAT 3信号，以及通过NF-κB通路横跨小鼠(左)和BAL(右)单核/巨噬细胞簇的肿瘤坏死因子-κ信号。H小提琴图显示关键炎症反应和JAK-STAT 3信号通路基因在小鼠单核/巨噬细胞亚群中的表达水平。星号表示在vFLIP和WT条件比较中的显着性提升(*)。p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

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我们使用基于参考的分类(见“材料/主题和方法”部分)将鼠标子集映射到人类子集。结果证实了这两种植物之间的中性粒细胞簇之间的保守结构和病理(图1)。4C)。事实上，约89%的人类集群c被标注为小鼠的簇3，约81%的集群d被标注为第1组，最后，群a、b和e主要被标注为小鼠的第1组(60%-65%)。相反，簇2似乎是小鼠特异性的中性粒细胞亚群，在人类亚群中没有相应的对应。这些结果概括了已发表的报告[90]，其中小鼠和人之间的3个保守模块的特征是：CCL 3/CCL 3, CSTB/CSTB(vFLIP中的第1组)，I型干扰素应答基因，如Ieft 1/Iit 1, IRF 7/IRF 7，和Rsad2/RSAD 2(vFLIP中的第3组)和表达标准标记的中性粒细胞S100A8-A9/S100A8-A9(vFLIP中的群集0)。

尽管小鼠簇1和3不是最丰富的中性粒细胞亚群(图1和图3)。4A在vFLIP小鼠中，与WT小鼠相比，vFLIP小鼠细胞比例失调最多。的确，簇1显示出两倍以上的增长(~27%vFLIP；~11%WT)，而集群3与WT(~3%vFLIP；~1%WT)相比，vFLIP下降了3倍。此外，在聚类水平上的GSEA分析揭示了在第1组(补充信息，数据集)中与中性粒细胞炎症反应有关的几个主要基因。1)，例如IL1b, IFitm 1, Clec5A，和CCRL 2，在vFLIP中与WT小鼠相比均有上调作用(图1)。4D和补充资料、数据集1).

我们在小鼠单核吞噬细胞室(单核/巨噬细胞)中检测到7个簇(如图所示)。4E)。在巨噬细胞中，我们可以确定肺泡巨噬细胞表达。姆尔克1, Krt 79，和Krt 19表达炎症细胞因子的巨噬细胞，如Cxcl 3, CXCL 1，和IL1a(第4组)或增殖标志明基67和TOP2A(第5组)和一个表达高水平核糖体基因的簇(第6组)。此外，我们还获得了一个由巨噬细胞(~64%)和单核细胞(~36%)组成的簇，其特征是C1qa和C1qb(第1组)。最后，在单核细胞中检测到经典的单核细胞表达。CCR 2和Ly6c2(簇3)和非经典单核细胞表达Ly6c2, 王牌，和镉300 e(簇2)，复制以前在荷瘤小鼠中描述的免疫景观[90]。在BAL患者的单核/巨噬细胞室中，我们观察到5个团簇。4F)：表达增殖标记的巨噬细胞簇MKI 67和TOP2A(d组)；主要以巨噬细胞表达为特征的簇C1QA, C1QB，和MRC 1(A组)；表达单核细胞标记的簇FCN 1和VCAN(B组)；两个小簇表达核糖体(C组)和热休克蛋白(HSP)基因(e组)。可能是由于内在的复杂性90而单核吞噬细胞室中的细胞数量较少。32在BAL标本中，我们无法区分经典单核细胞和非经典单核细胞，也无法识别不同的巨噬细胞亚群。尽管有这些警告，我们观察到在子集5和d之间有相似的顶级标记基因的表达，这些基因识别了增殖中的巨噬细胞(补充信息，数据集)。1)；此外，多个巨噬细胞系基因的表达C1QA, C1QB，和MRC 1在两个物种之间分享。相反，炎症基因，如IL1B, CXCL 1，和CXCL 3主要由bals中的单核细胞表达，与小鼠数据集不同，后者在单核细胞和巨噬细胞中都有高水平的表达(补充信息，数据集)。1)。通过基因集变异分析，证实TNF-α通过NF-κB和JAK-STAT 3信号转导的炎症反应和相关途径在小鼠单核细胞和巨噬细胞中具有活性，而在BALS中则特异性地定位于单核细胞(图1)。4G)。尽管有几个小鼠亚群，但与WT小鼠相比，vFLIP中的炎症基因表达上调(图1)。4H，以及在炎症相关通路上的高GSVA分数(如图所示)。4G)，聚类分析揭示了在第4组(补充信息，数据集)中，通过NF-κB和JAK-STAT 3途径的炎症反应、肿瘤坏死因子-κ信号通路的显著上调。1)，在细胞比例上也是最失调的(~19%vFLIP；~8%WT)。4E)。值得注意的是，与wt相比，vflip第4簇中JAK-STAT 3信号通路的上调与该通路中几个基因的表达平行，如JAK 2, CSF 1，Il10 rb，和CD 38(无花果)4H、底部面板)。

总之，在vFLIP小鼠和严重新冠肺炎患者的肺环境中，丰富了与炎症反应相关的转录特征的髓样细胞的保守景观，符合翻转表达的髓样细胞驱动肺病理的概念。

STAT 3对vFLIP小鼠免疫病理的抑制作用

为了研究靶向STAT 3是否足以抑制vFLIP小鼠不受控制的免疫失调，我们评价了STAT 3的药理或RNA干扰治疗方法。最初，我们在体内测试了两种STAT 3抑制剂的功效：水飞蓟宾，一种阻断Y 705磷酸化相关和STAT 3二聚的STAT 3抑制剂。91，或称巴利西尼，一种经临床批准的JAK 1和JAK 2的抑制剂，能够干扰STAT 3信号的激活[92]。建立小鼠骨髓嵌合体模型后4周，腹腔注射每2天一次。在接受药物治疗的小鼠中，体重减轻明显减少(补充信息，图1)。S5A)。此外，STAT 3靶向降低了血浆中几种促炎细胞因子的浓度(如图所示)。5A)，是在未治疗的vFLIP小鼠中以异常水平产生的，也是新冠肺炎的特征之一。3]。脾组织免疫组化显示vFLIP小鼠全身淋巴细胞减少，但有一定差异，因为巴利替尼促进T细胞和B细胞的增加，而水飞蓟宾只影响T淋巴细胞频率。5B)。通过分析8个不同的参数(如间质增大、血管充血、血管周围中性粒细胞、血栓的存在、梗死、纤维增生、泡沫细胞团簇和血管周围浸润)；补充信息，图。S5B)，我们证实治疗后小鼠炎症性肺炎的病理评分下降(图一)。5C以及补充信息，如图所示。S5C).

AVFLIP小鼠治疗前(T0)或治疗结束(未治疗)血清中细胞因子水平的分析n=9；水飞蓟宾，n=9；n=9)。B淋巴细胞(B细胞：B 220)+T细胞：CD3+细胞)和巨噬细胞(F4/80)+细胞)未经处理的脾脏中的定量(n=14)，水飞蓟宾(n=8)，和巴里西尼b(n用H&E染色法检测vFLIP小鼠。标尺，200μm。C未经治疗的肺病理评分(n=14)，水飞蓟宾(n=8)，和巴里西尼b(n用H&E染色法检测vFLIP小鼠。标尺，200μm。D用水飞蓟素(3414)和巴里替尼(4177)染色的未处理小鼠(4662只)的scRNA-seq的tSNE表达。代表不同条件下单元格型比例的堆叠条形图。E条形图表示向上和向下调整(调整)p-值<0.05)与未处理的vFLIP嵌合体细胞进行GSEA分析比较，在体样分析中获得的标记基因集与未处理的vFLIP嵌合体细胞相比较。F小提琴图显示炎症反应相关基因的表达，JAK-STAT 3信号通路和干扰素在vFLIP嵌合体小鼠肺中的表达(*)p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). Data are reported as mean ± S.E.M. *p≤0.05，**p≤0.01和*p学生≤0.001t测试曼-惠特尼测试

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为了进一步探讨炎症性关闭的分子基础，我们用scRNA-seq评估了治疗和未治疗的vFLIP小鼠肺浸润白细胞的形态。在用t-SNE将细胞投射到二维空间后，我们评价了药物治疗对主要细胞亚群比例的影响。两种处理均降低中性粒细胞比例(UT~82%；水飞蓟宾~76%；巴利西尼66%)，其他细胞(如淋巴细胞)的代偿性增加，提示肺浸润性白细胞频率有再平衡的趋势(图一)。5D)。考虑到中性粒细胞亚群，我们观察到治疗后小鼠主要中性粒细胞亚群(0：~89%UT；~87%水飞蓟宾；~86%巴利西尼)和表达干扰素应答基因的中性粒细胞(3：~2%UT；~4%水飞蓟素：~5%巴利西尼)略有减少(补充信息，见图)。S5D)。因此，STAT 3靶向方法可以改变中性粒细胞的组成，有利于I型干扰素应答相关基因元素的累积。对小鼠单核细胞/巨噬细胞，我们观察到3：~32%UT；~23%水飞蓟素；~25%巴利西尼)和巨噬细胞表达炎性细胞因子的数量(4：~12%UT；~8%水飞蓟素；~8%巴利西尼)；同时，在第1组(~25%UT；~27%水飞素；~41%巴利替尼)和第2组(非经典单核细胞：~10%UT；~20%水飞蓟素；~14%巴西尼)(补充信息，Fig)中，均有明显增加。S5D).

最后，谷胱甘肽分析证实，在两种基于STAT 3的治疗中，与对照组相比，干扰素α/γ通路均有上调，同时与炎症反应、JAK-STAT 3依赖的信号通路以及通过NF-κB的肿瘤坏死因子-κ信号通路相关的基因信号的下调(图1)。5E)。与此一致的是，一些炎症基因，如IL1b，Clec5a，CCRL 2，和IFitm 1被下调IFITM 3, STAT 1，和ISG 15与干扰素反应通路相关的基因在巴利西尼治疗的vFLIP小鼠中被上调(如图所示)。5F)。因此，STAT 3抑制剂可能通过影响异常的翻转-STAT 3前馈环而使抗病毒反应活跃，从而局部和系统地减轻炎症病理。

为了证实STAT 3抑制剂的免疫调节能力，我们检测了这两种化合物对新冠肺炎患者c翻转表达的单核细胞的免疫抑制功能的控制作用。与未治疗的对照组相比，与两种药物预处理的单核细胞共培养后，T细胞的增殖明显保持不变(补充信息，图1)。S5E)。这些结果表明，STAT 3靶向可能通过限制SARS-CoV-2培养的髓系细胞的免疫抑制特性来防止T细胞紊乱，从而证实了巴利西尼在改变新冠肺炎患者髓系细胞免疫调节特性方面的临床结果。80].

为了提供补充证据，证明髓系细胞中直接的STAT 3-沉默可以控制vFLIP小鼠免疫病理疾病的演变，我们开发了4PD纳米粒的体内传递，其表面负载了STAT 3特异性短发夹RNA(ShSTAT 3)。4PDs对单个核吞噬细胞的识别和靶向作用以及介导在体内有效传递shSTAT 3的能力已在小鼠肿瘤模型上得到证实。45]。因此，vFLIP小鼠每2天服用9次，每2天一次，每2天一次，处理4PDs，其中包括一个置乱RNA序列(shCTRL，作为阴性对照)或shSTAT 3。类似于STAT 3的药物治疗，基于基因的STAT 3沉默在髓系室控制体重下降，限制了CRS相关的恶病质(补充信息，图1)。S6A)。此外，STAT 3-沉默影响炎症性肺炎的严重程度，如肺病理评分下降所强调的那样(如图1所示)。6A以及补充信息，如图所示。S6B)，使肺组织内中性粒细胞减少和炎症都有强烈的收缩(如图所示)。6B以及补充信息，如图所示。S6C)。值得注意的是，经shSTAT 3处理的小鼠还显示全身淋巴细胞减少，T和B淋巴细胞的频率增加，脾脏中的髓样细胞减少(如图所示)。6C)和外周血(图1)。6d)。最后，4PD介导的STAT 3特异性shRNA传递使血浆中几种促炎细胞因子的浓度正常化(如图所示)。6E)。综上所述，这些数据表明，STAT 3靶向，特别是在髓系细胞，是有效的回火CRS相关的免疫病理疾病触发翻转表达细胞的积累。

AVFLIP小鼠肺病理评分(未经治疗，n=6；n=5；sh-STAT 3，n(5)H&E染色。标尺，200μm。B髓系细胞(CD11b)流式细胞仪分析+单核吞噬细胞(Ly6C)+中性粒细胞(Ly6G)+B(B 220)+和T细胞(CD3)+从vFLIP小鼠肺中分离出淋巴细胞(未经治疗，n=6；n=5；sh-STAT 3，n=5)或WT小鼠(n=5)。C淋巴细胞(B细胞：B 220)+T细胞：CD3+细胞)和巨噬细胞(F4/80)+VFLIP小鼠脾脏中细胞的定量(未经治疗，n=6；n=5；sh-STAT 3，n(5)H&E染色。标尺，400μm。D髓系细胞(CD11b)外周血流式细胞仪分析+单核吞噬细胞(Ly6C)+中性粒细胞(Ly6G)+B(B 220)+和T细胞(CD3)+VFLIP小鼠的淋巴细胞(未经治疗，n=6；n=5；sh-STAT 3，n=5)或WT小鼠(n=5)。EWT患者血清细胞因子水平分析(英文)n=5)n=5)，或称sh-STAT 3(n=5)vFLIP小鼠。数据报告为平均数±S.E.M.*p≤0.05，**p≤0.01和*p≤0.001由Mann-Whitney检验.

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到目前为止，CRS的病理学尚不完全清楚，没有一个单一的定义被科学界广泛接受。我们的数据证明翻转表达的髓样细胞是CRS的关键驱动因子.事实上，vFLIP嵌合体小鼠表现出急性全身炎症症状(如图所示)。2以及补充信息图。S2-3)，细胞因子水平升高。5A)，减肥(补充资料，图。S5A)，淋巴管减少症(补充资料，图1.S2C)，肺损伤。2A)内皮细胞活化。二维空间)和多器官功能障碍(补充信息，图。S2D)。VFLIP激活对炎症性疾病的影响也被证实这种抗凋亡蛋白在炎症性肠病中的作用。93小鼠多中心Castleman病[94，以及如何将髓系细胞重新编程为免疫抑制因子[35].

在临床前试验和临床试验之间仍有很大的差距，以有效地治疗CRS，以及确定控制致病过程的关键分子机制。在过去的几十年里，小鼠脓毒症模型，如lps诱导的炎症，或将人pbmc植入免疫缺陷小鼠(模仿car T细胞治疗诱导的细胞因子风暴)的人源化小鼠的发展，主要是为了复制crs的临床分期和结果，作为筛选潜在治疗的平台[6, 95]。然而，还没有开发出合适的体内实验模型来识别分子和细胞过程中的改变，这些改变可能会突出CRS的触发机制。我们的研究基于一种组织特异性转基因条件敲入小鼠模型，为定义炎症和crs相关免疫功能障碍的机制提供了一种新的工具。

与我们的结果一致，最近的研究强调c-翻转在几个受sars-cov-2感染的细胞系中表达增强，其中倒装抑制因子的表达，如叉头转录因子FOXO 3a[96被废除[30, 97]。由于c-翻转与fdd和/或caspase-8或-10和TRAIL受体5相互作用，可阻止caspase级联的死亡诱导信号复合体的形成和随后的激活[98]，SARS-CoV-2病毒利用翻转介导的细胞死亡延迟来复制是合理的。我们对SARS-CoV-2感染的hACE 2转基因小鼠和新冠肺炎患者的尸检标本进行了分析，首次证实了严重急性呼吸道感染患者髓系细胞在体内的过度表达(图一)。1)。然而，与传统上认为翻转干预细胞存活相比，我们的发现更多地指向了调节髓系细胞以决定CRS进展的附加功能(图1)。1D，E；图1.2I).

两位新冠肺炎患者的单核细胞。1C)和vFLIP转基因小鼠[35显示免疫抑制特性，是促炎细胞因子的来源。1E以及补充信息，如图所示。S1G)。我们发现从新冠肺炎患者分离的单核细胞的免疫调节功能与PD-L1(补充信息)的表达有关。S1F)，提示在新冠肺炎进化过程中，免疫检查点参与对T细胞的阻断可能起了一定的作用。这些数据与我们先前的研究结果一致，表明从PDAC患者中分离出的翻转表达的单核细胞表面pd-l1水平较高[35]并证实了以前的报道，表明新冠肺炎患者的免疫抑制性髓系细胞确实增加了。CD 274MRNA水平32, 34]。根据Schulte-Schreping的报告，STAT 3被怀疑是新冠肺炎中免疫抑制性单核细胞的转录因子，我们证明STAT 3抑制剂确实可以逆转STAT 3抑制剂的免疫抑制作用(补充信息，图1)。S5E)。此外，我们还揭示了SARS-CoV-2感染宿主髓系细胞中伴随有翻转和激活的STAT 3信号的表达(图一)。1A和F)，以及vFLIP转基因小鼠模型。2C)。进一步的研究应机械地解决c-翻转作为转录因子的非常规性质，无论是其本身还是能够在病理条件下激活髓系细胞中STAT 3信号通路的辅助因子，到目前为止，这些特性仅在永生化细胞系中得到部分证实。43, 99].

由于髓系细胞在体外强制表达FLIP促进了多种促炎细胞因子(如IL-6、IL-7、IL-10、CSF 3和TNF-α)的“导向”NF-κB活化，从而增强了STAT 3信号的激活[35]，我们认为在CRS演化过程中，通过翻转NF-κB和STAT 3的联合作用，可以建立一个普遍的炎症循环。事实上，在多种炎症性和自身免疫性疾病中，NF-κB和STAT 3分子之间的协同作用是基于促炎细胞因子(即IL-6)的。100在新冠肺炎中也有这样的假设。101]。最近对新冠肺炎解剖中多器官蛋白质组学的分析证实，NF-κB和STAT 3均为多器官转录因子上调的转录因子。102]，这意味着这两条通路被广泛而普遍地激活。相反，我们没有发现vFLIP小鼠体内Ⅰ型IFN反应与WT小鼠相比的整体变化，提示vFLIP小鼠CRS的进展与IFN-I相关途径无关，而冠状病毒感染时IFN-I反应起着关键作用，至少在病毒控制的初始阶段是如此。这一差异很可能依赖于这样一个事实：vFLIP模型仅仅模仿新冠肺炎病的晚期，后者的特点是炎症加剧。

我们在体内的研究结果表明，STAT 3靶向治疗为CRS小鼠提供了一个重要的疾病控制机制，出乎意料地凸显了阻断NF-κB/STAT 3环的单个成员是如何足以阻止病理性炎症的。本文提供的数据与巴利替尼在控制sars-cov-2介导的免疫调节紊乱方面的近期临床结果相一致。80, 89, 103, 104]美国食品药品监督管理局决定批准对住院成人和2岁或以上的儿童患者给予巴力替尼单药治疗[105]，以及与雷莫司韦联合治疗严重新冠肺炎患者。更重要的是，我们证明JAK 1/JAK 2抑制剂不影响与Ⅰ型干扰素抗病毒反应相关的基因，相反，药物治疗与干扰素刺激基因的相对增加有关(图一)。5 E、F)，可能是通过重新规划肺环境中的髓样成分来实现的(如图所示)。5D以及补充信息，如图所示。S5C)。这种信号转换可能是由于STAT 3激活受体上的STAT 1占据空间的活动所致，如IL-6R信号转换为STAT 3缺陷细胞中的主要STAT 1激活所暗示的那样。106, 107]。最后，以shSTAT 3为基础的治疗后，免疫景观、器官病理和恶病质正常化的显著结果(图)。6以及补充信息，如图所示。S6)明确指出STAT 3是翻转表达髓系细胞的主要靶点，并将其定义为CRS过程中最有害的免疫和组织损伤原因。

尽管这些警告与物种特异性图谱有关，但我们的发现揭示了vFLIP小鼠和新冠肺炎患者肺浸润髓系细胞的一些保守遗传特征。事实上，以S 100-家族基因、I型干扰素应答基因(ISG 15/ISG20)和趋化因子表达为特征的中性粒细胞亚群(Ccl 3/CCL 3)，以及表达增殖相关基因信号的巨噬细胞(明基67, TOP2A)在物种间表现出相似性。共有白细胞亚群显示炎症反应相关基因的高表达，并且更容易接受STAT 3治疗。

总之，在本研究中，我们证明了翻转表达的髓系细胞通过刺激STAT 3依赖的信号通路，直接刺激致命炎症状态的关键作用。此外，我们证实了STAT 3目标策略的治疗效果，以减轻不受控制的炎症和急性疾病，这是开发更准确和基于证据的治疗方法以控制CRS疾病以及持续的新冠肺炎大流行危机的严重临床方面的基础。