与人疟疾控制感染和自然获得性免疫相关的免疫分析鉴定了一个共有的IgA前红细胞免疫蛋白组

知识恶性疟原虫构成人肝期免疫蛋白组的抗原对红系前疫苗的研制具有重要意义，但与红细胞期免疫蛋白组相比，分类更具有挑战性。以前的研究恶性疟原虫抗体反应报告IgG，很少有IgA反应。我们评估了在两名对照人类疟疾感染(Chmi)研究中收集的成人血清中的IgG和IgA抗体反应，这两项研究分别是在251名受疟疾感染的马里儿童和1至6岁的疟疾暴露儿童中进行的。恶性疟原虫抗原蛋白芯片两个CHMI组的IgG谱相同，与马里儿童不同。在CHMI小组和部分马里儿童中，IGA的情况很好。我们描述了天真个体和暴露个体的免疫蛋白质组差异，并报告了免疫系统承认的红细胞前蛋白。本研究中检测到的IGA反应扩大了红细胞前抗原的列表，以进一步确定其为潜在的疫苗候选。

尽管作出了控制努力，疟疾仍然是一种影响巨大的传染病。自2000年以来，全球疟疾死亡率下降了约一半，到2018年降至405 000人。1。不幸的是，进步已经停滞，数十亿人生活在地方病传播地区，疾病阻碍了社会和经济福祉。反复接触疟疾自然增强免疫力，预防疾病。2,3,4然而，它并不能防止再感染。5。一种能减轻或预防肝脏阶段感染、血液阶段寄生虫血症和配子体传播的红细胞前疫苗将是消灭疟疾的重要工具。

可以在体外繁殖的血液期寄生虫已经得到了广泛的研究，血液阶段的蛋白质组也有很好的特征；然而，构成人类肝脏红细胞前蛋白组的抗原却更加难以分类。6,7,8,9。此外，前红血球期疟原虫寄生虫的发育是一个瓶颈，在此期间，感染仅限于肝脏，没有症状或传播，因此是疫苗诱导免疫的理想靶点。因此，确定新的红细胞前疫苗靶点是一个优先事项，将有助于疫苗的发展。为了达到这一目的，我们在控制人类疟疾感染(Chmi)后的几天内，在用pcr检测疟原虫血症之前，对人类免疫系统识别的抗原进行了分类。10,11。用这种方法发现的红细胞前抗原不同于自然暴露于血液阶段寄生虫症的个体所识别的血液阶段抗原。疟疾流行区的居民发展自然获得性免疫，包括提高对血液阶段寄生虫的抗体水平，从而干扰血液阶段寄生虫的复制，并降低寄生虫血症水平，以防止个体出现衰弱的症状。12。然而，自然获得性免疫无症状感染者的寄生虫血症足以维持传播。13.

的几个生命周期阶段恶性疟原虫，最致命的物种，发生在人体宿主的不同部位，可在周围循环中检测到抗体。子孢子是侵入肝细胞的寄生虫期，主要包被环子孢子蛋白(CSP)和其他蛋白质。肝细胞侵入后，裂殖子从肝裂殖子释放到外周循环，裂殖子表面蛋白产生抗体反应，包括针对红细胞侵袭机制的抗体。裂殖子随后侵入红细胞内并成熟，其中包括PfEMP 1在内的各种表面抗原由感染红细胞表面的寄生虫表达，促进了内皮细胞的粘附和脑内的固存。14胎盘15,16,17同时也引起抗体反应18,19,20。少数血液阶段的寄生虫进一步分化为配子体细胞，蚊子利用这些细胞完成生命周期；蚊子也会携带针对这些配子细胞的抗体，从而降低免疫力，并可能通过传播增强免疫力。21。在所有情况下，普遍的假设是，在IgM最初由B细胞表达后，同型转换导致IgG主要抗体应答，其观察和声称的功能促进了疾病的预防22.

相反，在血清和粘膜分泌物中发现的IgA不被认为是由恶性疟原虫。分泌型IgA是一种同工二聚体，通常由黏膜部位的抗原引起，其中已知的功能包括抑制病毒传染性、细菌毒素中和和防止细菌与宿主细胞粘附。23。尽管如此，IgA仍能通过肝脏粘膜表面对红细胞前抗原的穿越产生反应，这是对非人类灵长类动物肝脏在全生物体孢子虫疫苗免疫后存在CD 161富集的黏膜相关不变T细胞(Mait)的一种新的解释。24。另外，感染肠道血管屏障的红细胞可能会产生免疫效应，例如诱导具有肠道归巢特性的T细胞。25或者IgA诱导。这些假设支持了以往关于疟疾感染或疫苗接种后IgA抗体诱导的观察。26,27.

在这里，我们报告了一个扩大的前红细胞免疫蛋白组，其中包括IgA反应抗原在急性感染的CHMI志愿者谁是通过蚊子叮咬或静脉注射(Iv)直接接种感染子孢子。我们比较了这两种给药途径的免疫蛋白质组与曾接触过疟疾的马里儿童感染产生的免疫蛋白组。

标本收集

蛋白质微阵列共显示251恶性疟原虫(Pf)代表214个独特的Pf3D7基因的多肽通过三个队列的血清进行了检测(表)1)。蚊虫叮咬28,29在感染后1天、15天和29天采集血液样本；本研究使用32名志愿者的样本。在静脉(IV)CHMI中30在感染后1天、29天和57天采集血液样本；本研究采用22名寄生虫病患者作为研究对象。在第三项研究中，47名1至6岁的马里儿童作为疫苗研究的对照参与者。31在2007年5月开始的疟疾传播季节，对自然获得性感染进行了纵向监测，并为本次研究选择了感染前后的血样。热图和条形图显示了CHMI挑战和自然暴露后的IgG和IgA抗体反应，如图所示。1.

CHMI后IgA免疫蛋白组与自然感染后马里儿童的一个子集

在自然暴露的儿童中，IV和BITCHMI引起IgG抗体对一组非反应性抗原的反应(Grp 1，图1)。1A，b)。同样，自然暴露的儿童产生抗抗原的IgG抗体，而CHMI志愿者的血清对此没有反应(Grp 3，图3)。1A，b)。第三组抗原在CHMI组和自然暴露组中都是反应性的(Grp 2，图1)。1A，b)。IV和BITCHMI诱导抗一系列抗原的抗IgA抗体，这些抗原在自然暴露的儿童中只有弱反应(Grp 2，图1)。1C，d).

建立相关矩阵，比较Spearman相关系数的谱图，分析每个参与者和所有其他参与者的荧光强度值在所有蛋白质中的分布情况。为CHMI队列和IgA(图1)。2A面板1，2，3)和IgG(如图所示。2B第1、2和3)小组分析，大多数参与者与CHMI小组中的其他人高度相关，但与马里儿童无关。然而，对于IgA，来自马里的儿童子集与CHMI参与者相比具有相关性(图一)。2A第4和第5小组)。在随后的分析中，这些儿童被分成两组，即“高IgA相关”组(n=10)和“低IgA相关”(n=37)与成人CHMI组(补充图)。1)。与其他儿童相比，马里儿童的IGA反应几乎没有相关性(图1)。2A第6小组)。就IgG而言，CHMI参与者与马里儿童的抗体谱几乎没有相关性(图1)。2B第4和第5小组)。大多数马里人都有相似的IgG抗体谱，它们之间高度相关(图一)。2B第6小组)。

IGA(a)和IgG(b)三个临床研究的每个感染后样本的荧光强度值分布的配对相关矩阵显示出不同的相关性模式。每个矩阵下面的色条表示关联度；正方形(光到暗红色)的颜色强度与相应的Spearman相关系数的值成正比。根据研究结果对样本进行聚类，并根据图例表中的数字表示每个相关图。马里儿童的样本是按参与者的年龄订购的。CHMI组和马里儿童之间的IGA相关性(在第4和第5面板中比较密集和不那么强烈的行)被用来将马里儿童划分为高度相关的组(n=10)和一个低相关组(n=37)。

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火山图(图)3)在两项CHMI研究中，显示感染后抗体反应显著增加的抗原与基线反应性相比明显增加。蚊虫叮咬CHMI后，抗187抗原的IGA抗体增加(图1)。3A)和91种抗原的IV CHMI后(如图所示)。3B在蚊虫叮咬和IV CHMI之间共有89种IgA反应性抗原。马里儿童的“高度相关”(图一)。2A在第4和第5小组中，66种抗原与基线时的疟疾患者相比，有66种抗原在感染后增强了IgA的反应性(如图4所示)。3C)。PF3D7_0716300(保守的疟原虫蛋白)是两个CHMI群体中最具免疫原性的五种抗原之一。Pf3d7_0935900(环出口蛋白1)是咬伤和高度相关的马里儿童中最具免疫原性的五大抗原之一(补充表)。1)。Pf3D7_7_0206800(裂殖子表面蛋白2)、PF3D7_7_0823300(组蛋白乙酰转移酶GCN5)和PF3D7_1036400(肝期抗原1)是咬合CHMI的前5位免疫原抗原。Pf3D7_7_0714500(转录延伸因子s-Ⅱ，推测)、PF3D_7_0713900(保守疟原虫蛋白)、PF3D7_7_1215900(蛇纹石受体，推测)、PF3D7_0612600(细胞质tRNA_2-硫醇化蛋白1)和PF3D7_1023100(dynein重链，推测)(两个片段)是IV CHMI的前5种免疫原抗原。PF3D7_0826100(E3泛素-蛋白连接酶，推测)、PF3D7_7_0323800和PF3D_7_1018300保守的疟原虫蛋白和PF3D7_1433500(DNA拓扑异构酶2)是马里儿童最主要的5种免疫原抗原。四种抗原结合IgA在低相关马里儿童(图)。三维空间Pf3D7_7_0206800和PF3D_7_0935900在咬合CHMI患者中具有较高的免疫原性，在高度相关的马里儿童中，PF3D_7_7_0935900也具有免疫原性。52种抗原增加了两个CHMI组和高度相关的马里儿童的IgA反应性，而在高相关的马里儿童中，IgA反应性的所有蛋白在一个或两个CHMI组中也是IgA反应性的(补充图)。2)。高度相关的马里儿童和CHMI队列没有一组在数量上具有较高的血清反应性的抗原子集；也就是说，两组儿童的血清对抗原的反应性相似(补充图1)。3B)。咬合CHMI组与IV CHMI组相比，血清反应性相似，但咬合CHMI组IgA血清反应性和对更多抗原的反应性高于IV CHMI组(补充图)。2A和4A).

IgA火山图a–d)和IgG(e–g)比较基线(CHMI时点第1天)信号强度与研究特定感染后第29天叮咬CHMI的信号强度(n=32)(a, e)，IV CHMI(n=22)(b, f)以及马里儿童感染后(n=47)(c, d, g)，马里儿童与CHMI成人之间的高相关性和低相关性(如图所示)。2)。如果抗原通过错误发现率(FDR)和log折叠变化的阈值，则为红色；p“价值”和“折叠变化”都有标记。蓝色虚线上的抗原有Wilcoxon秩和。p < 0.05 after correction using the Benjamini Hochberg procedure. Analysis was done on 193 antigens for IgA and 228 antigens for IgG.

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这三个群体的IgG反应模式也不同。叮咬CHMI后，215种抗原的IgG抗体增加(如图所示)。3E)，以及95种抗原在静脉注射CHMI后(如图所示)。3F)。自然暴露的马里儿童在感染后产生抗132抗原的IgG抗体(见图)。第三代)。在CHMI队列中最具免疫原性的5种抗原中，3种抗原为PF3D7_7_0823300、PF3D7_0906200(保守的疟原虫蛋白)和PF3D7_0714500(转录延伸因子s-Ⅱ)。3E，f；补充表2)。马里儿童IgG的5种最主要的免疫原抗原为PF3D7_0935900、PF3D7_0220000(肝期抗原3)、PF3D7_7_0713900和PF3D7_0801000(疟原虫螺旋间隔亚端粒C亚家族(PHISTc))。第三代；补充表2)。IV、CHMI和马里儿童在5种最常见的免疫原IgG抗原中没有共同抗原。PF3D7_0935900在马里儿童和咬伤型CHMI中均有发现(图1)。3E，g；补充表2)。12种蛋白质在马里儿童中具有独特的反应能力，而在CHMI组中则不然(补充图1)。2B)。马里儿童和CHMI组各有一组蛋白质，其中一组的血清学活性较高，而另一组则不然(补充图)。3C)。与IgA组一样，咬合CHMI组和IV CHMI组在相互比较时也有相似的IgG血清反应性，咬合CHMI组比IV CHMI组具有更高的IgG血清反应性和对抗原的反应性(补充图)。2B和4B).

四种抗原在队列中对IgA和IgG均具有高度的免疫原性(补充表)1和2)：马里儿童对PF3D7_0935900(环出口蛋白1)的反应性显著提高，IV CHMI参与者对PF3D7_0714500(假定转录延伸因子s-Ⅱ)反应强烈，咬伤CHMI参与者对PF3D7_0823300(组蛋白乙酰转移酶GCN5)和PF3D7_0935900反应强烈。在叮咬CHMI队列中引起免疫反应的220种抗原中，182种(83%)诱导IgA和IgG的反应性。对于咬伤型CHMI，只有5种和33种抗原对IgA和IgG具有独特的免疫原性(附图)。5A)。IV CHMI参与者有27种独特的IgA反应抗原，31种是IgG反应抗原，64种是IgA和IgG的反应性抗原(附图)。5B)。在马里儿童中，高相关组中有36种IgA反应性抗原对IgG也有反应性。(补充图。5C).

IGA和IgG血清效价在各研究组之间存在差异

在感染后时间点，至少10%的参与者在至少一个队列中有193和228种抗原结合IgA和IgG(补充表)。3)。每个队列中血清效价<10%的蛋白质被排除在进一步的分析之外。总体而言，在两个CHMI队列中，单个蛋白的IgA血清效价基本相似，只有7种抗原(阵列上的抗原占2.7%)，应答者所占比例明显不同。相反，这两个CHMI队列都有更多的抗原(143个用于咬伤CHMI，64个用于IV CHMI)，其IgA血清阳性率明显高于马里儿童(图一)。4A，c)。将马里儿童分为三个年龄组，3至4岁儿童的血清抗体阳性率分别高于1至2岁儿童和5至6岁儿童(图一至四岁)。4B，f)。对于IgG，5至6岁的儿童分别有10种和2种抗原，其血清阳性率分别高于1至2岁和3至4岁的儿童(图1至4岁)。4E，f).

蛋白质被分类和显示，在右边有最大的总体血清效价。咬伤CHMI、父母CHMI和马里儿童IgA的血清学阳性率(a)和IgG(d)。马里儿童3个年龄层血清IgA(b)和IgG(e)。表中显示了有应答者比例的抗原的数量，两组之间有显着性差异，如193份IgA抗原和228份IgG抗原(c, f)，使用两个比例z用Yates连续性修正测试p数值调整使用本雅明-霍奇伯格程序。数据来自马里儿童感染后的时间点和CHMI研究的第29天。

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每个人识别的蛋白质数量(宽度评分)在感染后所有研究组的IgG、CHMI组和马里儿童的一个子集中的IgA增加

参与CHMI研究(与感染前相比，29天相比)和疟疾后的马里儿童，IgG(宽度评分)识别的蛋白质数量都增加了(如图所示)。5E-g)。咬伤CHMI的早期时间点(第15天)的宽度分数介于第1天和第29天之间(咬伤CHMI第1天、第15天和第29天的呼吸中位数得分分别为11、18和75；Kruskal Wallis)。p=1.9×10−5)。第29天和第57天的宽度得分相似(第1、29和57天的平均宽度分别为12、40和33；第1天和第29天的宽度分数分别为12、40和33)。p=0.0021)。对于IgA，CHMI组和与接受CHMI治疗的成人相关的马里儿童在感染后的宽度分数增加，而与CHMI成人相关性较低的马里儿童则不然(图1)。5A-d)。总的来说，所有研究小组的反应都是异质性的，每组中的一些人的反应显著增加，而另一些人的宽度分数没有变化。咬合CHMI组IgG和IgA的宽度评分在比较不同蚊虫叮咬次数(1、3或5次叮咬)时差异无统计学意义，但样本量较小(数据未显示)。在IV CHMI研究中，低剂量组在基线和感染后的宽度评分相似(Kruskal Wallis p=0.51、IgA和p=0.14，IgG)(附图6)。虽然高剂量IV CHMI组的IgA宽度评分高于低剂量组，但结果没有统计学意义(KruskalWallis)p=0.088，IgA)(附图。6A)。IgG高剂量组感染后宽度评分显著升高(P<0.01)。Kruskal Wallis p=0.011)(附图。6B)。在比较NF54CHMI和7G8 CHMI时，宽度分数没有统计学上的差异，尽管样本规模很小(数据未显示)。

咬合CHMI患者IgA和IgG宽度评分的比较(英文)a, e)，IV CHMI(b, f)和马里儿童(c, d, g, h)，随着时间的推移，IgG和IgA在CHMI后的宽度评分都会增加。感染后马里儿童IgG升高(g)，抗体反应与CHMI成人相关性最高的马里儿童，感染后IgA升高(n=9，c)但对其余的马里儿童来说，他们的抗体反应与CHMI成人之间的相关性很低(n=38，d)。按年龄分层的马里儿童IgG宽度评分(h)年龄最小阶层的宽度得分增加幅度最大。两组试验采用Wilcoxon符号秩检验，>2组采用Kruskal-Wallis检验与修正的Dunn‘s检验进行比较。p价值。

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马里儿童IgG反应与年龄和感染后时间的关系

IgG宽度评分在感染后和感染前均有提高(图一)。5G，h)。IGA宽度评分与年龄或感染后抽血天数无关(图一)。6a，b)。IgG宽度与年龄呈正相关(Spearman R)2=0.13，p=0.012，图1。6C从1~6岁开始，每1~6岁，IgG宽度评分增加9种抗原。IgG的宽度评分与疾病与抽血的间隔呈负相关，因此在患病后的每一天，宽度评分都会减少两种抗原(Spearman R)。2=0.33，p=0.000024，图1。6d)，提示短抗体半衰期。在观察聚合反应性时，也可以看到类似的相关性，其定义为每个个体的所有同型特异性荧光强度(FI)之和(补充图)。7).

数量变化之间的关系恶性疟原虫每个人的IgA和IgG识别的蛋白质(宽度评分)和感染后抽血时的年龄(a, c)和感染后的几天(b, d)为马里儿童。

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这项研究比较了以前接触过疟疾的儿童的抗体反应和通过两种途径(蚊子叮咬和IV)首次接触疟疾的成年志愿者的抗体反应。我们发现马里儿童自然感染后的血清学特征与疟疾成人对CHMI的反应不同。马里儿童的IgA抗体流行率降低，IgG抗体的抗原特异性和宽度也有所变化。这些发现与先前发表的结果一致；健康的成年志愿者在同时接受氯喹的同时接受了CHMI，他们产生了针对不同人群的IgG应答。恶性疟原虫在半免疫肯尼亚成年人中，蛋白质比IgG反应所识别的蛋白质更多。11。儿童感染后抽血的IgG反应随年龄的增加而增加，感染后的IgG反应随感染天数的增加而减少，均显示出儿童IgG抗体反应的预期动力学。32,33.

与咬合CHMI研究相比，IV CHMI研究中IgA和IgG反应较低(补充图)。4)。超敏感PCR用于检测寄生虫血症在IV CHMI研究中检测寄生虫血症比血液涂片在咬合CHMI研究中要早1~3天。由于感染的早期发现，IV CHMI研究中所见的低反应可能是由于早期治疗缩短了对寄生虫抗原的暴露。马里儿童较低的IgA血清反应性可能反映了他们新生的免疫系统，暴露于多样而不是单一的环境中。恶性疟原虫导致抗体产生抑制的因素34。值得注意的是，在比较马里儿童对CHMI反应的反应时，我们观察到CHMI诱发的IgA抗原的宽度比自然感染后马里儿童的血清反应性强。疟疾患者感染后IgA的产生是一个有趣的观察，有几种可能的解释，这将在计划的未来实验中探索，包括检测IgA抗体在多大程度上抑制肝细胞和/或红细胞的侵袭。

疟疾感染后观察到IgA的一个可能的解释是粘膜免疫可能是一个重要的，但直到最近还未被承认的免疫反应的组成部分。恶性疟原虫疟疾。在辐射衰减的研究中恶性疟原虫坦桑尼亚成人孢子虫疫苗(PfSPZ疫苗)35和非人类灵长类肝细胞24免疫后观察黏膜相关不变T细胞(MAIT)。MAIT细胞是先天免疫反应的组成部分，在粘膜部位富集，并在体外模型中被观察到能刺激IgA、IgG和IgM的产生。36。另一项研究表明，在疟疾感染的红细胞前阶段，宿主肝细胞内的信号转导和炎症改变会导致人跨膜粘蛋白MUC 13的上调。37。MAIT细胞的存在和黏液蛋白的上调都表明黏膜免疫在对恶性疟原虫感染，可能是在红细胞前抗原穿过肝粘膜表面引起粘膜免疫反应时引起的，包括IgA。另外，在疟疾血液感染期间，γδT细胞通过结肠粘膜迁移，随后诱发IgA应答。38,39。另一方面，在没有粘膜微生物刺激的无菌小鼠和肠道归巢信号有缺陷的小鼠身上进行的研究表明，血清IgA的产生与粘膜IgA的产生是分离的。40,41,42.

我们的数据与最近的一份实验报告一致。巴贝西亚一种红细胞病原体，引起红细胞变形和溶解，脾肿大，脾细胞数增加，以及IgA和IgG抗体滴度在数周内短暂增加。43。在人类中，疟疾与脾肿大有关，脾的主要功能是回收老化和受损的红细胞，包括含有寄生虫的红细胞。44。尽管寄生虫介导的脾脏结构改变和由此产生的免疫调节，脾脏仍会产生一种免疫反应，包括从脾浆细胞产生抗体。45。在人类中，新的类转换型IgA循环转录本在脾脏和肠粘膜部位及淋巴滤泡中同样丰富，这表明脾脏可能是血清中主要单链Iga 1的主要来源。46。在小鼠体内，最近的一项综述认为腹膜中的“先天”B1 B细胞和脾边缘区B细胞都能促进IgA的产生。42。因此，我们的数据表明，新产生的IgA阳性浆细胞和浆细胞(可能在感染患者的脾脏、肝脏、胃肠道和/或腹膜中)的短暂升高可能导致了我们研究人群中所见的短暂IgA滴度。

只有在接触疟疾的儿童中观察到的IgA反应的一个可能的解释可能包括儿童的免疫调节失调。长期接触疟疾会导致抗体应答减弱。34,47。骨髓感染削弱了B细胞反应的能力，包括B记忆细胞的减少48这最终会降低IgA的产生。在一种小鼠模型中，血液阶段感染可以抑制抗环子孢子蛋白(一种高免疫原性的红细胞前抗原)抗体的产生。49。在本芯片研究中，IgA和IgG的检测方法排除了IgA与IgG的定量比较，即用不同的荧光载体检测每个亚型，荧光强度而不是抗体量。因此，慢性感染背景下的免疫失调可能更容易被检测为弱IgA水平，而不是减弱的IgG水平。

天真的成人与接触疟疾的儿童的IgA反应差异可以通过班级转换重组的时间依赖性变化来替代或另外解释。在一种人类登革热病毒攻击模型中，意外地观察到了继原发性而非随后的登革热感染后出现的类转换型IgA浆细胞。50。同样，对于疟疾感染，第一次接触寄生虫可能引起IgA反应；在随后接触时，可能会出现IgG显性反应。对于登革热和疟疾，控制的人类感染模型允许研究一个天真宿主的第一次感染。即使是最年轻的马里儿童也可能在婴儿时第一次接触，同时受到母亲抗体的保护；因此，在这一马里儿童群体中可能没有观察到“第一次感染”，也可能解释了较低的IgA反应。33,34。以前，恶性疟原虫在接受叮咬-chmi治疗的疟疾患者血清中发现了特异性IgA，而在半免疫肯尼亚成人中则没有发现特异性IgA。51。在肯尼亚成人血清中可能不存在iga，因为IgA可能有短暂的半衰期，或者是因为IgA是在第一次或早期之后才产生的。恶性疟原虫感染。同时，IgA水平在少于5例疟疾感染的人群中更高。26.

感染后IgA反应的一部分马里儿童与成年CHMI参与者相关，尤其是抗体反应高于可检测水平的儿童(图一)。2A，补充图。1)。相比之下，马里儿童与CHMI参与者的IgG反应相关性较低。这一观察表明，当考虑实际引起IgA反应的感染时，马里儿童和成年CHMI参与者有相似的IgA免疫蛋白组。相反，相同的两组有不同的IgG免疫蛋白组。IgG免疫蛋白组代表成年CHMI患者对红细胞前抗原的抗体反应，对马里儿童红细胞前和血液期抗原的反应，而共用IgA免疫蛋白组可能仅代表对红细胞前抗原的抗体反应。如果IgA发育的假定位点包括肝脏、脾脏、结肠和全身循环，那么可能通过对共同IgA免疫蛋白组的观察，提示IgA抗体反应发生在肝脏的部位。

虽然所有的样品都是用3D7菌株的蛋白质阵列来探测的，但两者的一个重要区别是寄生虫的侵染。BITCHMI研究使用的是NF54，这是3D7克隆的亲本株，几乎在基因上是相同的。52。在第四次CHMI研究中，志愿者收到了NF54或7G8，这是一种巴西菌株，由于其与NF54的遗传距离而被有意选择。自然获得的疟疾感染来自不同的寄生虫，而不是特定的毒株。因此，在感染非NF54菌株的人群中，检测到的抗体反应可能较低。然而，在IV CHMI研究中，当NF54的血清学反应(n=5)和7 8(n(17)比较两组患者的宽度评分和血清学活性，但样本量较小，但差异无显着性(P>0.05)。因此，由于保守的免疫优势表位可诱导较高的抗体结合，所以很可能在整个蛋白芯片上很难看到菌株特异性的体液免疫应答。53。肽微阵列可以更好地识别菌株特异性抗体反应.

通过CHMI感染疟疾与自然感染的另一个重要区别是孢子的剂量。3200剂恶性疟原虫孢子虫(PfSPZ)或五种传染性蚊虫叮咬是CHMI的标准；然而，这些剂量可能高于任何一种自然感染所经历的剂量。此外，与传统饲养的蚊子相比，使用无菌饲养的蚊子的叮咬会增加唾液腺PfSPZ的数量，这可能会增加对孢子的攻击剂量。然而，对于最初的无菌性蚊虫叮咬CHMI研究，虽然在疟疾诊断时将叮咬次数与寄生虫密度进行比较时出现了剂量反应的趋势。28在本研究中，当将叮咬次数与IgA或IgG反应进行比较时，我们没有观察到剂量反应，提示子孢子剂量可能并不能解释CHMI与自然感染相比抗体反应增加的原因。

本研究具有重要意义，因为它比较了蚊虫叮咬引起的疟疾感染的抗体反应谱与无菌、纯化、冷冻保存的PfSPZ直接静脉接种(PfSPZ挑战)的应用，显示了相似和不同之处。静脉注射PfSPZ挑战是一种在世界范围内开展CHMI研究的实用方法。蚊子叮咬挑战，需要昆虫传播传染性蚊子，只有在世界各地的少数机构提供。从这些数据的深入分析中获得的知识对于解释CHMI的研究结果将是有价值的。这一能力对于疟疾疫苗研究人员和更大的疫苗研究界将是非常重要的。

这项工作与疟疾疫苗研究和开发的相关性是扩大了前红细胞抗原的清单，免疫系统在感染后早期就认识到这一点，并且是一种多抗原前红血球疫苗的候选疫苗。针对这些目标抗原的疫苗可能会诱导无菌保护性免疫，并防止疟疾传播。