衣康酸通过促进戊糖磷酸途径产生活性氧而发挥抗炎和抗菌作用

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发表时间：2021-09-14 11:21作者：武汉新启迪Xinqidibio

摘要

衣康酸由免疫应答基因1(IRG 1)活化巨噬细胞中编码的酶，已知在代谢和免疫中起重要作用。本研究采用分子生物学和免疫学方法，对衣康酸作为抗炎代谢物的作用机理进行了研究。IRG 1-NULL(用CRISPR制备)和野生型巨噬细胞。实验结果表明，衣康酸对戊糖磷酸途径(PPP)有显著的促进作用，从而提高了NADPH氧化酶活性，增加了活性氧(ROS)的产生。ROS的产生增加了抗炎基因A20的表达，进而降低了炎症细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的产生。NF-κB能上调A20的表达，在控制中起着至关重要的作用。IRG 1衣康酸参与LPS刺激的巨噬细胞的免疫调节反应。此外，衣康酸还抑制了.鼠伤寒沙门氏菌通过增加NADPH氧化酶的ROS生成和孵化日本血吸虫体外卵子。总之，本研究揭示了衣康酸作为抗炎代谢物的另一种机制，并证实了衣康酸通过ROS抑制细菌致病菌的作用。这些发现为衣康酸在抗炎和相关病原体控制中的生物应用提供了基础知识。

导言

衣康酸是一种重要的哺乳动物代谢物，它介导感染、免疫和代谢之间的相互作用。它是由免疫应答基因1(IRG 1)编码酶，催化顺式-感染或促炎条件下活化巨噬细胞中的乌头酸1,2,3,4。在感染BALB/c小鼠的脾脏中发现了衣康酸的增加。鼠伤寒沙门氏菌5。这个日本血吸虫两种方法共感染小鼠的虫卵负担日本血吸虫和[医]斑疹伤寒菌显著降低，而衣康酸水平升高的原因是[医]斑疹伤寒菌混合感染可能起着重要的作用。6。在其他细菌感染研究中，已发现靶器官或组织中衣康酸含量增加。7,8。衣康酸通过抑制异柠檬酸裂解酶具有抗菌作用，异柠檬酸裂解酶是体内细菌生长的重要途径(乙氧基化物分流)的关键酶。9,10。衣康酸还可以通过调节活性氧(ROS)的产生来抑制细菌和病毒感染。11,12，被认为属于某些抗生素的功能。13.

衣康酸的抗炎作用已在体外和体内通过多项研究中提出的机制得到了证实。14,15,16,17,18。摘要活性氧在衣康酸的抗炎机制中起着重要作用。15,16，其中ROS被证明是由氧化磷酸化(OXPHOS)介导的脂肪酸氧化生成的。11,16,19,20。内源性衣康酸可引起脂多糖激活小鼠巨噬细胞线粒体底物水平磷酸化的消除21。衣康酸可抑制琥珀酸脱氢酶，从而改变三羧酸循环(TCA)，调节细胞内琥珀酸水平。14,22。衣康酸也可以类似苯丙酮酸，通过降低果糖2，6-二磷酸(F26 Bp)水平来抑制糖酵解。23。因此，在研究衣康酸抗炎作用的机制时，糖酵解、tca环和oxphos已成为人们关注的焦点。19,20,24。摘要戊糖磷酸途径(PPP)是与糖酵解平行的另一种葡萄糖代谢途径。25。PPP生成合成核苷酸和NADPH的戊糖前体，由NADPH氧化酶催化生成超氧物和其他活性氧。26,27.

在目前的研究中，探索了与购买力平价有关的衣康酸抗炎作用的另一种机制。IRG 1用CRISPR-Cas9技术敲除单核/巨噬细胞样细胞系RAW264.7IRG 1-空巨噬细胞28、分子生物学和免疫研究方法。IRG 1利用这种细胞模型通过PPP途径调节巨噬细胞对相关刺激的反应。实验结果表明，衣康酸能促进戊糖磷酸途径产生更多的NADPH，NADPH氧化酶可以产生更多的ROS。ROS还能诱导A20基因的表达。TNFAIP 3肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3)，并参与了RAW 264.7的抗炎作用。显著升高的活性氧水平抑制[医]斑疹伤寒菌在RAW264.7中，也可能是低孵化率的原因之一。日本血吸虫含有衣康酸的鸡蛋。本研究为衣康酸抗炎作用的新机制提供了新的认识。IRG 1为衣康酸的抗炎作用提供了新的线索。

结果

RAW264.7-IRG1KO单细胞的筛选

IRG 1是负责产生衣康酸的基因。为了评价衣康酸的功能，采用crispr-cas 9删除了IRG 1基因在RAW264.7细胞中的表达用Cruiser酶试剂盒对20个普罗霉素阳性单细胞克隆进行鉴定。凝胶电泳显示单细胞克隆(RAN 2、4、7、11)具有所需的碱基突变(补充信息：图2)。沙一)。为了进一步确认成功淘汰IRG 1用核磁共振波谱仪测定细胞和细胞培养液中衣康酸的含量。无论是否用脂多糖(LPS，10 ng/mL)处理，敲除细胞及其废培养基中均未观察到衣康酸。然而，野生型RAW264.7能在LPS刺激或不刺激下产生衣康酸，而LPS处理则能产生更多的衣康酸(补充资料：图)。S2)。这一观察进一步证实，成功地删除了IRG 1基因。这个IRG 1被敲除的细胞系命名为RAW264.7-IRG1KO。

内源性衣康酸抑制LPS诱导的炎性细胞因子

IL-1β、IL-6和TNF-α是活化巨噬细胞产生的重要促炎细胞因子.本研究用LPS诱导培养24h后，野生型RAW264.7和RAW264.7-IRG1KO细胞培养液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明显高于对照组(见图)。1(a-C)有趣的是，免疫反应IRG 1与野生型RAW264.7细胞相比，LPS处理的空细胞更为明显。1表明内源性衣康酸有抑制LPS诱导的炎性细胞因子的作用.

衣康酸促进活性氧的产生，而活性氧在减少LPS诱导的炎症反应中起着重要作用。

细胞内总活性氧水平2O2在细胞培养液中测定了LPS或衣康酸作用24h后细胞裂解液中谷胱甘肽(GSH)的含量。2O2在LPS或衣康酸作用下，RAW264.7细胞的产量明显高于相应的未处理对照组(如图所示)。2一个,B)。而RAW264.7-IRG1KO细胞产生的H水平显著升高。2O2只有与衣康酸共同孵育，LPS处理RAW264.7-IRG1KO细胞后，才能产生明显的H水平升高。2O2(无花果)2b)。这些观察表明，内源和外源衣康酸都促进了活性氧的产生，而IRG 1缺失可以减少ROS的产生。对于RAW264.7-IRG1KO细胞，衣康酸处理的GSH水平也低于未处理的对照细胞，证实衣康酸促进了ROS的产生。2c)。然而，在LPS处理的RAW264.7-IRG1KO细胞中也观察到GSH的缺失。2c)。IRG 1通过活性氧促进巨噬细胞内毒素耐受16。因此，ROS清道夫N用脂多糖处理RAW264.7和RAW264.7-IRG1KO时，加入乙酰-L-半胱氨酸(NAC，2.5mm)，结果表明IL-1β、IL-6和TNF-α水平无明显变化。2(d-F)提示ROS清除剂能降低LPS诱导的野生型和RAW 264.7-IRG1KO细胞的炎症细胞因子，消除LPS作用下野生型细胞与RAW264.7-IRG1KO细胞的免疫应答差异。因此，敲出IRG 1与野生型RAW264.7细胞相比，降低小鼠巨噬细胞RAW264.7中ROS的产生，并使LPS治疗后产生更明显的促炎细胞因子(图1)。1(a-C)

衣康酸促进戊糖磷酸途径(PPP)和NADPH氧化酶活性的研究

众所周知，ppp途径的第一步是氧化阶段，其中NADPH生成并可用于产生ros。29。因此，我们推测LPS处理的野生型RAW264.7细胞(与LPS处理的RAW264.7-IRG1KO细胞相比)可能通过PPP途径产生更高的ROS。为了验证这一假设，研究了两个关键基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)的表达水平。H6PD)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(PGD)在此途径被测试。的表达水平H6PD和PGD与对照组相比，LPS作用24h后，野生型RAW264.7细胞的表达明显增加(图1)。3一个,B)。然而，对于同样的LPS处理的RAW264.7-IRG1KO细胞则没有进行这种观察，因为在RW264.7-IRG1KO细胞的表达水平上没有变化。H6PD和PGD对RAW 264.7-IRG1KO细胞进行了观察。3一个,B)。有趣的是，外源衣康酸也能上调H6PD和PGD野生型和RAW264.7-IRG1KO细胞。3一个,B)，进一步证实衣康酸刺激PPP途径。基因(NOX 2以NADPH为底物催化ROS的产生，检测NADPH氧化酶的表达水平。但是，NOX 2同时检测LPS和衣康酸处理的RAW 264.7和RAW264.7-IRG1KO细胞的表达。3c)。检测不同处理细胞NADPH氧化酶的酶活性，LPS和衣康酸处理均能提高RAW264.7细胞NADPH氧化酶的活性。3(D)只有外源衣康酸能促进NADPH氧化酶的活性。IRG 1-空细胞(图1.3d)。总之，这些结果表明衣康酸促进PPP途径，上调NADPH氧化酶产生ROS。在不含衣康酸的情况下，这些作用减弱。

LPS和衣康酸促进巨噬细胞活性氧的表达，增强NF-κB通路调控的基因A20的表达。

基因A20(TNFAIP 3，肿瘤坏死因子α诱导的蛋白3)已被证明是抑制内毒素和肿瘤坏死因子α引起的NF-κB反应所致炎症的关键。30,31。Ros上调了a20的表达。15,16。因此，在LPS或衣康酸处理的野生型RAW 264.7和RAW264.7-IRG1KO细胞中，观察了A20的表达。LPS和衣康酸均能诱导细胞株A20的高表达，而在内源性衣康酸的存在下，A20的表达水平较高(图一)。4a)。这种影响被消除了。N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)处理，一种能够去除活性氧的抗氧化剂，它独立于IRG 1规例(图1.4b)。NF-κB信号通路被认为是一种非常重要的“快速反应”促炎途径。32,33。因此，采用NF-κB抑制剂Bay11-7082检测NF-κB在本研究中的作用。结果表明，抑制NF-κB可消除A20对LPS和衣康酸的应答(补充信息：图)。S3a)。此外，当NF-κB被Bay11-7082抑制时，野生型RAW264.7细胞和RAW264.7-IRG1KO细胞经LPS和衣康酸处理后，IL-1β、IL-6和TNF-α水平基本不变(补充信息：图2)。S3(b-D)这些观察证实，NF-κB可以上调A20，在促进和抗炎反应中起着至关重要的作用。IRG 1或衣康酸参与LPS刺激的巨噬细胞。

内源和外源衣康酸均能抑制[医]斑疹伤寒菌巨噬细胞复制

巨噬细胞在控制感染的天然免疫反应中起着重要作用。34。删除IRG 1降低了RAW 264.7产生衣康酸的能力，随后这些细胞无法抑制[医]斑疹伤寒菌(无花果)5a)。然而，这种能力是通过外源添加衣康酸来恢复的；外源衣康酸似乎提高了野生型RAW 264.7的清除能力。[医]斑疹伤寒菌进一步(图1.5a)。与这一发现一致，ROS水平由IRG 1-空细胞明显减少，添加外源性衣康酸可以治疗部分这种效应(图一)。5B，C)。此外，NAC去除活性氧对这些细胞的清除能力也有影响。[医]斑疹伤寒菌进一步评估。5D，E)。结果表明，与NAC共同孵育这些细胞，可降低ROS，降低细胞的清除能力。[医]斑疹伤寒菌(无花果)5D，E).

衣康酸抑制日本血吸虫蛋

在此之前，我们已经证明了两种方法对小鼠的共同感染。日本血吸虫和[医]斑疹伤寒菌可以大大减少日本血吸虫虫卵负担6。同时，我们还发现了共同感染小鼠脾脏和肝脏中衣康酸含量的增加。5,6。衣康酸日本血吸虫卵，成熟的日本血吸虫5周后BALB/c小鼠肝脏的卵子日本血吸虫收集感染标本，用不同浓度的衣康酸处理。结果表明，即使在很低的浓度下，衣康酸也完全抑制了其孵化。日本血吸虫鸡蛋(补充资料：图。S4).

讨论

衣康酸抑制异柠檬酸裂解酶的抗菌作用9长期以来一直被认为不是由哺乳动物细胞产生的。7。然而，由于发现衣康酸可以由LPS激活的巨噬细胞中的免疫应答基因1编码蛋白产生，这一观点被颠覆了。2,3。此外，活性氧在衣康酸的抗炎中起着重要的作用。15,16。近年来，衣康酸的抗炎机理主要通过两种途径提出：IκBζ-atf 3炎症轴受衣康酸及其衍生物亲电特性的调节。17，或者通过Keap的烷基化激活Nrf 2。18。这些研究表明衣康酸可能是一种潜在的抗炎药物。35,36。在目前的研究中，衣康酸/衣康酸的作用机理。IRG 1通过调节戊糖磷酸途径产生活性氧(ROS)，评价其抗炎和抗细菌活性。

作为调查的第一步，IRG 1-NULL(RAW 264.7-IRG1KO)细胞系是通过CRISPR-Cas9删除生成的。IRG 1来自巨噬细胞RAW 264.7的基因。成功击倒IRG 1基因在DNA中是明显的，进一步表现为缺乏衣康酸的内源性生产(补充信息：图4)。沙一和S2)。在不含衣康酸的情况下，RAW 264.7-IRG1KO细胞有明显的炎症反应，如IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高。1)。观察到的衣康酸抗炎作用与其他组先前的研究结果一致。37,38。免疫应答基因1已被证明与ros的产生有关。11,12,20因此，ROS在衣康酸抗炎作用中的作用在本研究中得到了验证。细胞内活性氧的测定结果2O2在细胞培养液中和细胞裂解液中的GSH证实了内源性衣康酸的存在与ROS水平的显著升高和GSH水平的降低有关。2(a-C)此外，当细胞中的活性氧被抗氧化剂清除时，N-乙酰-L-半胱氨酸治疗，衣康酸的抗炎作用在巨噬细胞中减弱。2表明衣康酸的抗炎作用可能是由ROS介导的.此外，外源添加衣康酸可促进活性氧的产生。2一个,B)。上述结果证实了衣康酸的抗炎作用是通过促进ros的产生来实现的，这与以往报道的ros作为信号分子的作用是一致的。39具有抗菌活性40,41,42.

为了确定过量活性氧产生的途径，对戊糖磷酸途径(PPP)中的关键酶进行了研究，结果表明购买力平价受到衣康酸的刺激。由于NADPH是PPP的中间代谢物，可被NADPH氧化酶用作产生ROS的底物，因此随后对NOX 2和NADPH氧化酶的表达水平进行了评价。结果表明，外源衣康酸和内源衣康酸均能促进PPP途径和NADPH氧化酶的活性。3一个,B, D)。泛素编辑酶a20已经被证明可以调节免疫反应，包括IRG 116,43。随后评估了A20在衣康酸相关抗炎作用中的作用。实验结果表明，外源性和外源性衣康酸均能上调A20的表达，而抗氧化剂NAC可以消除这种上调作用。4)。此外，Bay11-7082对NF-κB的抑制也能消除衣康酸对A 20的上调，同时消除衣康酸的抗炎作用(补充信息：图1)。S3).

本实验结果表明，衣康酸通过PPP途径促进ROS的产生，而A20通过NF-κB途径调控其抗炎作用(补充信息：图5)。S3)。衣康酸诱导的活性氧水平升高在抑制细胞生长中起重要作用。[医]斑疹伤寒菌在牢房里(见图。5)。此外，衣康酸还具有抑制寄生生长的作用，其表现为抑制孵化。日本血吸虫卵子在体外，即使在很低的浓度(补充资料：图。S4)。这些发现为我们以前的工作提供了一个理论基础，显示出与之共同感染的小鼠体内血吸虫和卵子负担的减少。日本血吸虫和[医]斑疹伤寒菌，同时在共感染小鼠身上发现了衣康酸的存在。6.

衣康酸是一种研究较少的小代谢物，在免疫和代谢调节方面发挥着重要作用。衣康酸的产生受基因控制。IRG 1。这个IRG 1本研究采用空巨噬细胞模型RAW 264.7-IRG1KO和野生型巨噬细胞RAW 264.7，探讨了衣康酸抗炎作用的机制。衣康酸通过刺激PPP途径促进ROS的产生。细胞内活性氧具有清除细胞内细菌的能力，并能通过NF-κB途径诱导抗炎基因A20的表达，影响巨噬细胞因子的分泌，进而在体内发挥抗炎作用(图1)。6)。此外，衣康酸具有抗寄生作用。我们的研究揭示了衣康酸抗炎作用的另一种机制，在这一机制中，涉及活性氧生成的代谢途径PPP起着必要的作用。