CTX 预 /CD4 岗 提高ACT疗效 评价CTX的动力学和范围 预 -诱发淋巴衰竭，通常包括在ACT方案中。 16 我们用不同剂量的CTX处理C57BL/6小鼠。淋巴组织淋巴减少的严重程度和持续时间与CTX剂量相关(图)。 1A 和补充图。 1A，b )。在此基础上，我们设计了一种利用ctx的方案。 预 、前T细胞和CD4 岗 ，一种协同提高ACT疗效的组合(如图所示)。 1B )。B16-F10攻击后3天，C57BL/6小鼠连续接受ctx，体外启动pmel-1细胞(黑色素瘤特异性T细胞受体(Tcr)-转基因CD8)。 + T细胞)和白细胞介素-2(IL-2)。在ACT模型中，PMEL-1细胞在体外被激活和培养2天后，作为过继转移的前T细胞。抗CD4的暂时性治疗(持续5周)在ctx后7天开始。 预 ，当诱导的淋巴管减少开始恢复时(见图)。 1A 和补充图。 1A，b )。CTX 预 /CD4 岗 显著提高肿瘤抑制和前T细胞转移小鼠的存活率。 1C，d )。缺乏前T细胞或CD4 岗 (CTX/抗CD4或CTX/ex-T组)降低了治疗效果。值得注意的是，虽然在其他组中没有观察到，但在CTX存在的情况下接受ACT治疗的组 预 /CD4 岗 (ctx/ex-T/抗-cd4组)发展为白癜风，是CD8的一个征象。 + T细胞诱导的黑素细胞破坏 6 ,7 ，表明CD8的应答增加。 + T细胞(图1. 1E，f )。值得注意的是，10只小鼠中有5只显示出完全抑制黑色素瘤的发展，而在其他各组中则没有观察到。 1F )。这些结果表明CTX具有很强的治疗潜力。 预 /ACT/CD4 岗 黑色素瘤联合治疗。
图1：抗CD4后调节增强过继性T细胞治疗中的抗黑色素瘤反应. 过继性T细胞治疗C57BL/6小鼠的疗效评价。 a 环磷酰胺(CTX)治疗C57BL/6小鼠腹股沟淋巴结(左)和脾(右)细胞计数。小鼠腹腔注射指示剂量(mg/kg)的CTX。 n =每点3只老鼠。误差条表示均值±SD。 b 实验原理图。注入细胞数：B16-F10，2×10 5 /小鼠；体内外处理-启动Thy1.1 + PMEL-1CD8 + T(ex-T)细胞，2×10 6 /鼠标。在T细胞移植前两天，用300 mg/kg的CTX预处理小鼠.第10天起，每周用抗CD4抗体治疗小鼠5周。 c 肿瘤生长曲线显示。每条曲线表示单个老鼠的纵向变化。†表示单个老鼠在指定的时间点死亡。图中显示了活到第80天的老鼠的数量。d 采用两尾对数秩(Mantel&Cox)检验，统计显着性。 e 有白癜风和无白癜风小鼠的典型图像。 f 第80天白癜风无肿瘤征象的小鼠数。 c –f n =10只小鼠/组。αCD4，抗CD4抗体.源数据作为源数据文件提供。
CTX 预 /CD4 岗 促进CD8的分化和增殖 + T细胞 我们研究了CTX的作用。 预 /CD4 岗 论CD8 + T细胞群，随着CD8的增加 + 白癜风小鼠的T细胞活性(图一)。 1E，f )与增强的抗肿瘤反应密切相关。两种不同的CD8 + 分别分析体外T细胞(体外启动的肿瘤反应细胞)和en-T细胞(多克隆内源性细胞)。
首先，我们检查了淋巴组织细胞的表型特征。 2A )。CTX 预 /CD4 岗 -经验丰富的Ex-T细胞和EN-T细胞表现出较高频率的4-1BB-和CD 69-表达细胞(如图所示). 2B 和补充图。 2A，b )，表明TCR介导的激活增加。前T细胞在两种方案的记忆状态上没有任何显着性差异(图一)。 2C 和补充图。 2C )。体外启动诱导大多数前T细胞分化为CD 44 + CD62L − 效应器记忆子集与条件疗法无关。相比之下，有相对较高比例的CD 44的en-T细胞。 − CD62L + 朴素子集(>25%)，在CTX下表现为加速分化。 预 /CD4 岗 与CTX相比 预 条件。我们还检测了代表抑制性受体的表达水平，以及重复抗原刺激CD8的指标。 + T细胞 17 ,18 。如在记忆相关标记中所观察到的那样(见图)。 2C 两组前T细胞表达谱相似(图1)。 二维空间 和补充图。 二维空间 )。相比之下，在ctx作用下，en-T细胞显著上调pd-1、TIGIT和LAG 3的水平。 预 /CD4 岗 与CTX相比 预 这意味着淋巴组织中激活信号的增加。
图2：抗CD4后处理促进体内外启动和内源性CD8的增殖和分化。 + T细胞 a 实验原理图。注入细胞数：B16-F10，2×10 5 /小鼠；体内外启动Thy1.1 + PMEL-1CD8 + T(ex-T)细胞，2×10 6 /鼠标。 b –d 前T细胞和内源性CD8的标记表达及子集分析 + T(en-T)细胞。 c 幼稚比例(CD62L) + CD 44 − )，EM(效应存储器；CD62L) − CD 44 + )和CM(中央存储器；CD62L) + CD 44 + )计算子集。 e –j 体外激活Thy1.1PMEL-1CD8增殖分析 + T(Thy1.1) + )细胞和未受刺激的多克隆CD8 + T(CD 45.1) + )肿瘤抗原存在或不存在的细胞。 e 实验原理图。注入细胞数：B16-F10，2×10 5 /鼠标；Thy1.1 + ，1×10 6 /鼠标；CD 45.1 + ，1×10 6 /鼠标。 f Thy1.1细胞计数 + 和CD45.1 + 细胞。 g 细胞数量比非肿瘤ctx平均增加一倍。 预 小组。 h 具有代表性的Thy1.1流式细胞术图像 + 和CD45.1 + 细胞分析CD 44的表达。有七个以上分裂的细胞数目(i )和CD 44的表达( j )计算。 n =4只小鼠/组。每个符号指示单个鼠标的计算值。水平条表示手段。双尾未配对学生t -测试。CD4 岗 ；cfse，羧荧光素琥珀酰亚胺酯；ctv，细胞色素紫罗兰；ctx 预 、环磷酰胺预处理、PBS、磷酸盐缓冲液。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们检测了CD8的增殖和持久性。 + CTX中的T细胞 预 -和CTX 预 /CD4 岗 -经验丰富的老鼠。体外-启动Thy1.1 + PMEL-1细胞(作为前T细胞)和未经刺激的多克隆CD 45.1细胞 + CD8 + T细胞(作为en-T细胞)在转移到荷瘤小鼠或非荷瘤C57BL/6小鼠之前用不同的荧光染料标记。 2E )。这使我们能够评估黑色素瘤抗原存在或不存在时，这两个群体的增殖情况(补充图)。 3A )。CD4 岗 在CTX后7天开始 预 它成功地耗尽了CD4 + CTX的T细胞群 预 /CD4 岗 组(附图) 3B )。CTX 预 /CD4 岗 增加了Thy1.1 + 和CD45.1 + 腹股沟淋巴结中的细胞群与肿瘤的存在无关(如图所示)。 2F )。值得注意的是，CTX 预 /CD4 岗 -有经验的荷瘤小鼠出现Thy1.1膨胀爆发 + PMEL-1细胞(图1. 2G ；180.9倍[pmel-1]，25.7倍[CD 45.1] + ])。脾脏扩张率低于腹股沟淋巴结(附图)。 4A，b )。细胞分裂状态和表型分析表明，肿瘤接种与CTX联合应用预 /CD4 岗 导致大多数Thy1.1 + Pmel-1细胞快速分裂分化为CD 44+ CD62L − 效应记忆表型 2H-j 和补充图。 4C-g )。这些结果表明，体外诱导的黑色素瘤特异性CD8。 + T细胞具有增殖优势，特别是在ctx中。 预 /CD4 岗 -经验丰富的抗原-丰富的肿瘤引流淋巴结。值得注意的是，广泛区分CD45.1的比例 + 细胞(>7分裂，CD 44)+ CD62L − )在淋巴结和脾脏中增加，而不考虑肿瘤的存在(如图所示)。 2H-j 和补充图。 4C-j ).
CTX 预 /CD4 岗 提高内源性CD8的效应功能和肿瘤反应性 + T细胞 以前的研究已经证明CD4的耗竭 + 细胞与效应功能的增加、肿瘤的反应性和CD8的瘤内浸润有关。 + T细胞 3 ,4 ,5 ,7 。以确定CTX是否 预 /CD4 岗 同样的结果，我们分析了前T细胞和en-T细胞的这些功能特征。 3A )。根据同时分泌多种效应细胞因子(干扰素-γ、肿瘤坏死因子、白细胞介素-2，即多功能细胞因子)的细胞比例来评价效应功能。类似于记忆状态分析的结果(如图所示)。 2C )，CTX之间的前T细胞没有显着性差异。 预 和CTX 预 /CD4 岗 组(图1. 3B 和补充图。 5A，b )。高分化的ex-T细胞表现出比en-T细胞更强的多功能反应，而不考虑CD4的存在。 岗 。相比之下，ctx中多功能的en-T细胞比例显著升高。 预 /CD4 岗 比在CTX 预 两种或两种以上细胞因子表达的细胞频率；CTX 预 =15.88±1.74%，CTX 预 /CD4 岗 =55.46±9.16%，平均±SD； p < 0.0001; two-tailed unpaired Student’s t -测试)。
图3：抗CD4后处理增强内源性CD8的肿瘤反应性 + T细胞 a 实验原理图。注入细胞数：B16-F10，2×10 5 /小鼠；体内外启动Thy1.1 + PMEL-1CD8 + T(ex-T)细胞，2×10 6 /鼠标。 b 多功能分析刺激和分析细胞因子的表达，如附图所示。 5A，b 。用SPICE V6.0绘制饼形图。弧长表示表达相应标记的细胞比例。PIE区域表示表示给定数量的功能标记的细胞所占的比例。 n =5只小鼠/组。 c CD 25在活化或不加(基底)B16-F10孵育16h的淋巴细胞中表达。 d 内源性CD8的杀伤效率 + 检测细胞对B16-F10的杀伤作用。每组4只小鼠的细胞分为三组，每组4只。误差条表示为±SEM。采用双向方差分析和Bonferroni后自评检验，以确定统计学意义。 e TCR克隆型分析的Shannon均匀度(归一化Shannon-Wiener指数)。分析α链(左)和tcrβ链(右).CTX 预 n =3只小鼠；CTX 预 /CD4 岗 n =5只老鼠。误差条表示均值±SD。 d , e 从附图中分离出的EN-T细胞。 3E，f 被利用了。 f –i 肿瘤浸润性CD8的特征 + T细胞 f 肿瘤组织实验示意图。注入细胞数：B16-F10，2×10 6 /小鼠；前T细胞，2×10 6 /鼠标。 g 用流式细胞术测定100例肿瘤组织活细胞中ex-T和en-T细胞的计数。 h 幼稚比例(CD62L) + CD 44 − )，EM(效应存储器；CD62L) − CD 44 + )和CM(中央存储器；CD62L) + CD 44 + )计算子集。 i 显示了pd-1在ex-T和en-T细胞中的表达频率. c , g –i n =4只小鼠/组。 c , e , g –i 每个符号指示单个鼠标的计算值。水平条表示手段。c , g –i 双尾未配对学生 t -测试。CD4 岗 ，抗CD4后调节；ctx 预 、环磷酰胺预处理。源数据作为源数据文件提供。
与前T细胞不同的是，在接种肿瘤时，肿瘤反应性的en-T细胞的数量是有限的.CTX后肿瘤反应性的变化 预 /CD4 岗 -诱导分化，检测B16-F10暴露后细胞CD 25的表达及杀伤活性。在b16-f10照射后，在两种ctx中均有较高的肿瘤反应性，上调CD 25的表达。 预 和CTX 预 /CD4 岗 组(图1. 3C 和补充图。 2E )。值得注意的是，在ctx中，en-T细胞的CD 25-表达率显著升高。 预 /CD4 岗 比在CTX 预 提示抗CD4治疗可提高CD8的肿瘤反应性。 + T细胞体外杀伤实验的结果进一步证实了这一点，其中ctx的b16-f10杀伤效率。 预 /CD4 岗 暴露的en-T细胞高于CTX细胞。 预 -暴露于E-T细胞(如图所示)。 三维空间 )。有偏倚的T细胞激活改变tcr序列，从而促进某些tcr克隆的扩增和富集。 19 ,20 ,21 。因此，我们对tcr序列的Shannon均匀度进行了分析，这表示了clonotype的均匀分布程度，而较低的值表明一些T细胞克隆优先增殖。 21 。CTX 预 /CD4 岗 组间均匀度明显低于CTX组。 预 组(图1. 3E ; p =0.03用于TCRα和TCRβ；Mann-Whitney U -测试)，指示某些T细胞克隆类型的富集。
接下来，我们分析了肿瘤内的CD8。 + 大剂量B16-F10接种小鼠T细胞，建立两种CTX的可测肿瘤体积 预 和CTX 预 /CD4 岗 组(图1. 3F )。从CTX的效果来看 预 /CD4 岗 T细胞增殖和肿瘤反应性的研究(图一)。 2F，g 和 3C-E )，CTX 预 /CD4 岗 癌内前T细胞和en-T细胞浸润增加(见图)。 第三代 )。表型分析表明CTX 预 /CD4 岗 -经验丰富的en-T细胞分化程度较高，pd-1的比例较高。 + 细胞比CTX 预 -暴露组(图1)。 3H，I 和补充图。 2F，g )。高反应性前T细胞在CTX中的阳性率分别为54.3±26.3%和66.5±7.4%(平均±SD)。 预 和CTX 预 /CD4 岗 分别分组。
这些结果表明，使用抗CD4治疗可提高效应细胞功能、肿瘤反应性和肿瘤内源性CD8的浸润。 + T细胞在这一ACT组合模型中。
CTX 预 /CD4 岗 丰富IL-18Rα 嗨 CD8 + T细胞 到目前为止，已经确定的影响ctx术后ACT疗效的因素 预 /CD4 岗 包括前T细胞的扩张和En-T细胞的肿瘤反应性增加。为了进一步明确影响目前化疗方案抗肿瘤反应的因素，我们对CD8基因表达谱进行了研究。 + T细胞暴露于CTX免疫调节的环境中 预 /CD4 岗 。我们使用En-T细胞进行分析(见图)。 4A )，因为它们表现出比前T细胞更严重的表型/功能改变。在ctx中上调超过两倍的基因中 预 /CD4 岗 组与CTX中的比较 预 组(补充资料) 1 21%与T细胞活化、分化和迁移有关(95个基因中有20个； Ccl 1 , CCR 4 , Ccr6 , Ccr8 , Cd40lg , EPAS 1 , 富特7 , Gcnt 1 , 格兹姆 , ICOS , IFitm 1 , IFNG , IL18r1 , 拉格斯1 , 彭克 , 罗拉 , RORC , S100a4 , 赛玛6d ，和 蒂吉特 )，与表型分析的结果一致。 2C，d，h-j 和补充图。 4C-j )。重要的是，CTX 预 /CD4 岗 -经验丰富的en-T细胞表现出三倍以上的上调。 IFNG 和 IL18r1 (无花果) 4B )，它编码IL-18-IL-18R信号中的关键组件。 22 ,23 。蛋白质表达分析表明，在根据IL-18Rα表达水平分组的三个群体中，IL-18Rα。 嗨 在ctx暴露小鼠中，en-T细胞明显富集。 预 /CD4 岗 (无花果) 4C ).
图4：抗CD4后处理增强IL-18Rα 嗨 内源性CD8 + T细胞 a 实验原理图。注入细胞数：B16-F10，2×10 5 /小鼠；体内外启动Thy1.1 + PMEL-1CD8 + T(ex-T)细胞，2×10 6 /鼠标。 b 微阵列分析中的差异表达基因。在ctx中上调(>3倍)的基因 预 /CD4 岗 与CTX的比较 预 -有经验的内源性CD8 + 提示T(en-T)细胞。从附图中分离出的EN-T细胞。 3F 被利用了。每组共收集5只小鼠的en-T细胞，进行分析。 c 分析IL-18Rα在En-T细胞中的表达情况。 n =5只小鼠/组。双尾未配对学生 t -测试。 d –f IL-18Rα的TCR分布及基因表达谱分析 嗨 恩-T细胞。 d 分析物制备原理图。注入细胞数：B16-F10，2×10 5 /小鼠；前T细胞，2×10 6 /鼠标。第25天，IL-18Rα 嗨 -通过磁性细胞分离分离富集的EN-T细胞。 e 给出了TCRα链(左)和β链(右)的香农均匀度(归一化香农维纳指数). n =每组3只小鼠。 f 整个转录组分析。IL-18Rα中上调(3倍以上)的基因 嗨 -富集的EN-T细胞与EN-T细胞的流通性相比较. n =4只小鼠/组。 g En-T细胞多色流式细胞仪分析。所制备的分析物 a 用所指示的标记进行染色并进行分析。降维； t -分布式随机邻居嵌入)进行可视化。 c , e 每个符号表示单个鼠标。水平条表示手段。XCD4岗 ，抗CD4后调节；ctx 预 、环磷酰胺预处理。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们通过比较磁富集过高IL-18Rα-表达的细胞与其他细胞在流通性中的差异，分析了细胞的子集特异性特征(图1)。 4D )。虽然这两组样本来自同一个CTX 预 /CD4 岗 -暴露CD8 + T细胞、tcr库分析表明，IL-18Rα的香农均匀度较低。 嗨 组(图1. 4E )。进一步的基因表达分析确定了IL-18Rα的分子特征。 嗨 EN-T细胞群体(补充数据) 2 )。我们发现与T细胞活化/分化相关的基因，其中一些基因在ctx中被上调。 预 /CD4 岗 -暴露CD8 + T细胞(图1. 4B )，在IL-18Rα中被上调了三次以上。 嗨 -富集细胞(图1. 4F )。此外，上调的基因还包括那些编码先天性T细胞相关标记的基因( Pxdc 1 , Hrh4 , RORC , Ccr6 , Cd40lg ，和 BLK )和自然杀伤细胞受体( Ncr1 , Klrb1b , Klrb1c ，和 Klrk 1 )，不仅在典型的tcr依赖刺激后增加，而且通过tcr不依赖/细胞因子介导的T细胞活化(如旁观者激活)而被上调。 24 ,25 ,26 。多维蛋白表达分析定义了IL-18Rα 嗨 -相关表型特征，以CD 44为特征 + CD62L − CD49d − CXCR 3 + T-打赌 + (无花果) 4G ).
IL-18Rα的抗肿瘤活性增强 嗨 CD8 + T细胞是由tcr/IL-18信号转导介导的。 据报道，IL-18信号转导是肿瘤T细胞效应功能的重要调节因子。 27 。此外，IL-18Rα的患病率较高。 + 肿瘤中的细胞与较好的预后有关。 28 。我们研究了IL-18Rα的抗肿瘤潜能。 嗨 CD8 + 在CTX暴露小鼠体内富集的T细胞 预 /CD4 岗 。CTX 预 /CD4 岗 暴露的en-T细胞被归类为IL-18Rα。 低层 ，IL-18Rα 中 ，以及IL-18Rα 嗨 对子集及其多功能进行了评估。在这三组中，IL-18Rα 嗨 细胞表现出最高的多功能。 5A 和补充图。 5C，d )，表明它们的抗肿瘤潜力高于其他两个亚群。
图5：il-18Rα 嗨 CD8 + T细胞依赖性抗肿瘤作用是通过TCR/IL-18信号转导介导的. a IL-18Rα的多功能 低层 ，IL-18Rα 中 ，以及IL-18Rα 嗨 内源性CD8 + 计算T(en-T)细胞，如图所示。 3B 使用补充图中的数据。 5C，d 。如图所示。 4A 被利用了。 b , c IL-18Rα抗肿瘤作用的评价 嗨 恩-T细胞。 b 实验原理图。注入细胞数：B16-F10，2×10 5 /小鼠；体内外启动Thy1.1 + PMEL-1CD8 + T(ex-T)细胞，2×10 6 /小鼠；从第一次转移小鼠中分离出的en-T细胞，1×10 6 /鼠标。 c 肿瘤生长一直持续到第32天。肿瘤全期生长曲线和生存期曲线见附图。 6a，b 。IL-18Rα 嗨 如附图所示，ENT表示磁富集细胞. 3H 。误差条表示为±SEM。 d 如图所示，分析IL-18Rα在前T细胞中的表达。 4C 。每个符号指示单个鼠标的计算值。水平条表示手段。e IL-18Rα的多功能 低层 ，IL-18Rα 中 ，以及IL-18Rα 嗨 如图所示，计算前T细胞。 3B 使用补充图中分析的数据。 5E，f . d , e 如图所示。 4A 被利用了。 f 测定细胞因子在培养基中的浓度。分离IL-18Rα 低/中 和IL-18Rα 嗨 补充图中的前T细胞。 3I 与gp 100共培养。 25–33 -脉冲或非脉冲C57BL/6脾细胞4h，治疗组加入IL-18(30 ng/mL)。来自CTX的集合细胞 预 /CD4 岗 -有经验的老鼠( n =5)。生物三胞胎。 g , h IL-18Rα抗肿瘤作用的评价 嗨 前T细胞。 g 实验原理图。注入细胞数：B16-F10，2×10 5 /小鼠；前T细胞，2×10 6 /小鼠；分离的前T细胞(来自第一转移小鼠)，5×10 5 /鼠标。 h 肿瘤生长一直持续到第32天。肿瘤全期生长曲线和生存期曲线见附图。 7a，b 。IL-18Rα 嗨 和IL-18Rα 低/中 如附图所示，前T平均磁选细胞。 3J 。误差条表示均值±SD。 i –k IL-18信号在CTX中的作用评价 预 /CD4 岗 养生法。 i 实验原理图。注入细胞数：B16-F10，2×10 5 /小鼠；前T细胞，2×10 6 /鼠标。肿瘤生长 j )和存活率( k )显示。 j 每条曲线表示单个鼠标。†表示在指定的时间点死亡。活到第80天的老鼠的数量被代表。g –k 抗IL-18治疗从第4天开始，每周3次，整个疗程。 a –E，我 –k n =5只小鼠/组。 g , h WT组， n =7只小鼠/组； IL18r1 淘汰赛组， n =5只小鼠/组。双尾未配对学生 t -测试( d )和双尾对数秩(mantel-Cox)检验( k )测定统计学意义。αIL-18，IL-18中和抗体；αMHC-1，抗MHC-1封闭抗体；CD4 岗 ，抗CD4后调节；ctx 预 、环磷酰胺预处理；野生型小鼠。源数据作为源数据文件提供。
到目前为止，IL-18Rα 嗨 恩-T细胞已显示出扭曲的TCR储备(图一)。 4E )，表达高水平的自然杀伤细胞受体。 4F )，并且是多功能的(如图所示)。 5A )。这些观察提出了两个问题：“IL-18Rα是否存在？ 嗨 在体内有较强的抗肿瘤活性？““主要组织相容性复合体I(MHC I)与TCR之间的相互作用是否具有抗肿瘤作用？”。因此，我们评估了IL-18Rα的体内抗肿瘤活性。 嗨 从CTX中分离出来的子集 预 /CD4 岗 -经验丰富的老鼠。白细胞介素-18Rα的子集效应评价 嗨 以IL-18Rα的表达为基础，进行细胞集落培养，并将其转入含b16-f10的细胞中。 Rag1 敲除(KO)小鼠 5B 和补充图。 3H )。从长远来看，IL-18Rα 嗨 En-T细胞对生存率和肿瘤进展无明显影响(附图). 6a，b )。相反，我们在肿瘤抑制方面观察到了子集的弱短期效应(~27天)(如图所示)。 5C 和补充图。 6C )。值得注意的是，用抗MHC I抗体治疗可以消除抑制作用，暗示这一事件是由MHC I与TCRs之间的相互作用介导的，TCRs识别在B16-F10黑色素瘤上表达的抗原。
CTX 预 /CD4 岗 治疗创造了一种环境，使en-T细胞容易分化为多功能的IL-18Rα。 嗨 该子集通过MHCI-TCR相互作用产生短期效应功能.我们假设，前T细胞在ctx中具有与IL-18Rα表达相同的分化。 预 /CD4 岗 -诱导环境。有趣的是，CTX 预 /CD4 岗 处理丰富了类似的多功能IL-18Rα。 嗨 CD8 + T细胞在前T型人群中的分布(图1)。 5D，e 和附图。 2H 和 5E，f )。响应特定的gp 100 25–33 肽，IL-18Rα 嗨 前T细胞分泌的效应细胞因子水平高于IL-18Rα。 低/中 前T细胞(图1. 5F )。值得注意的是，IL-18的加入增强了这一反应，表明IL-18信号在这一亚群的抗肿瘤活性中起着至关重要的作用。为了评价体内抑瘤活性，我们分离了IL-18Rα。 嗨 CTX前T细胞 预 /CD4 岗 -有经验的小鼠，并将其转移至B16-F10-荷瘤C57BL/6小鼠(见图)。 5G )。此外，我们还将排序的单元管理到 IL18r1 Ko小鼠，评价IL-18对转移的IL-18Rα的影响 嗨 或IL-18Rα 低/中 前T细胞。如在en-T细胞中观察到的那样(见图)。 5C 和补充图。 6A-c )，IL-18Rα 嗨 在此模型中，前T细胞仅表现出短期效应(~32天)。 5H 和补充图。 7A-c )。IL-18阻断抗体对小鼠的作用减弱，支持体外实验观察到IL-18的作用(图1)。 5F )。IL-18Rα 低/中 前T细胞的抗肿瘤活性低于IL-18Rα。 嗨 群体与IL-18阻断的IL-18Rα差异不显著(P>0.05)。 嗨 前T组。值得注意的是，与C57BL/6野生型小鼠相比， IL18r1 Ko受体小鼠缺乏IL-18R表达的en-T细胞，其对IL-18Rα转移的影响差异较大。 低/中 和IL-18Rα 嗨 前T细胞。然而，在长期分析中，肿瘤抑制率和生存率没有显著差异(补充图). 7a，b )，意味着IL-18Rα 嗨 前T细胞本身只具有短期利益，没有连续生成的子集.
CTX 预 /CD4 岗 改变了en-T/ex-T细胞的功能形态，增加了IL-18Rα的比例。 嗨 子集(图) 4C 和 5D )。然而，尽管有较高的效应电位，细胞亚群的直接转移在肿瘤抑制中仅表现出短期效应。 5C，h 和附图。 6 和 7 )。这些结果表明CTX 预 /CD4 岗 -诱导环境，持续生成IL-18Rα 嗨 CD8 + T细胞，而不是短期存在的细胞，推动了ctx强烈的抗肿瘤反应。 预 /ACT/CD4 岗 -经验丰富的老鼠(图1. 1C，d )。因此，我们研究了ctx的抗肿瘤作用。 预 /ACT/CD4 岗 -通过阻断IL-18信号，长期诱导环境，这在IL-18Rα的功能中起着至关重要的作用。 嗨 CD8 + T细胞在体外和体内(图1)。 5F，h ). IL18r1 Ko小鼠(在受体小鼠细胞中不存在IL-18信号，而在转移的前T细胞中完整)或IL-18中和抗体(阻断IL-18信号)被用来阻断IL-18 Rα的功能。 嗨 EN-T或EN-T/Ex-T细胞(图1)。 5I )。使用 IL18r1 Ko小鼠和抗IL-18治疗对ctx的肿瘤生长和存活均无显著影响。 预 -有经验的团体(WT-CTX) 预 、WT-CTX 预 +αIL-18， IL18r1 高CTX 预 ；图1. 5J，k )，其IL-18Rα的比例较低。 嗨 T细胞重要的是，CTX 预 /CD4 岗 各组对IL-18信号的内源性细胞限制和全细胞阻断的结果进行了对比分析.抗IL-18治疗可明显降低CTX的抑瘤率和生存率。 预 /CD4 岗 -经验丰富的C57BL/6野生型小鼠。然而，CTX 预 /CD4 岗 -经验丰富 IL18r1 Ko小鼠与c57bl/6野生型小鼠具有相似的治疗作用，提示高肿瘤特异性IL-18Rα具有抗黑色素瘤作用。 嗨 前T细胞超过IL-18Rα细胞 嗨 恩-T细胞。这些数据表明CTX 预 /CD4 岗 诱导持续产生抑制肿瘤的IL-18Rα的环境 嗨 CD8 + T细胞在TCR和IL-18信号转导中发挥较强的效应作用.
CTX中的各种因素 预 /CD4 岗 协同诱导IL-18Rα 嗨 CD8 + T细胞 确定调节肿瘤抑制性IL-18Rα生成的变量。 嗨 除T细胞外，我们还评估了影响目前治疗方案的因素的作用，并评估了各因素的作用。我们用各种因子消减方案(肿瘤存在，ctx)治疗小鼠。 预 ，前T细胞转移，IL-2和CD4 岗 并分析IL-18Rα比值和数量的变化。 嗨 细胞在第25天(相同的实验方案如图所示。 4A )。此外，反IL-18， IL18r1 高， Foxp 3 DTR ，和 Rag1 并对Ko小鼠进行分析，以探讨IL-18信号转导、调节性T细胞(Treg)耗竭和永久性淋巴细胞减少的作用.清除CTX 预 ，IL-2和CD4 岗 显著降低IL-18Rα的频率和数量。 嗨 前T细胞(图1. 6a，b )。值得注意的是，IL-18Rα 嗨 Treg耗竭小鼠的频率与CD4耗竭小鼠的频率相似，说明Treg在形成这种环境中的重要性。然而，IL-18信号传导中断或Treg耗尽降低了IL-18Rα的绝对计数。 嗨 前T细胞与对照组比较(图1)。 6B )。在变量中，IL-18Rα的比值。 嗨 CTX对en-T细胞亚群的影响 预 和CD4 岗 (补充图。 8A )。IL-18Rα的绝对计数 嗨 En-T细胞强烈依赖于淋巴细胞减少的程度，这可能是由于起始点的总E-T细胞数的变化(补充图)。 8B，c )。令人惊讶的是， Rag1 Ko小鼠的IL-18Rα频率最高。 嗨 外T细胞，提示淋巴细胞开放状态是产生IL-18Rα的重要因素。 嗨 前T细胞。通过评估淋巴细胞减少程度与IL-18Rα比值之间的关系，证实了这一点。 嗨 前T细胞。IL-18Rα的频率 嗨 前T细胞与淋巴细胞减少程度密切相关(如图所示)。 6C )。与前T细胞相比，E-T细胞具有更复杂的变量(启动、再繁殖)，二者之间没有显着的相关性(补充图)。 8D ).
图6：影响IL-18Rα的各种因素 嗨 CTX细胞的产生 预 /CD4 岗 -诱导环境。 a –c 导致IL-18Rα的变量的评估 嗨 细胞生成。完全的治疗方法(如图中所示)。 4A )或将缺少每个变量的改良方案应用于小鼠( n =每组5只)。在第25天，比率( a )和数字( b )的IL-18Rα 嗨 Thy1.1 + PMEL-1CD8 + 对淋巴组织中的T(ex-T)细胞进行分析。 c 淋巴细胞减少评分(以脾细胞总数(−log)和肿瘤引流淋巴结计数为代表)与IL-18Rα比例的相关性 嗨 评估前T细胞。 d –f CTX单细胞转录组分析的可视化 预 和CTX 预 /CD4 岗 -有经验的前T细胞。收集各组4只小鼠的细胞，并进行分析。 d 在无监督聚类后，将前T细胞投影到二维空间。 t -分布式随机邻居嵌入(t-SNE)。与组、组和 IL18r1 表达式显示。 e 列出了与第6组差异表达的基因。 f 所示基因的对数归一化转录水平。 g , h 白细胞介素-7信号对IL-18Rα影响的评价 嗨 CD8 + T细胞生成。 g 实验原理图。注入细胞数：B16-F10，2×10 5 /小鼠；前T细胞，2×10 6 /鼠标。治疗组自第10~14天起，每日给予非溶Fc融合IL-7(IL-7-FC)治疗. h 具有代表性的数据、比率和IL-18Rα的数量。 嗨 显示前T细胞。 a , b , h n =5只小鼠/组。每个符号指示单个鼠标的计算值。水平条表示手段。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; one-way ANOVA with the Dunnett’s post hoc test (a , b 第一组为对照组)，两尾Spearman秩相关( c )，和双尾未配对学生的 t -测试( h )测定统计学意义。αIL-18，IL-18中和抗体；CD4 岗 ，抗CD4后调节；ctx 预 、环磷酰胺预处理；DT、白喉毒素；WT野生型小鼠。源数据作为源数据文件提供。
更详细地了解CTX引起的变化 预 /CD4 岗 ，我们对淋巴样细胞进行了单细胞转录组分析。我们评估了不同方案间差异丰富的细胞簇(Ctx)。 预 和CTX 预 /CD4 岗 )并在已鉴定的聚类间差异表达基因。在整个淋巴样细胞的宏观图像中，CD4的加入 岗 特异性感染CD4 + T细胞(附图) 9A )，而在其他专题组中没有观察到重大变化。接下来，我们对en-T和ex-T细胞进行了单细胞转录组分析，以确定CD8的基因表达谱。 + CTX暴露T细胞 预 /CD4 岗 。与CTX相比 预 CTX集团 预 /CD4 岗 -经验丰富的en-T细胞和前T细胞有更大的集群大小，表达水平较高的 IL18r1 (无花果) 6d 和补充图。 9B )。与先前的结果一致(如图所示)。 4F )，这些簇也显示了在IL-18Rα中高表达的几个基因的优势表达。 嗨 -富集的EN-T细胞(图1. 6E 和补充图。 9C )。在淋巴管开放的情况下，各种细胞因子信号被放大 29 ,30 ,31 ，是产生IL-18Rα的关键因素。 嗨 -富集的前T细胞(图1. 6A-c )，我们假设CTX的细胞因子提示 预 /CD4 岗 淋巴环境对IL-18Rα扩增的影响 嗨 前T细胞。因此，我们确定了与稳态/炎性细胞因子受体相关的基因表达水平。有趣的是，细胞团簇 IL18r1 水平也表现出更高的表达 Il7r 相比较 Il12rb1 , IL12rb2 , Il15ra ，和 IL21r (无花果) 6f 和补充图。 9d )，这意味着IL-7信号可以影响IL-18Rα。 嗨 细胞生成。为了验证这一点，在当前的ctx中引入了IL-7-fc治疗。 预 /CD4 岗 方案(图1. 6g )。值得注意的是，IL-7信号的放大大大增加了IL-18Rα的数量和比率。 嗨 EN-T和Ex-T细胞(图1)。 六小时 和补充图。 10 ).
总之，这些结果表明CTX 预 /CD4 岗 -创造淋巴管开放状态，包括放大处于稳态状态的IL-7信号，增加IL-18Rα。 嗨 CD8 + T细胞亚群。
