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暂时性抗CD4过继免疫治疗通过增加IL-18Rα增强抗肿瘤反应嗨CD8+T细胞

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发表时间:2021-09-13 17:09作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

过继性T细胞治疗(ACT)需要淋巴耗竭预处理,以消除免疫抑制因子,并使过继转移的肿瘤反应性T细胞能够有效植入。抗CD4单克隆抗体耗尽CD4+免疫抑制细胞、抗CD4治疗和ACT联合治疗在肿瘤治疗中具有协同作用.在这里,我们演示了一种ACT后预处理方案,该方案涉及暂时性的抗CD4治疗(CD4)。)。环磷酰胺预处理(CTX)对小鼠黑色素瘤的联合作用),CD4,以及体内外启动的肿瘤反应性CD8。+提出了T细胞输注法.CTX/CD4通过促进体外诱导的CD8的增殖和分化,增强肿瘤抑制和宿主存活+T细胞与内源性CD8+T细胞内源性CD8+T细胞增强效应物的轮廓和肿瘤的反应性,显示TCR储备的倾斜.值得注意的是,多功能IL-18Rα的富集。CD8+T单元子集是ctx中的关键事件。/CD4-诱导肿瘤抑制。IL-18Rα的抗肿瘤作用子集由IL-18信号转导和TCR-MHC I相互作用介导.这项研究强调了CD4的临床相关性。,并提供了关于抗CD4治疗的免疫学特性的见解,从而增强了CD8的抗肿瘤反应。+T细胞

导言

免疫治疗是治疗癌症的一种有效方法,它涉及免疫调节剂和免疫细胞的应用。1,2。抗CD4单克隆抗体是一种重要的免疫调节剂,它通过增加肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)来增强多种肿瘤的抗肿瘤免疫能力。3,4,5和促进CD8+T细胞对肿瘤细胞源抗原的反应性6,7.

过继性T细胞治疗(ACT)利用体内外启动的肿瘤反应性T细胞(Ex-T细胞)(例如分类T细胞、TILs和基因工程T细胞)直接攻击恶性细胞。8,9,10,11。ACT通常伴有淋巴耗竭预处理,消除消耗的细胞因子汇和免疫抑制细胞,以便有效地移植前T细胞。12,13,14。然而,淋巴耗竭的作用是短暂的,抑制因子最终会重新出现。当抗CD4抗体耗尽CD4表达的细胞因子时3,15在ACT预处理后,充分的治疗可能通过增强前T细胞和内源性CD8的活性而诱导协同抗肿瘤反应。+T细胞(en-T细胞;淋巴耗竭后的一种新的再繁殖的子集)。

在这里,我们证明了应用抗CD4作为后处理方案(CD4)。联合环磷酰胺预处理(Ctx)。),大大提高了ACT的疗效。我们证明CTX/CD4IL-18Rα促进ex-T和en-T细胞增殖及效应功能的研究CD8+T细胞亚群是增强抗肿瘤反应的关键.我们进一步揭示了IL-18Rα的特性。CD8+CTX中T细胞的数量及其生成机制/CD4养生法。

结果

CTX/CD4提高ACT疗效

评价CTX的动力学和范围-诱发淋巴衰竭,通常包括在ACT方案中。16我们用不同剂量的CTX处理C57BL/6小鼠。淋巴组织淋巴减少的严重程度和持续时间与CTX剂量相关(图)。1A和补充图。1A,b)。在此基础上,我们设计了一种利用ctx的方案。、前T细胞和CD4,一种协同提高ACT疗效的组合(如图所示)。1B)。B16-F10攻击后3天,C57BL/6小鼠连续接受ctx,体外启动pmel-1细胞(黑色素瘤特异性T细胞受体(Tcr)-转基因CD8)。+T细胞)和白细胞介素-2(IL-2)。在ACT模型中,PMEL-1细胞在体外被激活和培养2天后,作为过继转移的前T细胞。抗CD4的暂时性治疗(持续5周)在ctx后7天开始。,当诱导的淋巴管减少开始恢复时(见图)。1A和补充图。1A,b)。CTX/CD4显著提高肿瘤抑制和前T细胞转移小鼠的存活率。1C,d)。缺乏前T细胞或CD4(CTX/抗CD4或CTX/ex-T组)降低了治疗效果。值得注意的是,虽然在其他组中没有观察到,但在CTX存在的情况下接受ACT治疗的组/CD4(ctx/ex-T/抗-cd4组)发展为白癜风,是CD8的一个征象。+T细胞诱导的黑素细胞破坏6,7,表明CD8的应答增加。+T细胞(图1.1E,f)。值得注意的是,10只小鼠中有5只显示出完全抑制黑色素瘤的发展,而在其他各组中则没有观察到。1F)。这些结果表明CTX具有很强的治疗潜力。/ACT/CD4黑色素瘤联合治疗。

图1:抗CD4后调节增强过继性T细胞治疗中的抗黑色素瘤反应.

过继性T细胞治疗C57BL/6小鼠的疗效评价。a环磷酰胺(CTX)治疗C57BL/6小鼠腹股沟淋巴结(左)和脾(右)细胞计数。小鼠腹腔注射指示剂量(mg/kg)的CTX。n=每点3只老鼠。误差条表示均值±SD。b实验原理图。注入细胞数:B16-F10,2×105/小鼠;体内外处理-启动Thy1.1+PMEL-1CD8+T(ex-T)细胞,2×106/鼠标。在T细胞移植前两天,用300 mg/kg的CTX预处理小鼠.第10天起,每周用抗CD4抗体治疗小鼠5周。c肿瘤生长曲线显示。每条曲线表示单个老鼠的纵向变化。†表示单个老鼠在指定的时间点死亡。图中显示了活到第80天的老鼠的数量。d采用两尾对数秩(Mantel&Cox)检验,统计显着性。e有白癜风和无白癜风小鼠的典型图像。f第80天白癜风无肿瘤征象的小鼠数。cf n=10只小鼠/组。αCD4,抗CD4抗体.源数据作为源数据文件提供。

CTX/CD4促进CD8的分化和增殖+T细胞

我们研究了CTX的作用。/CD4论CD8+T细胞群,随着CD8的增加+白癜风小鼠的T细胞活性(图一)。1E,f)与增强的抗肿瘤反应密切相关。两种不同的CD8+分别分析体外T细胞(体外启动的肿瘤反应细胞)和en-T细胞(多克隆内源性细胞)。

首先,我们检查了淋巴组织细胞的表型特征。2A)。CTX/CD4-经验丰富的Ex-T细胞和EN-T细胞表现出较高频率的4-1BB-和CD 69-表达细胞(如图所示).2B和补充图。2A,b),表明TCR介导的激活增加。前T细胞在两种方案的记忆状态上没有任何显着性差异(图一)。2C和补充图。2C)。体外启动诱导大多数前T细胞分化为CD 44+CD62L效应器记忆子集与条件疗法无关。相比之下,有相对较高比例的CD 44的en-T细胞。CD62L+朴素子集(>25%),在CTX下表现为加速分化。/CD4与CTX相比条件。我们还检测了代表抑制性受体的表达水平,以及重复抗原刺激CD8的指标。+T细胞17,18。如在记忆相关标记中所观察到的那样(见图)。2C两组前T细胞表达谱相似(图1)。二维空间和补充图。二维空间)。相比之下,在ctx作用下,en-T细胞显著上调pd-1、TIGIT和LAG 3的水平。/CD4与CTX相比这意味着淋巴组织中激活信号的增加。

图2:抗CD4后处理促进体内外启动和内源性CD8的增殖和分化。+T细胞

a实验原理图。注入细胞数:B16-F10,2×105/小鼠;体内外启动Thy1.1+PMEL-1CD8+T(ex-T)细胞,2×106/鼠标。bd前T细胞和内源性CD8的标记表达及子集分析+T(en-T)细胞。c幼稚比例(CD62L)+CD 44),EM(效应存储器;CD62L)CD 44+)和CM(中央存储器;CD62L)+CD 44+)计算子集。ej体外激活Thy1.1PMEL-1CD8增殖分析+T(Thy1.1)+)细胞和未受刺激的多克隆CD8+T(CD 45.1)+)肿瘤抗原存在或不存在的细胞。e实验原理图。注入细胞数:B16-F10,2×105/鼠标;Thy1.1+,1×106/鼠标;CD 45.1+,1×106/鼠标。fThy1.1细胞计数+和CD45.1+细胞。g细胞数量比非肿瘤ctx平均增加一倍。小组。h具有代表性的Thy1.1流式细胞术图像+和CD45.1+细胞分析CD 44的表达。有七个以上分裂的细胞数目(i)和CD 44的表达(j)计算。n=4只小鼠/组。每个符号指示单个鼠标的计算值。水平条表示手段。双尾未配对学生t-测试。CD4;cfse,羧荧光素琥珀酰亚胺酯;ctv,细胞色素紫罗兰;ctx、环磷酰胺预处理、PBS、磷酸盐缓冲液。源数据作为源数据文件提供。

接下来,我们检测了CD8的增殖和持久性。+CTX中的T细胞-和CTX/CD4-经验丰富的老鼠。体外-启动Thy1.1+PMEL-1细胞(作为前T细胞)和未经刺激的多克隆CD 45.1细胞+CD8+T细胞(作为en-T细胞)在转移到荷瘤小鼠或非荷瘤C57BL/6小鼠之前用不同的荧光染料标记。2E)。这使我们能够评估黑色素瘤抗原存在或不存在时,这两个群体的增殖情况(补充图)。3A)。CD4在CTX后7天开始它成功地耗尽了CD4+CTX的T细胞群/CD4组(附图)3B)。CTX/CD4增加了Thy1.1+和CD45.1+腹股沟淋巴结中的细胞群与肿瘤的存在无关(如图所示)。2F)。值得注意的是,CTX/CD4-有经验的荷瘤小鼠出现Thy1.1膨胀爆发+PMEL-1细胞(图1.2G;180.9倍[pmel-1],25.7倍[CD 45.1]+])。脾脏扩张率低于腹股沟淋巴结(附图)。4A,b)。细胞分裂状态和表型分析表明,肿瘤接种与CTX联合应用/CD4导致大多数Thy1.1+Pmel-1细胞快速分裂分化为CD 44+CD62L效应记忆表型2H-j和补充图。4C-g)。这些结果表明,体外诱导的黑色素瘤特异性CD8。+T细胞具有增殖优势,特别是在ctx中。/CD4-经验丰富的抗原-丰富的肿瘤引流淋巴结。值得注意的是,广泛区分CD45.1的比例+细胞(>7分裂,CD 44)+CD62L)在淋巴结和脾脏中增加,而不考虑肿瘤的存在(如图所示)。2H-j和补充图。4C-j).

CTX/CD4提高内源性CD8的效应功能和肿瘤反应性+T细胞

以前的研究已经证明CD4的耗竭+细胞与效应功能的增加、肿瘤的反应性和CD8的瘤内浸润有关。+T细胞3,4,5,7。以确定CTX是否/CD4同样的结果,我们分析了前T细胞和en-T细胞的这些功能特征。3A)。根据同时分泌多种效应细胞因子(干扰素-γ、肿瘤坏死因子、白细胞介素-2,即多功能细胞因子)的细胞比例来评价效应功能。类似于记忆状态分析的结果(如图所示)。2C),CTX之间的前T细胞没有显着性差异。和CTX/CD4组(图1.3B和补充图。5A,b)。高分化的ex-T细胞表现出比en-T细胞更强的多功能反应,而不考虑CD4的存在。。相比之下,ctx中多功能的en-T细胞比例显著升高。/CD4比在CTX两种或两种以上细胞因子表达的细胞频率;CTX=15.88±1.74%,CTX/CD4=55.46±9.16%,平均±SD;p < 0.0001; two-tailed unpaired Student’s t-测试)。

图3:抗CD4后处理增强内源性CD8的肿瘤反应性+T细胞

a实验原理图。注入细胞数:B16-F10,2×105/小鼠;体内外启动Thy1.1+PMEL-1CD8+T(ex-T)细胞,2×106/鼠标。b多功能分析刺激和分析细胞因子的表达,如附图所示。5A,b。用SPICE V6.0绘制饼形图。弧长表示表达相应标记的细胞比例。PIE区域表示表示给定数量的功能标记的细胞所占的比例。n=5只小鼠/组。cCD 25在活化或不加(基底)B16-F10孵育16h的淋巴细胞中表达。d内源性CD8的杀伤效率+检测细胞对B16-F10的杀伤作用。每组4只小鼠的细胞分为三组,每组4只。误差条表示为±SEM。采用双向方差分析和Bonferroni后自评检验,以确定统计学意义。eTCR克隆型分析的Shannon均匀度(归一化Shannon-Wiener指数)。分析α链(左)和tcrβ链(右).CTX, n=3只小鼠;CTX/CD4, n=5只老鼠。误差条表示均值±SD。d, e从附图中分离出的EN-T细胞。3E,f被利用了。fi肿瘤浸润性CD8的特征+T细胞f肿瘤组织实验示意图。注入细胞数:B16-F10,2×106/小鼠;前T细胞,2×106/鼠标。g用流式细胞术测定100例肿瘤组织活细胞中ex-T和en-T细胞的计数。h幼稚比例(CD62L)+CD 44),EM(效应存储器;CD62L)CD 44+)和CM(中央存储器;CD62L)+CD 44+)计算子集。i显示了pd-1在ex-T和en-T细胞中的表达频率.c, gi n=4只小鼠/组。c, e, gi每个符号指示单个鼠标的计算值。水平条表示手段。c, gi双尾未配对学生t-测试。CD4,抗CD4后调节;ctx、环磷酰胺预处理。源数据作为源数据文件提供。

与前T细胞不同的是,在接种肿瘤时,肿瘤反应性的en-T细胞的数量是有限的.CTX后肿瘤反应性的变化/CD4-诱导分化,检测B16-F10暴露后细胞CD 25的表达及杀伤活性。在b16-f10照射后,在两种ctx中均有较高的肿瘤反应性,上调CD 25的表达。和CTX/CD4组(图1.3C和补充图。2E)。值得注意的是,在ctx中,en-T细胞的CD 25-表达率显著升高。/CD4比在CTX提示抗CD4治疗可提高CD8的肿瘤反应性。+T细胞体外杀伤实验的结果进一步证实了这一点,其中ctx的b16-f10杀伤效率。/CD4暴露的en-T细胞高于CTX细胞。-暴露于E-T细胞(如图所示)。三维空间)。有偏倚的T细胞激活改变tcr序列,从而促进某些tcr克隆的扩增和富集。19,20,21。因此,我们对tcr序列的Shannon均匀度进行了分析,这表示了clonotype的均匀分布程度,而较低的值表明一些T细胞克隆优先增殖。21。CTX/CD4组间均匀度明显低于CTX组。组(图1.3E; p=0.03用于TCRα和TCRβ;Mann-WhitneyU-测试),指示某些T细胞克隆类型的富集。

接下来,我们分析了肿瘤内的CD8。+大剂量B16-F10接种小鼠T细胞,建立两种CTX的可测肿瘤体积和CTX/CD4组(图1.3F)。从CTX的效果来看/CD4T细胞增殖和肿瘤反应性的研究(图一)。2F,g3C-E),CTX/CD4癌内前T细胞和en-T细胞浸润增加(见图)。第三代)。表型分析表明CTX/CD4-经验丰富的en-T细胞分化程度较高,pd-1的比例较高。+细胞比CTX-暴露组(图1)。3H,I和补充图。2F,g)。高反应性前T细胞在CTX中的阳性率分别为54.3±26.3%和66.5±7.4%(平均±SD)。和CTX/CD4分别分组。

这些结果表明,使用抗CD4治疗可提高效应细胞功能、肿瘤反应性和肿瘤内源性CD8的浸润。+T细胞在这一ACT组合模型中。

CTX/CD4丰富IL-18RαCD8+T细胞

到目前为止,已经确定的影响ctx术后ACT疗效的因素/CD4包括前T细胞的扩张和En-T细胞的肿瘤反应性增加。为了进一步明确影响目前化疗方案抗肿瘤反应的因素,我们对CD8基因表达谱进行了研究。+T细胞暴露于CTX免疫调节的环境中/CD4。我们使用En-T细胞进行分析(见图)。4A),因为它们表现出比前T细胞更严重的表型/功能改变。在ctx中上调超过两倍的基因中/CD4组与CTX中的比较组(补充资料)121%与T细胞活化、分化和迁移有关(95个基因中有20个;Ccl 1, CCR 4, Ccr6, Ccr8, Cd40lg, EPAS 1, 富特7, Gcnt 1, 格兹姆, ICOS, IFitm 1, IFNG, IL18r1, 拉格斯1, 彭克, 罗拉, RORC, S100a4, 赛玛6d,和蒂吉特),与表型分析的结果一致。2C,d,h-j和补充图。4C-j)。重要的是,CTX/CD4-经验丰富的en-T细胞表现出三倍以上的上调。IFNGIL18r1(无花果)4B),它编码IL-18-IL-18R信号中的关键组件。22,23。蛋白质表达分析表明,在根据IL-18Rα表达水平分组的三个群体中,IL-18Rα。在ctx暴露小鼠中,en-T细胞明显富集。/CD4(无花果)4C).

图4:抗CD4后处理增强IL-18Rα内源性CD8+T细胞
figure4

a实验原理图。注入细胞数:B16-F10,2×105/小鼠;体内外启动Thy1.1+PMEL-1CD8+T(ex-T)细胞,2×106/鼠标。b微阵列分析中的差异表达基因。在ctx中上调(>3倍)的基因/CD4与CTX的比较-有经验的内源性CD8+提示T(en-T)细胞。从附图中分离出的EN-T细胞。3F被利用了。每组共收集5只小鼠的en-T细胞,进行分析。c分析IL-18Rα在En-T细胞中的表达情况。n=5只小鼠/组。双尾未配对学生t-测试。dfIL-18Rα的TCR分布及基因表达谱分析恩-T细胞。d分析物制备原理图。注入细胞数:B16-F10,2×105/小鼠;前T细胞,2×106/鼠标。第25天,IL-18Rα-通过磁性细胞分离分离富集的EN-T细胞。e给出了TCRα链(左)和β链(右)的香农均匀度(归一化香农维纳指数).n=每组3只小鼠。f整个转录组分析。IL-18Rα中上调(3倍以上)的基因-富集的EN-T细胞与EN-T细胞的流通性相比较.n=4只小鼠/组。gEn-T细胞多色流式细胞仪分析。所制备的分析物a用所指示的标记进行染色并进行分析。降维;t-分布式随机邻居嵌入)进行可视化。c, e每个符号表示单个鼠标。水平条表示手段。XCD4,抗CD4后调节;ctx、环磷酰胺预处理。源数据作为源数据文件提供。

接下来,我们通过比较磁富集过高IL-18Rα-表达的细胞与其他细胞在流通性中的差异,分析了细胞的子集特异性特征(图1)。4D)。虽然这两组样本来自同一个CTX/CD4-暴露CD8+T细胞、tcr库分析表明,IL-18Rα的香农均匀度较低。组(图1.4E)。进一步的基因表达分析确定了IL-18Rα的分子特征。EN-T细胞群体(补充数据)2)。我们发现与T细胞活化/分化相关的基因,其中一些基因在ctx中被上调。/CD4-暴露CD8+T细胞(图1.4B),在IL-18Rα中被上调了三次以上。-富集细胞(图1.4F)。此外,上调的基因还包括那些编码先天性T细胞相关标记的基因(Pxdc 1, Hrh4, RORC, Ccr6, Cd40lg,和BLK)和自然杀伤细胞受体(Ncr1, Klrb1b, Klrb1c,和Klrk 1),不仅在典型的tcr依赖刺激后增加,而且通过tcr不依赖/细胞因子介导的T细胞活化(如旁观者激活)而被上调。24,25,26。多维蛋白表达分析定义了IL-18Rα-相关表型特征,以CD 44为特征+CD62LCD49dCXCR 3+T-打赌+(无花果)4G).

IL-18Rα的抗肿瘤活性增强CD8+T细胞是由tcr/IL-18信号转导介导的。

据报道,IL-18信号转导是肿瘤T细胞效应功能的重要调节因子。27。此外,IL-18Rα的患病率较高。+肿瘤中的细胞与较好的预后有关。28。我们研究了IL-18Rα的抗肿瘤潜能。CD8+在CTX暴露小鼠体内富集的T细胞/CD4。CTX/CD4暴露的en-T细胞被归类为IL-18Rα。低层,IL-18Rα,以及IL-18Rα对子集及其多功能进行了评估。在这三组中,IL-18Rα细胞表现出最高的多功能。5A和补充图。5C,d),表明它们的抗肿瘤潜力高于其他两个亚群。

图5:il-18RαCD8+T细胞依赖性抗肿瘤作用是通过TCR/IL-18信号转导介导的.
figure5

aIL-18Rα的多功能低层,IL-18Rα,以及IL-18Rα内源性CD8+计算T(en-T)细胞,如图所示。3B使用补充图中的数据。5C,d。如图所示。4A被利用了。b, cIL-18Rα抗肿瘤作用的评价恩-T细胞。b实验原理图。注入细胞数:B16-F10,2×105/小鼠;体内外启动Thy1.1+PMEL-1CD8+T(ex-T)细胞,2×106/小鼠;从第一次转移小鼠中分离出的en-T细胞,1×106/鼠标。c肿瘤生长一直持续到第32天。肿瘤全期生长曲线和生存期曲线见附图。6a,b。IL-18Rα如附图所示,ENT表示磁富集细胞.3H。误差条表示为±SEM。d如图所示,分析IL-18Rα在前T细胞中的表达。4C。每个符号指示单个鼠标的计算值。水平条表示手段。eIL-18Rα的多功能低层,IL-18Rα,以及IL-18Rα如图所示,计算前T细胞。3B使用补充图中分析的数据。5E,f. d, e如图所示。4A被利用了。f测定细胞因子在培养基中的浓度。分离IL-18Rα低/中和IL-18Rα补充图中的前T细胞。3I与gp 100共培养。25–33-脉冲或非脉冲C57BL/6脾细胞4h,治疗组加入IL-18(30 ng/mL)。来自CTX的集合细胞/CD4-有经验的老鼠(n=5)。生物三胞胎。g, hIL-18Rα抗肿瘤作用的评价前T细胞。g实验原理图。注入细胞数:B16-F10,2×105/小鼠;前T细胞,2×106/小鼠;分离的前T细胞(来自第一转移小鼠),5×105/鼠标。h肿瘤生长一直持续到第32天。肿瘤全期生长曲线和生存期曲线见附图。7a,b。IL-18Rα和IL-18Rα低/中如附图所示,前T平均磁选细胞。3J。误差条表示均值±SD。ikIL-18信号在CTX中的作用评价/CD4养生法。i实验原理图。注入细胞数:B16-F10,2×105/小鼠;前T细胞,2×106/鼠标。肿瘤生长j)和存活率(k)显示。j每条曲线表示单个鼠标。†表示在指定的时间点死亡。活到第80天的老鼠的数量被代表。gk抗IL-18治疗从第4天开始,每周3次,整个疗程。aE,我k n=5只小鼠/组。g, hWT组,n=7只小鼠/组;IL18r1淘汰赛组,n=5只小鼠/组。双尾未配对学生t-测试(d)和双尾对数秩(mantel-Cox)检验(k)测定统计学意义。αIL-18,IL-18中和抗体;αMHC-1,抗MHC-1封闭抗体;CD4,抗CD4后调节;ctx、环磷酰胺预处理;野生型小鼠。源数据作为源数据文件提供。

到目前为止,IL-18Rα恩-T细胞已显示出扭曲的TCR储备(图一)。4E),表达高水平的自然杀伤细胞受体。4F),并且是多功能的(如图所示)。5A)。这些观察提出了两个问题:“IL-18Rα是否存在?在体内有较强的抗肿瘤活性?““主要组织相容性复合体I(MHC I)与TCR之间的相互作用是否具有抗肿瘤作用?”。因此,我们评估了IL-18Rα的体内抗肿瘤活性。从CTX中分离出来的子集/CD4-经验丰富的老鼠。白细胞介素-18Rα的子集效应评价以IL-18Rα的表达为基础,进行细胞集落培养,并将其转入含b16-f10的细胞中。Rag1敲除(KO)小鼠5B和补充图。3H)。从长远来看,IL-18RαEn-T细胞对生存率和肿瘤进展无明显影响(附图).6a,b)。相反,我们在肿瘤抑制方面观察到了子集的弱短期效应(~27天)(如图所示)。5C和补充图。6C)。值得注意的是,用抗MHC I抗体治疗可以消除抑制作用,暗示这一事件是由MHC I与TCRs之间的相互作用介导的,TCRs识别在B16-F10黑色素瘤上表达的抗原。

CTX/CD4治疗创造了一种环境,使en-T细胞容易分化为多功能的IL-18Rα。该子集通过MHCI-TCR相互作用产生短期效应功能.我们假设,前T细胞在ctx中具有与IL-18Rα表达相同的分化。/CD4-诱导环境。有趣的是,CTX/CD4处理丰富了类似的多功能IL-18Rα。CD8+T细胞在前T型人群中的分布(图1)。5D,e和附图。2H5E,f)。响应特定的gp 10025–33肽,IL-18Rα前T细胞分泌的效应细胞因子水平高于IL-18Rα。低/中前T细胞(图1.5F)。值得注意的是,IL-18的加入增强了这一反应,表明IL-18信号在这一亚群的抗肿瘤活性中起着至关重要的作用。为了评价体内抑瘤活性,我们分离了IL-18Rα。CTX前T细胞/CD4-有经验的小鼠,并将其转移至B16-F10-荷瘤C57BL/6小鼠(见图)。5G)。此外,我们还将排序的单元管理到IL18r1Ko小鼠,评价IL-18对转移的IL-18Rα的影响或IL-18Rα低/中前T细胞。如在en-T细胞中观察到的那样(见图)。5C和补充图。6A-c),IL-18Rα在此模型中,前T细胞仅表现出短期效应(~32天)。5H和补充图。7A-c)。IL-18阻断抗体对小鼠的作用减弱,支持体外实验观察到IL-18的作用(图1)。5F)。IL-18Rα低/中前T细胞的抗肿瘤活性低于IL-18Rα。群体与IL-18阻断的IL-18Rα差异不显著(P>0.05)。前T组。值得注意的是,与C57BL/6野生型小鼠相比,IL18r1Ko受体小鼠缺乏IL-18R表达的en-T细胞,其对IL-18Rα转移的影响差异较大。低/中和IL-18Rα前T细胞。然而,在长期分析中,肿瘤抑制率和生存率没有显著差异(补充图).7a,b),意味着IL-18Rα前T细胞本身只具有短期利益,没有连续生成的子集.

CTX/CD4改变了en-T/ex-T细胞的功能形态,增加了IL-18Rα的比例。子集(图)4C5D)。然而,尽管有较高的效应电位,细胞亚群的直接转移在肿瘤抑制中仅表现出短期效应。5C,h和附图。67)。这些结果表明CTX/CD4-诱导环境,持续生成IL-18RαCD8+T细胞,而不是短期存在的细胞,推动了ctx强烈的抗肿瘤反应。/ACT/CD4-经验丰富的老鼠(图1.1C,d)。因此,我们研究了ctx的抗肿瘤作用。/ACT/CD4-通过阻断IL-18信号,长期诱导环境,这在IL-18Rα的功能中起着至关重要的作用。CD8+T细胞在体外和体内(图1)。5F,h). IL18r1Ko小鼠(在受体小鼠细胞中不存在IL-18信号,而在转移的前T细胞中完整)或IL-18中和抗体(阻断IL-18信号)被用来阻断IL-18 Rα的功能。EN-T或EN-T/Ex-T细胞(图1)。5I)。使用IL18r1Ko小鼠和抗IL-18治疗对ctx的肿瘤生长和存活均无显著影响。-有经验的团体(WT-CTX)、WT-CTX+αIL-18,IL18r1高CTX;图1.5J,k),其IL-18Rα的比例较低。T细胞重要的是,CTX/CD4各组对IL-18信号的内源性细胞限制和全细胞阻断的结果进行了对比分析.抗IL-18治疗可明显降低CTX的抑瘤率和生存率。/CD4-经验丰富的C57BL/6野生型小鼠。然而,CTX/CD4-经验丰富IL18r1Ko小鼠与c57bl/6野生型小鼠具有相似的治疗作用,提示高肿瘤特异性IL-18Rα具有抗黑色素瘤作用。前T细胞超过IL-18Rα细胞恩-T细胞。这些数据表明CTX/CD4诱导持续产生抑制肿瘤的IL-18Rα的环境CD8+T细胞在TCR和IL-18信号转导中发挥较强的效应作用.

CTX中的各种因素/CD4协同诱导IL-18RαCD8+T细胞

确定调节肿瘤抑制性IL-18Rα生成的变量。除T细胞外,我们还评估了影响目前治疗方案的因素的作用,并评估了各因素的作用。我们用各种因子消减方案(肿瘤存在,ctx)治疗小鼠。,前T细胞转移,IL-2和CD4并分析IL-18Rα比值和数量的变化。细胞在第25天(相同的实验方案如图所示。4A)。此外,反IL-18,IL18r1高,Foxp 3DTR,和Rag1并对Ko小鼠进行分析,以探讨IL-18信号转导、调节性T细胞(Treg)耗竭和永久性淋巴细胞减少的作用.清除CTX,IL-2和CD4显著降低IL-18Rα的频率和数量。前T细胞(图1.6a,b)。值得注意的是,IL-18RαTreg耗竭小鼠的频率与CD4耗竭小鼠的频率相似,说明Treg在形成这种环境中的重要性。然而,IL-18信号传导中断或Treg耗尽降低了IL-18Rα的绝对计数。前T细胞与对照组比较(图1)。6B)。在变量中,IL-18Rα的比值。CTX对en-T细胞亚群的影响和CD4(补充图。8A)。IL-18Rα的绝对计数En-T细胞强烈依赖于淋巴细胞减少的程度,这可能是由于起始点的总E-T细胞数的变化(补充图)。8B,c)。令人惊讶的是,Rag1Ko小鼠的IL-18Rα频率最高。外T细胞,提示淋巴细胞开放状态是产生IL-18Rα的重要因素。前T细胞。通过评估淋巴细胞减少程度与IL-18Rα比值之间的关系,证实了这一点。前T细胞。IL-18Rα的频率前T细胞与淋巴细胞减少程度密切相关(如图所示)。6C)。与前T细胞相比,E-T细胞具有更复杂的变量(启动、再繁殖),二者之间没有显着的相关性(补充图)。8D).

图6:影响IL-18Rα的各种因素CTX细胞的产生/CD4-诱导环境。
figure6

ac导致IL-18Rα的变量的评估细胞生成。完全的治疗方法(如图中所示)。4A)或将缺少每个变量的改良方案应用于小鼠(n=每组5只)。在第25天,比率(a)和数字(b)的IL-18RαThy1.1+PMEL-1CD8+对淋巴组织中的T(ex-T)细胞进行分析。c淋巴细胞减少评分(以脾细胞总数(−log)和肿瘤引流淋巴结计数为代表)与IL-18Rα比例的相关性评估前T细胞。dfCTX单细胞转录组分析的可视化和CTX/CD4-有经验的前T细胞。收集各组4只小鼠的细胞,并进行分析。d在无监督聚类后,将前T细胞投影到二维空间。t-分布式随机邻居嵌入(t-SNE)。与组、组和IL18r1表达式显示。e列出了与第6组差异表达的基因。f所示基因的对数归一化转录水平。g, h白细胞介素-7信号对IL-18Rα影响的评价CD8+T细胞生成。g实验原理图。注入细胞数:B16-F10,2×105/小鼠;前T细胞,2×106/鼠标。治疗组自第10~14天起,每日给予非溶Fc融合IL-7(IL-7-FC)治疗.h具有代表性的数据、比率和IL-18Rα的数量。显示前T细胞。a, b, hn=5只小鼠/组。每个符号指示单个鼠标的计算值。水平条表示手段。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; one-way ANOVA with the Dunnett’s post hoc test (a, b第一组为对照组),两尾Spearman秩相关(c),和双尾未配对学生的t-测试(h)测定统计学意义。αIL-18,IL-18中和抗体;CD4,抗CD4后调节;ctx、环磷酰胺预处理;DT、白喉毒素;WT野生型小鼠。源数据作为源数据文件提供。

更详细地了解CTX引起的变化/CD4,我们对淋巴样细胞进行了单细胞转录组分析。我们评估了不同方案间差异丰富的细胞簇(Ctx)。和CTX/CD4)并在已鉴定的聚类间差异表达基因。在整个淋巴样细胞的宏观图像中,CD4的加入特异性感染CD4+T细胞(附图)9A),而在其他专题组中没有观察到重大变化。接下来,我们对en-T和ex-T细胞进行了单细胞转录组分析,以确定CD8的基因表达谱。+CTX暴露T细胞/CD4。与CTX相比CTX集团/CD4-经验丰富的en-T细胞和前T细胞有更大的集群大小,表达水平较高的IL18r1(无花果)6d和补充图。9B)。与先前的结果一致(如图所示)。4F),这些簇也显示了在IL-18Rα中高表达的几个基因的优势表达。-富集的EN-T细胞(图1.6E和补充图。9C)。在淋巴管开放的情况下,各种细胞因子信号被放大29,30,31,是产生IL-18Rα的关键因素。-富集的前T细胞(图1.6A-c),我们假设CTX的细胞因子提示/CD4淋巴环境对IL-18Rα扩增的影响前T细胞。因此,我们确定了与稳态/炎性细胞因子受体相关的基因表达水平。有趣的是,细胞团簇IL18r1水平也表现出更高的表达Il7r相比较Il12rb1, IL12rb2, Il15ra,和IL21r(无花果)6f和补充图。9d),这意味着IL-7信号可以影响IL-18Rα。细胞生成。为了验证这一点,在当前的ctx中引入了IL-7-fc治疗。/CD4方案(图1.6g)。值得注意的是,IL-7信号的放大大大增加了IL-18Rα的数量和比率。EN-T和Ex-T细胞(图1)。六小时和补充图。10).

总之,这些结果表明CTX/CD4-创造淋巴管开放状态,包括放大处于稳态状态的IL-7信号,增加IL-18Rα。CD8+T细胞亚群。

讨论

行为的有效性常常受到免疫抑制因素的限制(例如,Tregs和骨髓源性抑制细胞)。32,33。为了解决这一问题,患者接受适当的预处理和/或后调理方案治疗。预处理包括辐射和化学物质的调节,它们会导致淋巴耗竭,从而消除消耗掉的细胞因子汇和免疫抑制细胞。12,13,14。这一过程也为前T细胞的稳态扩张创造了“空间”。34,35。此外,后适应还补充了支持性元素(例如,稳态细胞因子),使前T细胞长期持续存在。36,37。在本研究中,我们设计了ctx。/CD4,一种暂时耗尽CD4的方案+CTX诱导的全身淋巴耗竭后的细胞。小鼠抗B16-F10黑色素瘤模型/CD4通过促进体外T细胞增殖和细胞分化,增强抗肿瘤作用。值得注意的是,CTX/CD4-暴露前T细胞和en-T细胞可提高IL-18Rα的频率。该细胞具有较高的多功能,在体内表现出TCR/IL-18信号依赖性的抗肿瘤活性.尽管IL-18Rα的短期效应CD8+T细胞过继转移实验/CD4-创建环境,它持续生成IL-18Rα以IL-18信号依赖的方式激发出深刻的抗肿瘤效应.我们还发现IL-18RαCD8+T细胞的产生与ctx的存在密切相关。和CD4,或淋巴开放环境,如Rag1小老鼠。单细胞转录组分析和随后的实验表明,IL-7信号的扩增对增加IL-18Rα是至关重要的。前T细胞和en-T细胞。

抗CD4-消耗抗体在癌症中的治疗作用,尤其是通过减少Tregs,是众所周知的。5,15。AS Tregs抑制效应T细胞的功能和增殖38,CD4+Treg耗竭增加肿瘤反应性和CD8的瘤内浸润+T细胞3,4,5。在本研究中,我们发现抗CD4治疗联合act和ctx。,增强IL-18Rα的抗黑色素瘤疗效。CD8+T细胞值得注意的是,ACT(即,ex-T)和抗CD4之间的协同作用在本研究中至关重要,因为去除前T损害了治疗效果(图1)。1C-f)。Ctx的强劲抗肿瘤反应进一步证实了这一点。/CD4-经验丰富IL18r1Ko小鼠(图1.5J,k),其中高功能的IL-18Rα子集仅存在于前T细胞中,而不存在于en-T细胞中.有趣的是,Tregs的消耗,而不是整个CD4+细胞,也增加了IL-18Rα。前T细胞频率(图)。6A)。然而,Treg耗竭的治疗效果被其副作用所掩盖。Treg-耗竭小鼠(白喉毒素(DT)治疗)Foxp 3DTR)出现典型的自身免疫症状,一个月内死亡(附图)。11),正如在其他研究中所观察到的那样39,40。相反,在本研究中使用的方案(每周治疗抗CD4)并没有引起任何自身免疫症状,而抗肿瘤反应被保留。这可能是由于Tregs的Th亚群被侧支移除所致,因为Th1、Th9和Th17在自身免疫性疾病中起着重要的作用。41,42。其中之一是肿瘤抑制性CD4的消除。+T细胞,因为这些细胞在直接抑制肿瘤和T细胞记忆形成中的作用是众所周知的。43,44,45,46,47,48。所有这些影响都被ctx消除了。/CD4本研究的养生方案。今后应考虑CD4耗竭的最佳水平和持续时间,以便通过平衡这些因素来最大限度地提高治疗效果。

本研究探讨了CTX的抗肿瘤作用。/CD4-经验丰富的小鼠很大程度上归因于IL-18Rα。CD8+子集。这与先前的研究所观察到的IL-18Rα增强的效应功能相一致。CD8+T细胞在感染与癌症中的作用28,49。我们发现IL-18Rα子集具有高度分化的效应者轮廓和倾斜的TCR储备(图)。4E,f)。尽管有短期效应功能,但细胞亚群是多功能的,需要TCR-MHC I相互作用才能发挥抗肿瘤作用(如图所示)。5A,c,e,f)。值得注意的是,IL-18信号在tcr介导的IL-18Rα效应功能中起着至关重要的作用。体外和体内外T细胞。5F,h,j,k)。就CTX而言-经验丰富的小鼠,其产生IL-18Rα的能力较低。白细胞介素-18信号通路的抑制对肿瘤的抗肿瘤活性无明显影响。5J,k)。总之,IL-18RαCD8+T细胞是肿瘤特异性细胞,作为短期效应细胞在ctx下驱动IL-18依赖的治疗效果。/CD4.

本研究的意义在于CTX的设计。/CD4为有效的ACT创造有利环境的方案。抗CD4治疗联合ctx,增加了IL-18Rα的频率。前T细胞和en-T细胞(图1)。6A和补充图。8A)。我们还发现淋巴细胞减少程度与IL-18Rα的比例密切相关。前T细胞(图1.6C)。考虑到Napolitano等人。29以及Malaspina等人。50报告携带人类免疫缺陷病毒1的宿主IL-7水平升高,并显示出特发性CD4+T细胞减少,CTX有可能/CD4诱导的IL-7丰度对IL-18Rα有贡献细胞生成。这在本研究中得到证实,表明IL-7-fc显著增加了IL-18Rα。表达水平较高的细胞群体Il7r(无花果)6f,h和附图。9d10)。此外,CTX/CD4此外,还通过丰富的IL-18信号来促进细胞的功能,因为在淋巴开放的宿主中,促炎症细胞因子(如稳态细胞因子)也是丰富的。29,30,31,50。因此,CTX/CD4参与了IL-18Rα的生成和功能。通过增强的稳态和促炎症信号的子集。总的来说,CTX的优点/CD4正如它的作用机制所预期的那样,它可以应用于任何类型的ACT(例如,分类的CD8)。+T细胞、TILs、TCR工程T细胞和CART)。然而,这一效应仅在小鼠黑色素瘤模型中得到评价,这是本研究的一个局限性。进一步研究其他肿瘤模型并将其转化为人类环境将为制定安全有效的ACT策略铺平道路。


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