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基因干扰-铁下垂疗法治疗癌症

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发表时间:2021-09-13 09:24作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

虽然已经有了一些有效的治疗癌症的方法,但由于其耐药和患者的低反应,它仍然对人类的健康和生命构成极大的威胁。在这里,我们开发了铁纳米粒子和癌症特异性基因干扰相结合的铁下垂疗法。两个铁代谢基因的表达FPNLcn 2)在癌细胞中被Cas13a或NF-κB特异性启动子控制的微RNA选择性地敲除。同时用铁纳米粒子处理细胞。结果,在多种癌细胞中,出现了明显的铁下垂现象。然而,同样的处理对正常细胞几乎没有影响。通过腺相关病毒和铁纳米粒基因的转移,在小鼠体内获得了明显的抑瘤作用和持久的治疗效果。在这项工作中,我们展示了一种基于基因干扰的癌症治疗--增强的铁下垂.

导言

虽然已经有了一些有效的治疗癌症的方法,但由于其耐药和患者的低反应,它仍然对人类的健康和生命构成极大的威胁。因此,通过细胞凋亡、坏死、坏死、死亡和上睑下垂等一种细胞死亡形式,已经开发出多种癌症治疗方法来诱导癌细胞死亡。1。近年来,铁下垂作为细胞死亡的另一种形式引起了越来越多的关注。2012年,铁下垂被确认为一种铁依赖性的非凋亡细胞死亡。2。随后发现铁催化的脂质过氧化是由非酶促(fenton反应)和酶机制[脂氧合酶(Lox)]引起的。3。在前一种情况下,由铁(Fe)之间的Fenton反应直接生成羟基自由基。2+)和过氧化氢引发非酶脂质过氧化4,5.

摘要铁下垂自发现以来,由于其作为新的抗癌药物靶点的潜在作用,引起了广泛的关注。6,7,8。由于铁下垂是一种受调节的细胞死亡,免疫系统可能部分通过铁下垂来防止肿瘤的发生。9。更有趣的是,铁下垂可以以波状的方式在细胞间繁殖,对邻近的细胞有很强的杀伤作用。10,11,12。铁下垂的另一个吸引人的地方是它克服耐药的潜力,例如化学耐药。13,14,15,16,17,18,19,并改进癌症免疫治疗20。因此,铁下垂的抗肿瘤作用在各种癌症中得到了迅速而广泛的研究。21。然而,这些研究大多集中在寻找抑制或消耗系统x的化合物的各种铁吞诱导剂上。c、Gpx 4和CoQ 1022。这些化合物可能受到与传统癌症药物同样的抗药性问题的挑战。20。例如,在erastin诱导的铁下垂中,ireb 2被确认为一个高置信度基因,但当reb 2被沉默时,铁代谢相关基因的表达会发生变化,从而使细胞对铁下垂产生抵抗力。2,23,24.

目前,氧化铁纳米粒子(IONPs)已被成功地用作肿瘤诊断和贫血治疗的MRI对比剂。25,26,27。然而,IONPs尚未用于癌症治疗。尽管如此,许多研究表明IONPs能释放铁(Fe)。2+)或铁(铁)3+)细胞中的酸性溶酶体。释放铁2+参与Fenton反应,产生活性氧(ROS)之一--毒性羟基自由基(·OH),诱导癌细胞萎缩。11,28,29。因此,由铁下垂驱动的纳米治疗技术对癌症的治疗变得越来越有吸引力。30。此外,我们还发现纳米粒子诱导的癌细胞铁吞作用在一个传播波中消除了所有相邻的细胞。10。然而,细胞对铁的浓度很敏感,浓度的微小波动会引起很大的反应。31。由于铁对细胞的重要性,细胞已经进化出一套维持细胞内铁稳态的机制。32。因此,细胞内的铁处于微妙的调节之下,以保持铁的稳态。33,34,35。因此,细胞能够有效地储存和输出从内化的IONPs释放出的细胞内多余的铁离子。例如,在先前的研究中,我们发现在dmsa包被的铁处理的细胞中,负责输出胞内铁离子的重要基因的转录有明显的上调。3O4纳米粒子36。因此,单一的IONPs治疗引起的铁下垂太少,无法在临床上用于治疗癌症。

最近,一项有趣的研究报告了一种由IONPs引起的铁下垂,这种现象由于基因的改变而增强.在本研究中,我们发现纳米铁补充剂--阿魏酚在体外和体内对低水平fpn的白血病细胞具有抗白血病作用。33。这种抗肿瘤作用是由于白血病细胞不能输出胞内铁所致。2+由ferumoxytol产生,使白血病细胞的类型易受Fe所产生的ROS升高的影响。2+通过芬顿反应。然而,这项研究依赖于罕见的自然发生的低表达的铁吞相关基因,如FPN如何人为地降低这些基因在肿瘤中的表达,使这种IONPs诱导的下垂治疗可应用于更广泛的癌症。

核因子-κB(NF-κB)是一种序列特异性的dna结合转录因子,在几乎所有癌症中都被过度激活。37,38。因此,为了使蛋白失活,我们设计了一种能表达针对NF-κB的人工微RNA的基因表达载体。雷拉/P65在NF-κB特异性启动子的控制下39。该启动子由NF-κB诱饵序列和最小启动子组成,其转录激活活性依赖于细胞内NF-κB的活性。39。因此,我们把它命名为DMP,意思是诱饵-最小启动子。我们先前的结果证实,dmp可以通过依赖于癌细胞中NF-κB过度活性来实现癌细胞特异性基因的表达。40,41。利用该启动子,我们开发了两种肿瘤基因治疗方法。一种是肿瘤细胞表面显示的人工肿瘤抗原诱导的肿瘤免疫治疗。40。另一种是通过CRISPR/Cas9切割端粒或通过Cas13a的致癌mRNAs诱导肿瘤基因治疗。41,42。在这些研究中,我们成功地通过DMP启动子控制肿瘤细胞中新抗原和Cas9或Cas13a的表达。

在上述研究的基础上,我们推断,抑制细胞内铁离子输出的基因对IONPs处理的癌细胞是致命的,因为这种抑制会阻止细胞输出IONPs产生的铁离子,从而增强IONPs诱导的铁离子的吞噬作用。在此基础上,我们将dmp控制的基因干扰工具与dmsa包被的铁结合起来,研制出一种名为基因干扰-铁下垂治疗的癌症治疗方法。3O4纳米粒子(FeNP)通过专门敲除两个铁代谢基因的表达,FPNLcn 2,随着DMP控制的CRISPR/Cas13a和微RNA(MiRNA)在癌细胞中的应用,FeNP治疗引起了多种代表血液学和实体肿瘤的癌细胞的急剧萎缩。然而,该疗法对正常细胞影响不大。同时使用病毒(腺病毒相关病毒,AAV)和非病毒(PEI-修饰的Fe)。3O4纳米粒、FeNC载体、异种移植瘤在小鼠体内的生长也受到明显抑制。

结果和讨论

礼品的概念化

赠与的原理如图所示。1A。GAT由一个基因干扰载体(GIV)和FeNP组成。GIV由一个名为DMP的启动子和下游效应基因组成。DMP是一个NF-κB特异性启动子,由NF-κB诱饵和最小启动子组成。1B)。由于NF-κB是一种在肿瘤中广泛过度激活的转录因子,因此NF-κB与肿瘤细胞的结合可激活效应基因的表达。1A)。相反,由于缺乏NF-κB,效应基因不能在正常细胞中表达。1A)。因此,DMP是癌细胞特异性的启动子.将DMP控制的CRISPR/Cas13a或miRNA的GIV转染癌细胞后,可以表达Cas13a或miRNA。表达的Cas13a蛋白可与U6启动子转录的引导RNA(GRNA)结合形成Cas13a-gRNA复合物。表达的miRNA可与RNA诱导的沉默复合物(RISC)相关联.Cas13a-gRNA和miRNA-RISC复合物均能靶向靶基因mRNA,从而降低肿瘤细胞中靶基因的表达。

图1:GAT原理和NF-κB在变异细胞中的表达示意图.
figure1

a基于CRISPR/Cas13a和miRNA的礼品示意图。Dcug dmp-Cas13a-u6-gRNA,dm dmp-miRNA,u6p u6启动子,gRNA引导RNA,dmf-κB诱饵-最小启动子,Fe3O4NP Fe3O4纳米粒子bDMP和NF-κB二聚体的原理图显示。c荧光定量PCR检测NF-κB雷拉/P65在不同细胞中的表达(n=3个生物独立样本)。通过对癌细胞与正常细胞数据的比较,得出其统计学意义。数据以均值±标准差(SD)表示,用TUKEY检验进行单因素方差分析.

在这项研究中,我们选择了两个与铁代谢相关的基因,FPNLcn 2,作为目标基因。两者的功能FPNLcn 2细胞内与铁离子的流出有关43,44,45,46,47,48。在我们之前的研究中,我们发现在Fenp处理细胞时,这两个基因的表达显著上调。36。因此,我们推测,DMP控制的CRISPR/Cas13a或miRNA转染的基因在癌细胞中的表达下调将阻止细胞输出内化的FeNP产生的胞内铁离子。这会导致铁离子的积累,导致细胞内活性氧水平的显著升高,从而导致癌细胞的铁吞作用。在正常细胞中,由于无法产生Cas13a或miRNA,这两种基因的表达不会受到影响,从而使正常细胞能够主动输出FeNP产生的胞内铁离子,维持铁的稳态,而FeNP处理对此影响不大。

NF-κB受体在不同细胞中的表达

NF-κB在几乎所有类型的肿瘤细胞中被广泛激活.然而,它在癌细胞中的表达是不一样的。49,50。因为细胞内NF-κB活性对我们的策略至关重要。因此,我们首先检测到NF-κB的表达。雷拉/P653株白血病细胞系(KG-1a、HL 60和WEHI-3)、16株实体瘤细胞系和7株正常细胞系(HL 7702、MRC-5、HMEC-1、NIH-3T3、L 929、GES-1和MCF12A)。结果表明,NF-κB雷拉/P65在所有癌细胞中都有不同程度的高表达,但并非所有正常细胞都有不同程度的高表达(图一)。1C)。因此,dmp应该驱动癌细胞特异性基因的表达.

FeNP对细胞活力的影响

评价4°C长期贮存稳定的FeNP的细胞毒性(附图)。1A我们动态测定了三种白血病细胞、一种实体肿瘤细胞(HepG 2)和两种不同浓度FeNP作用5d的正常人细胞的细胞活力。结果表明,在50μg/mL剂量以下,FeNP对所有细胞均无明显的毒性作用(附图)。1B)。但当剂量大于50μg/mL时,对包括正常细胞在内的所有细胞均有明显的毒性作用(附图)。1B)。因此,我们使用50μg/mL的fnp进行后续的研究,这相当于在啮齿动物体内静脉注射3mg/kg的剂量。33.

GAT体外抗肿瘤作用的研究

为了研究GAT的抗肿瘤作用,我们首先用GAT治疗白血病细胞。用不同质粒载体转染人白血病细胞(KG-1a),然后用FeNP处理。用吖啶橙和溴化乙锭(AO&EB)双染法在三个时间点检测细胞活力。结果表明,只有所有giv与FeNP的组合才能引起明显的时间依赖性细胞死亡(图一)。2A和补充图。2)。所有质粒和FeNP单独及阴性对照质粒(pDCUg-NT和PDM-NT)与FeNP的组合对细胞活力无显著影响(附图)。2)。特别是与FeNP联合应用时,GIVs(pDCUg-FL和PDM-FL)共同表达的肿瘤细胞杀伤作用最为显著。2),表明共同干扰两个基因的协同效应。GAT在人实体肿瘤细胞HepG 2上观察到了同样的效应(图2)。2A和补充图。3).

图2:肿瘤及正常细胞的治疗。

a, b细胞活力的检测。细胞(KG1a,HepG 2,HL 7702,MRC 5)经AO和EB染色,并进行图像观察。a),图像用ImageJ(b) (n=3张独立显微照片)。标尺a仅用pDCUg-FL、PDM-FL、pDCUg-NT和PDM-NT联合FeNP处理72h的细胞图像和量化数据。其他试剂作为更多控制剂处理的这些细胞的代表性图像和数据显示在补充图中。2, 3, 20, 21, 28,29。所有其他22个细胞系的图像和量化数据显示在补充图中。4192229. c侦测细胞死亡(n=3个生物独立样本)。有代表性的流式细胞仪图像显示在补充图中。3031。这里只显示了四个细胞(KG1a、HepG 2、HL 7702和MRC 5)的数据。其他两个细胞(HL 60和WEHI-3)的数据见附图.32。数据以均值±SD表示,用TUKEY‘s检验进行单因素方差分析.使用的质粒如下:pDCUg为pdmp-Cas13a-u6-gRNA;pdm为pdmp-miRNA;pdcug-F和pdm-f为靶标。FPNPDCUg-L和PDM-L靶标Lcn 2;pDCUg-FL和pdm-FL都是目标。FPNLcn 2;pDCUg-NT和PDM-NT目标无转录本。b, c使用同一组符号。

为了研究GAT对人和小鼠不同白血病和实体肿瘤细胞的杀伤作用,我们用共表达的giv(pDCUg-FL和-FL)对2种白血病细胞(HL 60和WEHI-3)和14种实体肿瘤细胞(A 549、HT-29、PANC-1、SKOV 3、MDA-MB-453、C-33A、BGC-823、SGC-7901、MGC-803、KYSE 450、KYSE 510、B16F10、Hepa 1-6和CT-26)的杀伤作用进行了研究。结果表明,两个GVS与FeNP的组合对所有肿瘤细胞均有明显的时间依赖性杀伤作用(附图)。419)。同样,单独的载体和FeNP以及阴性对照质粒(pDCUg-NT和PDM-NT)与FeNP的组合在任何时间对所有细胞都没有显著影响(补充图)。419).

为了研究GAT的癌细胞特异性,我们接下来对7个正常人和小鼠细胞(HL 7702、MRC 5、GES-1、HMEC-1、L 929、MCF12A和NIH-3T3)进行了治疗。结果表明,所有载体及其与FeNP的组合对这些细胞均无显著影响。2A和附图。2026,这与NF-κB在这些细胞中的低表达是一致的。1C)。为了进一步验证NF-κB激活在GAT中的关键作用,我们将pDCUg-FL和PDM-FL分别转染这些细胞,然后用NF-κB激活剂TNF-α诱导。然后用FeNP处理细胞。我们发现肿瘤坏死因子-α诱导剂对这些细胞也有明显的杀伤作用。2A和附图。2026)。这证实,只有NF-κB被激活时,GAT才能杀死细胞,用GAT处理HEK-293 T细胞也证实了这一点。HEK-293 T细胞是一种转染病毒后表达大T抗原的人胚胎肾细胞。虽然该细胞不被认为是癌细胞,但它的NF-κB表达被显著激活(如图所示)。1C)。因此,在这个细胞中可以看到与癌细胞相同的礼物效应(补充图)。27).

为了进一步研究不同处理下的细胞活力,我们用ImageJ对AO和EB染色图像中的活细胞数进行了计数,并用GraphPad进行了统计学意义的鉴定。结果表明,只有所有giv与FeNP的结合才能引起明显的时间依赖性癌细胞死亡(图一)。2B和附图。2829)。经72h处理后,几乎没有细胞存活,说明GAT对癌细胞有较强的杀伤作用。通过检测细胞死亡,进一步证实了该细胞的活性,这也揭示了GITE导致癌细胞死亡的效率和特异性(图1)。2C和附图。3032)。死亡检测还显示了共同干扰两个基因的协同效应(图一)。2C和附图。3032).

为了评价dmp-Cas13a/u6-gRNA(DCUg)和dmp-miR(DM)系统的干扰作用,我们检测了FPNLcn 2细胞中的基因。结果表明,这两种基因的表达在两种mRNA上均有明显的下调(图二)。3A)和蛋白质。3B)所有检测到的癌细胞(KG-1a、HL-60和HepG 2)的靶向gRNAs/miRNAs水平。然而,HL 7702细胞未见明显变化,进一步表明所设计的基因干扰系统具有癌细胞特异性。为了进一步探讨效应基因在癌细胞中的特异性表达,我们检测了肿瘤细胞中Cas13a mRNA的表达。结果表明,Cas13a仅在pDCUg载体作用下的所有癌细胞中表达。3A).

图3:基因表达,活性氧生成和铁含量的礼品处理细胞.
figure3

用质粒载体转染细胞,培养24h,用50μg/mL的FeNP孵育。在给药后48h检测细胞的基因表达、活性氧生成和铁含量。aMRNA表达的qPCR分析。b蛋白质表达的westernblot分析。样品在相同的印迹上运行。给出了具有代表性的图像和量化的光密度图。cROS水平的测量。给出了荧光位移和定量荧光强度。任意单位。d铁含量的测定c, d只显示四个细胞系(KG1a、HepG 2、HL 7702和MRC 5)的数据。流式细胞术检测ROS的典型图像如附图所示。33。其他两个细胞(HL 60和WEHI-1)的ROS和铁含量的检测结果见附图。34. c, d使用同一组符号。数据以平均值±SD表示(n=3份不依赖生物的样本),用图基试验进行单因素方差分析。

铁下垂抗肿瘤礼物

据报道,铁基纳米材料可以通过芬顿反应上调ros水平。28。为了研究FeNP处理细胞中是否产生ROS,我们测定了4个细胞在不同处理下的ROS水平。结果表明,GVS与FeNP的结合导致所有癌细胞的ROS水平最高(图1)。3C和附图。3334a)。然而,单用FeNP和阴性对照载体与FeNP的组合只会使所有癌细胞中的ROS略有增加(图1)。3C和附图。3334a)。相反,所有相同的处理只导致两个正常细胞(HL 7702和MRC 5)中的ROS略有增加(图5)。3C和附图。3334a)。然而,当肿瘤坏死因子(α)诱导两个正常细胞时,GVS与FeNP的结合会立即导致两个正常细胞的ROS水平升高(如图所示)。3C和补充图。33).

为了进一步证实ROS的起源,我们接下来测量了处理细胞中的铁含量。结果表明,四种肿瘤细胞在FeNP和GIVS联合作用下,细胞内铁含量均显著升高(图1)。三维空间和补充图。34B)。然而,单用FeNP和负控制载体与FeNP的组合只会导致铁含量的有限增加(如图所示)。三维空间和补充图。34B)。同样,当肿瘤坏死因子α诱导两种正常细胞时,GVS与FeNP的组合可显著提高两个正常细胞的铁含量(如图所示)。三维空间)。这些数据与接受相同治疗的四种癌细胞的ROS水平一致。这些数据还表明,铁水流出物被击倒后受到了明显的抑制。FPNLcn 2在癌细胞中(如图所示)。3A,b),从而导致细胞内活性氧和铁含量的大幅度增加(图一)。3C,d).

为了证实GAT的作用机制是铁下垂,我们接下来在多种抑制剂的存在下用GAT治疗HepG 2细胞,包括铁吞抑制剂(铁他汀-1,Fer-1;Liproxstatin-1,Lipro-1),铁螯合剂(去铁胺,DFO),半胱氨酸的细胞通透性类似物(Fer-1,Lipro-1)。N-乙酰半胱氨酸(NAC)、凋亡抑制因子(zVAD-FMK、zVAD)、坏死抑制物(坏死抑素-1s、Nec1s)、自噬抑制剂(Bafilomycin A1,BA1)。用细胞效价-Glo2.0法检测细胞活力。结果表明,GAT处理显著降低了细胞活力(图1)。4A)。用Fer1、Lipro-1、DFO和NAC处理细胞可明显降低GAT诱导的细胞死亡,而细胞凋亡抑制因子、坏死抑制物或自噬作用对细胞死亡影响不大(图一)。4A)。此外,与Fer 1、DFO和NAC(FDN)共处理的细胞存活率最显著。4A)。MDA-MB-453、CT-26、KG-1a、PANC1和WEHI-3细胞以及肿瘤坏死因子α诱导的正常细胞HMEC-1和MRC-5也得到了类似的结果。35).

图4:巨噬细胞由铁下垂引起的死亡。
figure4

转染不同质粒,培养24h,与FeNP共孵育48h。a细胞活力用细胞效价-Glo2.0试剂检测细胞活力。n=3个生物独立样本)。这里只显示了HepG 2细胞的结果。其他七种细胞系的结果见附图。35. b脂质ROS显像用C11-BODIPY法检测脂质ROS的生成,荧光显微镜观察脂质ROS的生成.标度棒,50μm。这里只显示了代表图像的HepG 2细胞处理的PDM-FL+FeNP和各种抑制剂。所有不同处理下的所有八种细胞系的代表性图像如图所示。3643。蓝色,细胞核;红色,还原染料;绿色,氧化染料。c脂质ROS定量用ImageJ软件分析细胞图像,计算590~510通道的光强比。n=3张独立显微照片)。这里只显示了HepG 2细胞的结果。其他七种细胞系的结果见附图所示。44. d, e菌落形成dHepG 2细胞的典型图像。四个细胞系的所有图像都在附图中显示。45(HepG 2和MDA-MB-453)和46(CT-26和PANC 1)。e两种细胞(HepG 2和MDA-MB-453)集落形成的定量数据n=3个生物独立样本)。其他两种细胞(CT-26和PANC 1)集落形成的定量数据见附图。46。每次治疗分为三组。Lip Lipofectamine,Fer1 Ferrostatin-1(1M),Lipro1 Liproxstatin-1(1M),DFO去铁胺(100 M),NACN-乙酰半胱氨酸(1mm)、zVAD-FMK(50μM)、Nec1s坏死抑素-1S(10 M)、BA1 Bafilomycin A1(1 NM)、Fr 1、DFO和NAC共孵育。数据以均值±SD表示,用TUKEY‘s检验进行单因素方差分析.

为了进一步证实GAT的作用机制是铁下垂,接下来我们使用脂质氧化指示剂C11-BODIPY检测脂质ROS(铁下垂的一个标志)。结果发现,只有GAT处理能显着地诱导HepG 2细胞的脂质ROS(如图所示)。4B,c和补充图。36)。此外,Fer 1、Lipro-1、DFO和NAC可恢复脂质ROS的增加,而zVAD、Nec1s和BA1则不能恢复。4B,c和补充图。36)。此外,与Fer1,DFO和NAC(FDN)共处理最强烈地恢复礼物诱导的脂质ROS(如图所示)。4B,c和补充图。36)。MDA-MB-453、KG-1a、WEHI-3、PANC 1、CT-26和α诱导的正常细胞MRC-5和HMEC-1(补充图1)也得到了类似的结果。3744)。四种细胞株(HepG 2、MDA-453、CT-26和PANC 1)的集落形成试验表明,GAT处理可几乎消除各种肿瘤细胞的集落形成能力,而Fer 1和Fer 1、DFO和NAC(FDN)共处理可使部分细胞恢复。4D,e和附图。4546)。这些结果表明,GAT的作用机制是设计的基因干扰下的铁下垂。

基于病毒的礼品体内抗肿瘤研究

为了探讨GAT在体内的抗肿瘤作用,我们将其克隆到AAV中,制备重组病毒(RAAV)。通过转染三种细胞(KG-1a、WEHI-3和HL 7702)检测rAAV。结果表明,基因干扰rAAV(rAAV-DCUg-FL和rAAV-DM-FL)与FeNP的结合,可导致两种癌细胞的死亡(附图)。47)。然而,所有rAAV和FeNP单独及阴性对照rAAV(rAAV-DCUg-NT和rAAV-DM-NT)与FeNP的组合对所有癌细胞的生长均无明显影响(附图)。47)。在人正常细胞HL 7702中,所有处理均未引起明显的细胞死亡(附图)。47).

为了研究GAT在体内的抗肿瘤作用,我们接下来用GAT对肿瘤细胞移植小鼠进行治疗。将小鼠白血病细胞WEHI-3皮下移植到BALB/c小鼠体内,制成荷瘤小鼠。进行了两批动物治疗。不同病毒和FeNP的剂量为1×10。10Vg/小鼠和3mg/kg。在第一批动物治疗中,6组荷瘤小鼠单次静脉注射rAAV和FeNP。结果表明,只有rAAV-DCUg-FL+FeNP治疗对肿瘤生长有明显的抑制作用(附图)。48 a,b)。在第二批动物治疗中,5组荷瘤小鼠单次静脉注射rAAV和FeNP。结果表明,只有rAAV-DM-FL+FeNP治疗对肿瘤生长有明显的抑制作用(附图)。48C,d)。这些结果表明,单独静脉注射和混合静脉注射均可作为礼品使用。因此,为了简化用药,我们在以下研究中采用了混合静脉注射。为了进一步研究GAT在体内的抗肿瘤作用,我们检测了GIV和效应基因cas 13a和两个靶基因的dna和mrna的丰度。FPNLcn 2在不同组织中进行qPCR检测。结果表明,GIV DNA分布于所有检测到的组织中,尤以肿瘤为甚(附图)。48e而Cas13a仅在肿瘤中表达(补充图1)。48F)。两个靶基因的表达FPNLcn 2)仅在肿瘤中被显著击倒(补充图1)。48g,h).

为提高治疗效果,我们用rAAV-dm-nt/FL+FeNP(1×10)多次静脉注射治疗荷瘤小鼠WEHI-3细胞。10VG/小鼠+3mg/kg FeNP)。荷瘤小鼠3次静脉注射磷酸盐缓冲液生理盐水(PBS)、rAAV-DM-NT+FeNP和rAAV-DM-FL+FeNP(补充图)。49A)分别。结果表明,肿瘤生长受到更明显的抑制(附图)。49B)。此外,rAAV-DM-FL+FeNP能显著提高小鼠的存活率(附图)。49C)。为了进一步提高治疗效果,并检查GAT能否根除肿瘤,我们接下来用rAAV-dm-nt/FL+fenp多次静脉注射(2×10)治疗WEHI-3细胞荷瘤小鼠。10VG/小鼠+3.6mg/kg FeNP)。荷瘤小鼠3次静脉注射PBS,rAAV-DM-NT+FeNP,rAAV-DM-FL+FeNP。5A)分别。结果表明,rAAV-DM-FL+FeNP治疗对肿瘤生长有明显的抑制作用。5B-E)和脾肿大。5F,g)。同样的治疗也更显着地延长了小鼠的存活时间。5H-K)。然而,两种用于测量肿瘤抑制的小鼠在治疗过程中均未观察到明显的体重变化(图一)。5B)和生存(图1.5I),说明礼品试剂具有良好的安全性。另外,在饮用水中加入NAC可以消除肿瘤抑制作用。5A-g)和生存改善(图一。5H-K)rAAV-DM-FL+FeNP治疗。此外,GAT的体内抗肿瘤作用可被一种更特异的铁吞抑制剂Liproxstatin-1(补充图1)所恢复。50)。这些数据表明,GITE通过铁下垂抑制肿瘤,与体外结果一致。为了进一步表征处理,我们还检测了铁的含量和dna的GIV和mrna。雷拉, FPN,Lcn 2在不同的组织中。结果表明,rAAV-DM-FL+FeNP治疗可显著提高肿瘤的铁含量(附图)。51A),但不包括其他组织(附图)。51 b)。GIV DNA分布在所有检测到的组织中,特别是在肿瘤中(附图)。51 c). 雷拉仅在肿瘤中高表达(附图)。51D两个靶基因FNP和Lcn 2仅在肿瘤中被显著敲除(补充图1)。51 e,f)。此外,两种肿瘤生长标记物CD 31和Ki 67的表达也被rAAV-DM-FL+FeNP(补充图)显著下调。51克h),与肿瘤切片的H&E染色一致(附图)。51 I)。最后,主要器官的H&E染色证实了体内治疗的安全性(附图)。52A)检测血液生化指标,包括白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)、血红蛋白(HGB)、肝毒性指标丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP),以及血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)等肾损伤指标。52 b).

图5:GAT在WEHI-3异种移植小鼠体内抗肿瘤作用。

采用WEHI-3细胞皮下注射法建立白血病小鼠模型.ag肿瘤生长检测。a动物治疗原理图。S.C.皮下注射。静脉注射。b平均体重。c肿瘤生长曲线d肿瘤成像。e肿瘤重量。f脾脏成像。g脾脏重量。盒子里的胡须eg显示中间线(中线),25和75百分位数(方格)和最小至最大(胡须)。其他数据以平均值±SD表示(n=9只老鼠)。hk生存检测。h动物治疗原理图。i平均体重。j肿瘤生长曲线数据以平均值±SD表示(n=10只老鼠)。kKaplan-Meier生存曲线(n=10只老鼠)。采用单因素方差分析和Tukey‘s检验,分析其统计学意义。c, e, g, j通过对数等级测试k.

为了进一步证实GAT的抗肿瘤作用,我们用GAT治疗了一种新的异种移植瘤模型。用广泛应用的小鼠大肠癌细胞系CT-26细胞制备荷瘤BALB/c小鼠。荷瘤小鼠3次静脉注射rAAV-DM-nt+FeNP和rAAV-DM-FL+FeNP(2×10)。10VG/小鼠+3.6mg/kg FeNP)。6A)。结果表明,同样显著的肿瘤生长抑制作用(图一)。6B-g)和生存改善(图一。6h-k)在新的肿瘤模型上复制。肿瘤铁含量的检测(附图。53A),rAAV DNA的丰富度(补充图)。53B),以及雷拉(补充图。53c), FPN(补充图。53D),以及Lcn 2(补充图。53E)得到了与WEHI-3模型相似的结果。其抗肿瘤作用也通过转录证实。CD 31(补充图。53F)和基67(补充图。53g肿瘤切片的H&E染色(附图)。53h)。主要器官的H&E染色再次证实了体内治疗的安全性(补充图)。54a)并检测血液生化指标、肝毒性标志物和肾损伤标志物(附图)。54B).

图6:GAT在CT-26异种移植小鼠体内的抗肿瘤作用。

通过皮下注射CT-26细胞,建立结肠癌小鼠模型.ag肿瘤生长检测。a动物治疗原理图。S.C.皮下注射。静脉注射。b平均体重。c肿瘤生长曲线d肿瘤成像。e肿瘤重量。f脾脏成像。g脾脏重量。E和g中的盒须图显示中间线(中线)、25%和75百分位数(Box)和min to max(须)。其他数据以平均值±SD表示(n=10只老鼠)。hk生存检测。h动物治疗原理图。i平均体重。j肿瘤生长曲线数据以平均值±SD表示(n=10只老鼠)。kKaplan-Meier生存曲线(n=10只老鼠)。用一名双尾学生进行统计学分析。t试验c, e, g, j通过对数等级测试k.

为了确定GAT是否能诱导转移瘤的抗肿瘤作用,我们最终在C57BL/6J雌性小鼠体内静脉注射B16F10细胞,对肺转移性黑色素瘤进行了治疗。荷瘤C57BL/6J小鼠静脉注射rAAV-DM-NT+FeNP和rAAV-DM-FL+FeNP 3次(2×10)。10VG/小鼠+3.6mg/kg FeNP)。7A)。结果表明,rAAV-DM-FL+FeNP治疗可明显减轻肺的肿瘤负担。7b-h)。同样,rAAV-DM-FL+FeNP治疗能显著提高小鼠的存活率。7i-k)。此外,rAAV-DM-FL+FeNP治疗可显著减少脾肿大(附图)。55a,b)和白细胞(补充图。55c)。虽然rAAV分布在所有组织中(附图)。55D),该试剂对主要器官无明显毒性(附图)。55e-h).

图7:GAT在B16F10异种移植小鼠体内抗肿瘤作用。
figure7

通过静脉注射B16F10细胞,建立肺转移性黑色素瘤模型。ah肿瘤生长检测。a动物治疗原理图。静脉注射。b平均体重。c肺重量。d肺显像。eH&E染色肺断层显像。f量化B16F10肺转移样肿瘤灶。gQPCR检测肺黑素细胞特异性Tyrp 1 mRNA表达。h肿瘤面积占肺面积的百分比e。盒子里的胡须cf显示中间线(中线),25和75百分位数(方格)和最小至最大(胡须)。其他数据以平均值±SD表示(n=9只老鼠)。ik生存检测。i动物治疗原理图。j平均体重。数据以平均值±SD表示(n=10只老鼠)。kKaplan-Meier生存曲线(n=10只老鼠)。用一名双尾学生进行统计学分析。t-测试c, f, g, h通过对数等级测试k.

为了进一步证实这种多次静脉滴注礼品疗法的安全性,我们用三次静脉注射pbs和rAAV-dm-FL+fenp(2×10)的方法治疗两组健康BALB/c小鼠。10VG/小鼠+3.6mg/kg FeNP)(补充图1)。56A)。结果表明,rAAV-DM-FL+FeNP治疗对体重无明显影响(附图)。56B)。此外,尽管rAAV分布在所有组织(补充图)。56c),该试剂对主要器官无明显毒性(附图)。56d-g)。这些数据连同那些在荷瘤小鼠身上检测到的数据(补充图)。52, 54,和55)证明礼物处理的安全性。

FeNC基礼品抗肿瘤的体内外实验研究

最后,为了确定铁纳米粒子本身是否可以作为aAV来转移giv,我们选择了一种PEI修饰的Fe。3O4纳米粒子(FeNC)作为DNA转染剂。通过两个实验对两批FeNC(FeNC-1和FeNC-2)进行了评价.在第一个实验中,将质粒添加到FeNC-1中,制备FeNC-1@DNA.KG-1a和HepG 2细胞先用FeNC-1@DNA(0.5μg FeNC-1)转染GVS,然后用FeNP(50μg FeNP)处理。结果表明,只有FeNC-1@PDM-FL/pDCUg-FL+FeNP才能导致细胞死亡(附图)。5758而FeNC-1@PDM-FL/pDCUg-FL(0.5μg FeNC-1)和FeNP-1@PDM-NT/pDCUg-NT+FeNP对细胞生长无显著影响(附图)。5758)。这些数据表明,FeNC可以作为基因转染的载体。在第二个实验中,为了简化礼物试剂,我们去除了FeNP,用FeNC@DNA对KG-1a细胞进行了处理。结果表明,FeNC@PDM-FL(50μg-FeNC)处理引起细胞死亡(附图)。59而FeNC(50μg FeNC)和PDM-FL单独作用对细胞生长无明显影响(附图)。59)。为了研究FeNC@DNA的稳定性,我们还用FeNC@PDM-FL处理KG-1a细胞24 h,结果表明FeNC@DNA仍具有类似的肿瘤细胞杀伤作用(附图)。59)。随后的脂质ROS和细胞活力检测也表明FeNC@PDM-FL通过铁下垂引起细胞死亡(附图)。6061).

为了进一步研究FeNC@DNA的抗肿瘤作用,我们用FeNC@pAAV-DCUg-FL/DM-FL等试剂对WEHI-3细胞的荷瘤小鼠进行了单次静脉注射作为对照。结果表明,只有FeNC@pAAV-DCUg-FL/DM-FL对肿瘤生长有明显的抑制作用(附图)。62A,b)。质粒DNA检测显示,载体DNA分布于所有检测组织中(附图)。62 c)。Cas13a的检测表明该效应基因仅在肿瘤中表达(附图)。第62d)。此外,两个靶基因的转录FPNLcn 2只有在肿瘤中才能明显地被击倒(补充图)。62 E,f)。为进一步提高FeNC@DNA的抗肿瘤作用,我们分别用FeNC@pAAV-DM-FL和FeNC@pAAV-DM-NT两次静脉注射治疗WEHI-3细胞荷瘤小鼠(附图)。62克)。结果表明,肿瘤生长受到更明显的抑制(附图)。62h-j)。结果还表明,pAAV-DM-FL+FeNC治疗仅显着地提高了肿瘤的铁含量(附图)。62k).

药动学与生物分布

最后,我们研究了rAAV-DM-FL、FeNP、pAAV-DM-FL和FeNC的药代动力学和生物分布.结果表明,注射后24h血中rAAV-DM-FL、FeNP、pAAV-DM-FL和FeNC的浓度分别约为组织注射剂量(%ID/g)的9.91%、5.41%、2.7%和4.44%(附图)。63)。其体内半衰期分别为11.1 h、5.0 h、5.2 h和4.9h(附图)。63)。通过对rAAV-DM-FL、FeNP、pAAV-DM-FL和FeNC在肿瘤和主要器官中的体内生物分布的检测表明,与其他器官相比,这些试剂在肝脏和脾脏中均被网状内皮系统明显隔离(附图)。63)。瘤内注射后24h,rAAV、FeNP、pAAV和FeNC(%ID/g)分别占29.5%、24.3%、20.4%和23.4%(P<0.05)。63).

在肿瘤中有足够的铁氧化物纳米粒子的足够浓度是重要的礼物。这项研究表明,两个使用的铁纳米粒子可以集中到肿瘤(补充图)。51A,b63b,d)和礼物,从而显着地增加了肿瘤的铁含量(补充图。51A, 53A和62k)。由于所使用的纳米粒子没有经过任何肿瘤特异性配体的修饰,所以纳米粒子应该通过被动增强的通透性和保留效应(Epr)和通过跨内皮途径的主动转运来累积到肿瘤。51。最近有报道称,后者是肿瘤中纳米粒子积聚的主要原因。51。由于FeNP不含肿瘤特异性配体,一般可用于治疗三种不同类型的肿瘤(无花果)。57)。目前,在肿瘤细胞表面,尤其是实体肿瘤上,很少发现高特异性的生物标志物。因此,制备具有高度肿瘤特异性的纳米粒子仍是一个难点。另一方面,如果在纳米颗粒上修饰特定于肿瘤的靶向配体,这种纳米粒子可能不适合治疗其他肿瘤,因为不同的肿瘤有不同的靶点。52,这会使治疗不同肿瘤的纳米粒子的制备复杂化。总之,用肿瘤特异性配体修饰的纳米粒子可以通过积累更多的纳米颗粒来提高礼物对肿瘤的治疗效果。礼品有其独特的好处,使用氧化铁纳米粒子和AAV。氧化铁纳米粒子是唯一被批准用于临床的金属纳米粒子,因为它们被证明是安全的。氧化铁纳米粒子的批准应用包括癌症诊断、癌症热疗和缺铁性贫血。53。此外,aAV也是临床使用的基因载体,现在越来越多的基因疗法为其安全性而使用。54,55.


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