ERG和AR介导的转录网络调控无距离同源盒-1介导的前列腺癌进展

无远端同源盒-1(DLX 1)是一种公认的前列腺癌(PCA)诊断的无创生物标志物，但其在疾病病理生物学中的机理尚不清楚。在这里，我们揭示了DLX 1的致癌作用，并表明废除DLX 1的功能会导致肿瘤的发生和转移减少。我们观察到60%的晚期和转移患者表现出更高的表现。DLX 1水平。此外，大约96%的TMPRSS 2-ERG融合阳性和~70%的雄激素受体(AR)阳性患者显示升高。DLX 1，与侵袭性疾病和生存不良有关。在机械上，ERG与增强子结合的AR和FOXA 1协同驱动转录上调。DLX 1在ERG阳性背景下。然而，在ERG-负上下文中，AR/AR-V7和FOXA 1足以上调DLX 1。值得注意的是，抑制ERG/AR介导的DLX 1BET抑制剂(Beti)或/和抗雄激素药物的转录降低其表达和下游致癌作用。最后，本研究确定DLX 1ERG/AR作为ERG/AR的直接靶点，对DLX 1阳性患者显示了β和抗雄激素的临床意义。

雄激素调节跨膜蛋白酶丝氨酸2的基因重排(TMPRSS 2)与ETS转录因子、vETS红斑狼疮病毒E26癌基因同源性(Erg)大约50%的前列腺癌(PCA)患者发生。1。ERG的异常过表达控制与PCA发展相关的转录网络2,3，增加转移潜能，并与不良的临床结果有关。4。在……里面TMPRSS 2-ERG融合-阳性PCA，ERG招募到SOX 9启动子打开隐匿性雄激素受体(AR)结合位点SOX 9增强子从而调节其表达，而SOX 9的丢失导致ERG介导的致癌性降低。5。尽管如此，其他控制ERG介导的癌发生的关键伙伴仍然很大程度上没有被探索。

考虑到AR信号在PCA的发展和进展中的关键作用，针对雄激素合成的抑制剂(醋酸abiraterone)和AR拮抗剂(bialut酰胺，enzalut酰胺)被应用于称为雄激素剥夺疗法(Adt)的第一道治疗线，通常用于晚期PCA患者。6。尽管长期服用adt会导致不可避免的癌症复发，但由于药物的选择压力，最终会发展到侵袭性去势耐药前列腺癌(Crpc)阶段。6。最近的药物如阿帕鲁他胺和达鲁他胺延长了crpc患者的无转移生存期。7。此外，美国食品和药物管理局(Fda)还批准了对无转移、去势敏感的患者使用阿帕鲁胺。8。越来越多的证据表明CRPC有持续的AR活动，原因包括艾尔雄激素的扩增、基因突变、肿瘤内雄激素合成及构成活性的表达艾尔剪接变体(AR-VS)6。此外，与AR-V7阴性病例相比，使用恩扎鲁胺和阿弗龙治疗的患者循环肿瘤细胞中的AR-V7水平升高，生化复发时间缩短。9。与全长AR(AR-FL)不同，剪接变异体AR-V7以一种不依赖配体的方式起作用，并保持着对雄激素非依赖性生长和疾病进展的构成活性。10。有趣的是，最近的一项研究显示，一个明显的AR-V7旋回控制着细胞上下文相关基因的表达。11。最近的研究揭示了溴结构域和末端外(Bet)结构域蛋白的临床意义，它们是已知的促肿瘤基因(如AR)的转录协同激活因子，被认为是治疗crpc的潜在治疗靶点。12,13.

这个无远端同源盒(DLX)基因属于含有同源盒的转录因子家族，是转录因子的结构同源物。果蝇无距离(DLL)DLX 1作为DLX家族在颅面部特征、颌骨和GABA能(γ-氨基丁酸)中间神经元的发育中起着至关重要的作用。14。解除对同源盒基因的管制已被认为与包括前列腺在内的几种人类恶性肿瘤有关。15。在造血细胞中，dlx 1通过与smad 4相互作用，阻断了smad 4介导的下游β信号通路。16。在pca中，dlx 1与β-catenin相互作用，调节下游β-catenin/tcf 4信号通路。17。此外，DLX 1已被证实为独立于临床的癌症组的PCA生物标记物，其中DLX 1和HOXC6准确预测高级别疾病18。然而，驱动DLX 1上调的基本调控机制及其在PCA进展中的作用仍不清楚。

在这里，我们揭示了在PCA中DLX 1上调的分子机制，并揭示了与其相关的致癌功能。我们的数据发现DLX 1介导的下游生物过程在PCA肿瘤发生中起作用，并显示其在疾病进展和转移中的致癌作用。我们还展示了ERG、AR和FOXA 1作为关键转录调节因子的作用。DLX 1在PCA中过度表达。最后，我们发现用BET抑制剂(Beti)或联合抗雄激素干扰ERG/AR转录通路可以减弱DLX 1介导的肿瘤发生。总之，本研究突出了DLX 1作为PCA有效治疗靶点的重要性，无论TMPRSS 2-ERG融合状态。

DLX 1具有致癌性，促进PCa的进展

为了研究DLX 1水平升高与PCa进展之间的关系，我们使用公开的临床基因组数据存储库分析了RNA-序列分析(RNA-Seq)数据。癌症基因组图谱前列腺腺癌(TCGA-PRAD)数据集。有趣的是，DLX 1在原发性PCA患者中观察到与匹配的正常组织相比较(如图所示)。1A)。在其他临床基因组学数据集(GSE 35988)中也有类似之处。19和GSE 8060920)更多的表达DLX 1与良性癌相比，晚期侵袭性癌症的转录本被观察到(如图所示)。1B和补充图。1A)。与此一致的是，更高的病人DLX 1表达(DLX 1嗨)与那些生存概率较低的人相比，生存概率较低。DLX 1表达(DLX 1罗氏)(图1.1C)。同样，高架DLX 1PCa细胞(22Rv1，VCaP，PC3)与LNCaP细胞(雄激素反应细胞)和RWPE 1(良性和永生化的前列腺上皮细胞株)相比，均有不同程度的表达(附图)。1B)。同时，阅读的覆盖范围DLX 1RWPE 1 RNA-Seq数据的转录本21，22 Rv122，和VCaP22细胞系表现出类似的趋势(图)。1D)。为了了解DLX 1在PCa中的功能意义，我们在RWPE 1细胞中异位高表达DLX 1，并在转录和蛋白水平上证实其过表达(附图)。1C)。有趣的是，与对照组相比，RWPE1-DLX1细胞的增殖明显增强。1E)。同样，DLX 1过表达显著增强了RWPE 1细胞的形成能力和迁移特性(图1)。1F，g)。相反，为了了解dlx 1的功能作用，使用功能丢失模型，crispr/ca 9介导的基因敲除DLX 1在22Rv1细胞中进行(补充图)。1D)，以及DLX 1通过对CRISPR/Cas9靶基因序列的基因组扩增(附图)证实了基因敲除(KO)。1E)。三独立DLX 1-KO克隆，即22Rv1-DLX 1-KO(C-1，C-2和C-3)显示DLX 1在转录和蛋白质水平上的表达缺失(补充图)。1F)测定这些基因工程株系的表型变化。值得注意的是，22 Rv1的增殖率明显下降-DLX 1-Ko细胞与对照组比较，差异有显着性(图1)。氢)。同样，在22Rv1-中观察到细胞迁移和形成病灶的特性显著减少(~60%)-DLX 1-KO细胞(图1.1I和补充图。1g)。我们还观察到22 Rv1-的不依赖于锚固的生长减少了4-5倍。DLX 1-KO细胞与对照组比较。1J).

a点图显示DLX 1在PCA患者中的表达(n=498)和匹配的正常值(n=52)在TCGA-PradRNA-Seq数据集中，数据表示log 2(Norm_count+1)，中心表示平均±(标准差)SD(P < 0.0001). b点图DLX 1使用微阵列分析数据表达(GSE 35988)包括良性(n=28)，本地化(n=59)，以及mcrpc(n35例患者标本，数据代表log 2(Norm_MRNA)，中心描述均值±SD(P < 0.0001). cKaplan-Meier图显示TCGA-Prad中的生存概率(n=498)DLX 1 (DLX 1嗨)和低DLX 1 (DLX 1罗氏)表达。dRna-seq数据显示DLX 1抄本阅读在公开的数据集(GSE 128399和GSE 118206)中的计数。e等基因RWPE 1细胞在指定时间点过表达DLX 1细胞增殖试验(P < 0.0001). f用同一细胞作病灶形成试验e (P < 0.0001). gBoyden间室Matrigel迁移试验e (P < 0.0001). Representative images for panels f(标尺500米)及g(标尺100米)显示为内嵌。h22Rv1-细胞增殖试验DLX 1-KO(C1、C2和C-3是独立克隆)和控制细胞在指定的时间点(P < 0.0001). iBoyden间室Matrigel迁移试验h (P < 0.0001). j不依赖锚定的软琼脂法h (P < 0.0001). Representative images for panels i和j显示为内嵌(标尺100米)。kDavid分析显示22Rv1-中上调(右)和下调(左)生物过程DLX 1-KO对抗对照细胞。条表示−日志10 (P-值)和频率多边形(黑线)表示基因的数目。l同k，除基因集富集分析(GSEA)图代表解除管制的途径。m热图显示22Rv1基因中与肿瘤干细胞和EMT有关的下调基因DLX 1-KO细胞与对照组比较。来自三个生物独立样本的数据(n=3)。数据表示平均值±扫描电镜，除非指定。对于面板，a未配对学生双尾t-试验；b采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验；e双向方差分析、SIDAK多重比较试验；f, g双尾韦尔奇t-测试；h双向方差分析，Dunnett的多重比较检验；i, j采用单因素方差分析、Dunnett多重比较检验。源数据作为源数据文件提供。

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为了描述dlx 1在pca中所安排的生物通路，我们对22rv1-进行了基于微阵列的基因表达谱分析。DLX 1-KO和22Rv1-SCR细胞。注释、可视化和集成发现数据库(David，Https://david.ncifcrf.gov/)差异表达基因的生物信息学分析2折叠变化>0.6或<−0.6，90%置信区间显示DLX 1(补充数据)所参与的生物过程明显上调和下调。1)。正如预期的那样，参与细胞增殖和迁移以及干细胞种群维持的基因在22Rv1-DLX 1-KO细胞，而与细胞周期调控和抗原处理和呈递相关的基因被上调(见图)。1K)。随后的基因集富集分析(GSEA)显示参与凋亡途径的基因在DLX 1-KO细胞，而参与上皮间充质转换(EMT)、肿瘤干细胞、活化Akt和Wnt信号的基因集则在对照细胞中富集(图1)。1L，m)。为了进一步探讨DLX 1在侵袭性pca中的致癌作用，我们分析了rna-seq数据(GSE 78913)。23一触即发的击倒DLX 1LNCaP衍生物致骨细胞株C4-2B，并推测DLX 1被发现是前五位下调基因之一，如火山图所描述的(补充图)。氢)。此外，GSEA和差异表达基因的通路分析显示，与癌症相关的重要途径被解除管制，如上调凋亡和细胞周期阻滞(附图)。1I，j)。此外，22Rv1中差异表达基因的功能特征DLX 1-KO细胞通过基于重叠网络的分析显示出显著的(P < 0.005, FDR < 0.1) downregulation of EMT, cell cycle and DNA damage pathways (Supplementary Fig. 2)。综上所述，我们的发现涉及到DLX 1在向前列腺细胞传授致癌特性方面的关键作用。

DLX 1引起与肿瘤进展有关的生物学过程

为了探讨DLX 1基因表达的致癌机制，我们从转录和蛋白水平检测了EMT基因的表达。间充质表型的两种典型标记Vimentin和Snail的表达减少，E-cadherin表达增加，这是一种上皮标记物DLX 1-KO细胞。2A，b)。相反，在DLX 1过表达的RWPE 1细胞中，Vimentin表达增加(附图)。3A)。与gsea的数据一致，caspase 3的激活和多聚(app-ribose)聚合酶(Parp)的激活使细胞凋亡增加。DLX 1-KO细胞随着抗凋亡Bcl-XL水平的降低而降低(图二)。2C)。同时，晚期凋亡标记物的表达增加，可见Annexin-V和7-AAD(7-氨基-放线菌素D)染色22Rv1-的数目增加。DLX 1-KO细胞(图1.二维空间)。与此相一致，DLX 1如Annexin-V和7-AAD阳性细胞数量的增加所显示的那样，VCaP细胞的沉默也增加了细胞凋亡。二维空间和补充图。3B)。其次，我们基于流式细胞术的细胞周期分析显示，S期阻滞细胞的百分比增加，而G2/M期细胞则随之减少。DLX 1-KO与对照相比(图1)。2E)。同样，小干扰RNA(SiRNA)介导的短暂击倒DLX 1在VCaP细胞中，细胞周期阻滞(如图所示)。2E)。虽然，细胞周期在瞬间停止DLX 1沉默的vcap细胞不像基于crispr的细胞那样健壮。DLX 1在22Rv1中被击倒。此外，在RWPE1-DLX1细胞中观察到磷酸-Akt(Pakt)水平的增加(补充图)。3A)，显示DLX 1在调节癌细胞存活和增殖中的关键作用。

与微阵列数据一致，DLX 1-KO细胞中已建立的干细胞标记物表达减少，例如Pou5f1(10月4日)ABCG 2, CD 117(c-工具包)，以及SOX 2(无花果)2F)。接下来，我们检测了两个著名的干细胞标记分子abcg 2和cd 44在22rv1-中的细胞表面表达。DLX 1-KO，DLX 1-沉默的VCaP和RWPE1-DLX1细胞。有趣的是，在22Rv1中，ABCG 2(~30~60%)和CD 44(~50~80%)的表达明显降低。DLX 1-KO和DLX 1-沉默的VCaP细胞，而这些标记物在RWPE1-DLX1细胞中明显增加。2G)。由于醛脱氢酶1A1(ALD-HA1)活性增加，常与肿瘤干细胞表型有关。24，我们用RWPE1-DLX1细胞进行ALDH活性测定，显示ALDH活性显著增加(附图)。3C)。相反，22 Rv1-DLX 1-KO和DLX 1-沉默的VCaP细胞ALDH活性下降。2H，i)，表明DLX 1在促进癌症干细胞方面有合理的作用。此外，为了证实DLX 1在耐甲苯甲酰胺的pca中的致癌作用，我们沉默了。DLX 1LNCaP衍生物抗药性42D细胞(42D Enz)R)(附图。三维空间)。有趣的是，DLX 142D enz中的沉默R细胞导致S期细胞周期阻滞和凋亡标记物表达增加(附图)。3E，f)。此外，DLX 1在42D enz中，ALDH活性降低，导致沉默。R细胞(附图)第三代)。这些数据共同突出了DLX 1在促进前列腺癌干细胞、EMT和增殖方面的可能作用。

为了探讨与肿瘤发生有关的dlx 1靶基因，我们分析了大肠癌lovo细胞中dlx 1的可公开获得的染色质免疫沉淀测序(chip-seq)数据。25。通过与dlx 1 mac相关的基因相交(基于模型的芯片-seq分析)，以及22Rv1中下调的基因。DLX 1-KO细胞，我们观察到677个常见基因，包括ALD-HA1, HNF1A, GATA 2, CDK 4, MYC, Wnt5A作为DLX 1的转录靶点。3H)。此外，David对常见基因的分析揭示了与癌症进展相关的重要生物通路的下调(补充图)。3I)。接下来，我们研究了pca相关基因的表达，即ALD-HA124, HNF1A26，和GATA 227在22Rv1-DLX 1-KO细胞，与对照细胞相比，其表达明显下降(图一)。2J)。通过芯片-qPCR，建立了dlx 1在上调这些基因表达中的直接作用，证实了dlx 1在dlx 1启动子上的占位性。ALD-HA1和HNF1A，而在22Rv1中发现DLX 1浓度降低-DLX 1-KO细胞(图1.2K-m)。此外，组蛋白H3赖氨酸9乙酰化(H3K9Ac)的减少，在同一位点的转录激活标记证实了DLX 1介导的正转录调控(图1)。2L，m)。因此，我们建立了ALD-HA1和HNF1A作为DLX 1的直接转录靶点，在干细胞、胚胎发育和癌变过程中也发挥着关键作用。28,29.

DLX 1在肿瘤生长和转移中起关键作用。

为了研究DLX 1在肿瘤发生中的作用，我们通过移植22Rv1-小鼠进行了异种移植实验。DLX 1-KO或22Rv1-SCR在免疫缺陷NOD/SCID小鼠侧翼皮下控制细胞，并监测动物的肿瘤生长情况。在22 Rv1-中观察到肿瘤生长明显下降，在研究结束时肿瘤负担显著减少了80%。DLX 1-KO细胞植入组与对照组比较(图1)。3A，b)。为了检查自发性转移，我们从异种移植小鼠中摘除肺和骨髓，并对其进行了筛选，以确定是否存在人类特异性。阿鲁-序列30,31。22Rv1-细胞转移到骨髓和肺的细胞数量显著减少-DLX 1-KO细胞植入组(图1)。3C)。我们接下来在福尔马林固定的石蜡包埋肿瘤组织上进行了免疫组织化学(IHC)染色(KI-67)和EMT(Vimentin和E-cadherin)标记。Ki-67表达显著降低，Vimentin减少，E-cadherin表达增加。DLX 1-KO组与对照组比较。此外，DLX 1靶标ALD-HA1的表达也显著下降。DLX 1-KO肿瘤组织(图1)。3D，e)。值得注意的是，ALD-HA1在异种移植瘤组织中的免疫染色是异质性的，表明肿瘤细胞具有干细胞样表型。

.的作用DLX同源盒基因DLX 1已经在骨骼发育和骨肿瘤中建立32,33。此外，dlx 1在破骨和骨吸收中发挥着关键作用。34，对骨肿瘤和骨转移有一定的溶骨作用。35。因此，我们接下来试图通过一个实验性骨转移模型来确定DLX 1的作用，其中胫骨髓内注射采用22Rv1-SCR对照和DLX 1-无胸腺Nu中的KO细胞-FOXN 1努裸鼠。注射后4周，进行X线扫描，然后对植入肿瘤细胞的胫骨进行显微计算机断层扫描(MicroCT)，对照组22rv1-scr组骨丢失率高于对照组。DLX 1-KO(图1.3F和补充图3J)。此外，我们用CTAn(CT-Analyser)软件检测了两组胫骨干骺端骨形态参数。有趣的是，胫骨植入了DLX 1-KO细胞的骨体积分数(BV/TV)、骨表面(BS)和小梁数(TN)较对照组增加，说明22Rv1-SCR对照组存在骨丢失和骨结构破坏。第三代)。综上所述，这些发现提供了对DLX 1介导的致癌性及其在PCA相关骨转移中的可能作用的全面了解。

ERG和AR水平升高与DLX 1表达呈正相关。

ETS转录因子(ERG)的过度表达TMPRSS 2-ERG基因重排被认为是∼50%的常设仲裁院案件1，因此，我们接下来使用公开的tcga-prd检查dlx 1与erg的关联。36队列。PCA患者临床基因组数据分层(英文)n=498)基于埃尔格发现大多数高级别的病例埃尔格水平也显示出更多的表达DLX 1成绩单4A)。接下来，使用UALCAN癌症OMICS数据库37我们分析了不同表达的患者的总体生存概率。DLX 1及其与tcga定义的7个分子pca亚型的关联。36。值得注意的是，TMPRSS 2-ERG高水平的融合阳性患者DLX 1与低/中度融合阳性患者相比，生存率较低。DLX 1表达式(附图)4A)，表明DLX 1与ERG之间可能存在致癌协同作用。此外，两者之间存在显著的正相关DLX 1和埃尔格在两种MSKCC中均有表达。38和TCGA-Prad队列(附图)。4B，c).

为了进一步证实这些发现，我们对ERG和rna进行了ihc和rna原位杂交(rna-ish)。DLX 1分别用组织芯片(TMA)表达144例PCA患者标本，其中除3例外均为激素天真。Rna-ish染色模式DLX 1将患者分为0-3分4级，近60%的患者呈阳性反应。DLX 1从低到高的表达(如图所示)。4B，c)。ERG染色标本分为ERG阳性组(ERG+)和阴性组(ERG-)。4D)。与我们的In硅分析一致，46人中有44人TMPRSS 2-ERG融合阳性病例(96%)染色阳性。DLX 1表达式(图1.4D，e和补充图。4E)，其中~28%的患者对DLX 1 (DLX 1嗨，3分)，~35%的中度患者(DLX 1我，评分2)和~33%的患者DLX 1表达(DLX 1罗氏，得分1)(图1。4E)，建议ERG在DLX 1监管。而~42%的ERG阴性肿瘤也显示。DLX 1表达，表明与ERG无关的途径参与其调控(补充图)。4E)。就临床分期而言，ERG和ERG均为阳性肿瘤的百分比。DLX 1从低Gleason评分(GS6)的~21%大幅增加到高Gleason评分(GS9)的33%。DLX 1表达(ERG-/DLX 1+)也表现出较高的Gleason评分(图1)。4F)。因此，建议大多数PCA患者窝藏较高DLX 1ERG+/DLX 1+和ERG-/DLX 1+表达(ERG+/DLX 1+)与晚期疾病有关。

其次，我们探讨了AR在这些患者标本中的表达状况，并探讨了其与DLX 1表达的相关性。为了达到这一目的，我们在相同的TMA上对AR进行了IHC染色，并根据染色强度将AR-阳性(AR+)和阴性(AR-)分层(补充图)。4F)。然后，将样本归类为AR+，进一步检查是否存在ERG表达和/或DLX 1由RNA-ISH表达。4G，h)。有趣的是，我们发现95%的患者(44人中有42人)AR和ERG(AR+/ERG+)呈阳性。DLX 1同样，50%的AR+/ERG患者(72例中有36例)也呈阳性表达。DLX 1(无花果)4I而AR和ERG均阴性的患者(26例中有6例)这一比例下降(~23%)。然而，只有2例AR阴性和ERG阳性患者。DLX 1表达式(图1.4I)。根据AR表达对患者标本进行分层再检验，发现~67%的AR+患者也表现出阳性反应。DLX 1表达式(图1.4J)。29%的AR患者显示DLX 1表达，表示某些其他调节因素可能对DLX 1升华(图)4J)。此外，DLX 1随着病程的发展水平逐渐升高，GS6~37%阳性，GS9~67%阳性(图一)。4KPT2c(病理肿瘤2c)~51%，pT3b期69%(图1)。4L).

为了提供DLX 1与晚期疾病的关联，我们分析了cBioPortal上公开提供的SU2C转移PCa数据，以了解其在cBioPortal中的表达。DLX 1及其与艾尔和埃尔格39。显著正相关艾尔和DLX 1在转移性PCA患者中有表达，而不考虑TMPRSS 2-ERG融合状态(图1.4m)。此外，我们还进行了rna-ishDLX 1在转移性PCA中，TMA包括从45例患者中收集的121个转移部位(图1)。4N，o)。我们发现~64%的转移部位显示DLX 1其中21%为骨，17%为肝脏，5%为肺，12%为淋巴结，10%为其他器官。4P)。总之，我们的数据表明DLX 1在侵袭性和转移性PCA中的作用，并表明DLX 1、ERG和AR在本病的进展中具有合理的致癌协同作用。

ERG调节DLX 1在……里面TMPRSS 2-ERG融合阳性前列腺癌

由于我们发现ERG和DLX 1在几个独立的PCA群体中的表达有很强的关联，所以我们接下来要研究ERG在转录调控中的作用。DLX 1。因此，我们分析了VCaP中公开可用的ERG芯片-Seq数据集(TMPRSS 2-ERG融合阳性细胞40,41，并增加了ERG在DLX 1启动子被观察到，而它在埃尔格细胞耗竭(图1.5A)。此外，ERG在DLX 1在异位ERG过表达RWPE 1细胞中也观察到启动子的存在。42(无花果)5A)。接着，我们扫描了~1kb的上游和500 bp的下游区域到转录起始点(Tss)。DLX 1由于存在可能的ERG结合基序(EBM)和推测的ERG结合位点，即EBM 1(P1)和EBM 2(P2)。5B)。接下来，我们的芯片-qpcr数据证实，在这些循证医学中有大量的erg被招募到DLX 1VCaP细胞中的启动子5B)。为了证实ERG的占用是否与转录活性染色质有关，我们检测了转录激活标记的存在，并观察到H3K9Ac与RNA聚合酶II(RNA-POLⅡ)的显著富集(图二)。5B). PLAU以ERG靶基因为阳性对照。与此相一致的是，RWPE 1细胞(RWPE1-ERG)异位ERG过表达导致DLX 1在转录和蛋白水平上均上调(如图1所示)。5C)。此外，我们还对等基因RWPE 1细胞进行了ERG介导的细胞活化的检测。DLX 1荧光素酶启动子DLX 1启动子报告试验据推测，转染野生型的rwpe 1-erg细胞的报告活性显著增加。DLX 1启动子报告，而无明显变化的荧光素酶活性的突变EBMs被发现(图)。5D).

因为AR信号可以驱动ERG在TMPRSS 2-ERG融合-阳性背景下，我们进一步研究了合成雄激素甲基三烯醇酮(R 1881)对甲基三烯醇酮(R 1881)表达的影响。DLX 1在VCaP细胞中。值得注意的是，在转录和蛋白水平上，在R 1881刺激的VCaP细胞中，DLX 1的表达增加了2倍(如图所示)。5E，f)。PSA作为雄激素刺激的阳性对照。接下来，我们测试AR是否也在转录调控中起直接作用。DLX 1(无花果)5G)。因此，为了确定这一点，我们分析了芯片-seq数据集(Gse 28951)。2R 1881刺激的VCaP细胞中的AR和ERG。值得注意的是，AR在第三外显子(ChR 2：172,661,000-172,662,500)上有很强的结合。DLX 1在R 1881刺激的VCaP细胞中观察到。5H)。在类似的研究中，有几项研究显示存在外显子增强子(EExons)，它可以作为附近基因或寄主基因的调节元件。43,44。因此，我们认为Ares在第三外显子的存在可能在转录调控中起着增强子的作用。DLX 1。我们进一步研究了AR在DLX 1使用公开数据集的基因(GSE 70079)45由正常标本和PCA标本组成，并观察到AR在其推测的增强子元素上有显著的富集。DLX 1在PCA标本中(如图所示)。5I)。最后，我们证明ERG是直接从DLX 1启动子，从而调节其在TMPRSS 2-ERG阳性病例。我们的发现也暗示了AR信号在调解中的潜在作用。DLX 1在PCA中的表达。

Ar调节DLX 1在前列腺癌中的表达

考虑AR和DLX 1在PCA标本中的表达与AR占位的关系DLX 1增强子区域，我们下一步要研究雄激素信号在调控雄激素信号转导中的作用。DLX 1。以前，肿瘤组织中有明显的AR结合位点(Arbs)存在于正常前列腺组织中。45。此外，DLX 1在TCGA-Prad数据集中的前十位上调基因中发现，在邻近的50 kb区域有肿瘤特异性的arbs(补充图)。5A)。进一步验证AR结合在推测的增强子DLX 1，我们用r1881刺激的vcap细胞进行了芯片qPCR，鉴定了AR在r1881细胞上的显著富集。DLX 1增强剂，它被破坏的抗雄激素氮杂胺(ENZA)治疗(图)。6A)。阿罗巴KLK 3作为阳性对照(附图)。5B)。此外，我们还研究了另一种抗雄激素epi-001的作用。DLX 1表达，一种选择性的AR抑制剂，阻碍AR的氨基末端结构域(Ntd)的反活化，从而消除AR-v7介导的转录活性。46。推测，用Enza和EPI-001抑制R 1881诱导的DLX 1表达对VCaP细胞有抑制作用，提示AR在VCaP细胞的转录调控中起着重要作用。DLX 1(无花果)6B)。因为FOXA 1是已知的先驱TF和AR的辅助激活剂47，然后我们在DLX 1推测增强子区。重要的是，vcap细胞中的芯片-qPCR显示FOXA 1在同一位点上富集，表明AR转录复合物在vcap细胞的增强子区被激活。DLX 1(无花果)6C)。同样，芯片-Seq分析(GSE 56086)48还显示FOXA 1在AR(补充图)所占的同一位点(ChR 2：172,661,000-172,662,500)上结合。5C)。由于AR和ERG相互作用作为一种共同调节因子，已知可调节共同靶基因的表达。3,49，我们在DLX 1通过再芯片实验启动。6d)。正如预期的那样，使用ERG抗体的芯片，然后再用AR抗体下拉，显示AR和ERG在DLX 1启动子，从而确认它们通过启动子增强子区域的相互作用。6d). CUTL 2以AR-ERG共调控基因作为阳性对照。为了进一步验证可信的染色质相互作用，在DLX 1利用CHIA-PET数据集(GSE 121020)，对vcap细胞中rna-olⅡ的三维染色质区进行了分析。50。RNA-POLⅡ相关峰的综合分析DLX 1在PCA中进行TFs的调节。与我们的发现相一致，rna-ol ii chia-PET的数据证实了启动子-增强子在DLX 1基因，也表明ERG，AR和FOXA 1转录因子的结合。6E)。由于启动子-增强子相互作用DLX 1基因座与ERG占用率DLX 1芯片-Seq数据中的增强器区域(图)。6E)，我们在DLX 1增强子区域正如我们所预期的，我们观察到ERG在增强子区显著富集。DLX 1(无花果)6f)。值得注意的是，siRNA介导的对这些调控因子的敲除，埃尔格, 艾尔和FOXA 1在VCaP细胞中(附图)。5D)导致DLX 1在所有siRNA条件下的表达降低(如图所示)。6g，h)。此外，DLX 1水平的显著下降是由于所有三个关键调控器同时保持沉默(埃尔格, 艾尔，和FOXA 1)，从而指示这些因子之间的转录相互作用。由于FOXA 1的下调已知会在PCA中重新编程AR结合漩涡。45，我们接下来检查沉默是否FOXA 1在VCaP细胞中，AR结合在VCaP细胞中再分布DLX 1增强子区域因此，我们对AR的占用率进行了芯片-qPCR。FOXA 1-沉默的VCaP细胞和减少AR在DLX 1观察到增强子区，这与FOXA 1在这些地点的占用率下降是一致的(如图所示)。6I和补充图。5E)。综上所述，我们的结果表明ERG和AR介导的转录共调节DLX 1在……里面TMPRSS 2-ERG融合阳性细胞。此外，shRNA介导的艾尔在去势中被击倒TMPRSS 2-ERG融合阴性，C4-2细胞也显示DLX 1表达减少(补充图)。5F)。此外，在雄激素刺激下，AR和FOXA 1在TMPRSS 2-ERG融合阴性22Rv1细胞，提示AR信号在细胞转录调控中的意义DLX 1以一种与ERG无关的方式(如图所示)。6J).

在CRPC病例中建立了较高的DLX 1表达水平，并破译了全长AR在调节其表达中的重要作用，我们考虑了AR-V7(一种AR剪接变异体)可能参与DLX 1的转录调控。有趣的是，对22Rv1细胞中的AR-V7特异性结合的芯片-seq分析显示，AR-V7在其推测的增强子区显著富集。DLX 1(补充图。5G)。此外，对可公开获得的RNA-Seq数据的分析(GSE 94013)51显示DLX 1沉默AR-V7或AR-FL在22Rv1细胞中的转录(补充图)。5H)暗示AR-V7在DLX 1监管。此外，利用AR-V7的诱导表达系统，我们生成了既能表达AR-FL又能表达AR-V7的lncap细胞，它模拟了大多数对恩扎路酰胺或阿维酮耐药的pca患者的临床状态。52。在这些基因工程LNCaP细胞中，AR-FL和AR-V7的表达水平可以通过R 1881和多西环素(Dox)分别诱导表达。6K)。与此相一致，AR-FL和AR-V7的表达都会导致DLX 1转录和蛋白水平的增加(如图所示)。6k，l)。我们推测，在R 1881或DOX抑制的AR-FL和AR-V7介导的DLX 1表达增加的情况下，用AR拮抗剂(恩扎鲁胺或EPI-001)处理LNCaP AR-V7细胞(如图1所示)。6米)。综上所述，我们的发现表明AR-FL和AR-V7在转录调控中起着重要的作用。DLX 1以ERG依赖和独立的方式。这些发现也强调了AR-V7在转录调控中的关键作用。DLX 1因此，在晚期疾病和Gleason评分较高的PCA患者中，DLX 1的表达相对较高。

Beti抑制DLX 1的表达及其致癌特性

已建立ERG和AR信号介导的转录调控DLX 1接下来，我们探讨了针对这种调节回路的治疗策略。自从Beti，即jq 1和i-bet 762被证明具有抑制AR信号异常和brd 4对AR靶基因定位的作用。12，我们试图研究JQ 1在阻止DLX 1，即ERG和AR。使用芯片-Seq数据集(GSE 55064)12，我们在DLX 1β处理VCaP细胞后的启动子。有趣的是，与对照组相比，JQ 1处理的VCaP细胞ERG浓度明显降低(图1)。7A)。此外，H3K27Ac标记的存在表示活动。DLX 1在正常VCaP细胞中启动子，以及PLAU，以已知的ERG靶基因作为阳性对照。7A)。此外，利用JQ1处理的VCaP细胞进行ERG的芯片-qPCR验证了上述结果，并观察到类似的趋势(图一)。7b)。我们还观察了在JQ 1处理的VCaP细胞中DLX 1表达的变化，并观察到其表达明显下降(补充图)。6a，b)。为了研究JQ 1是否能抑制ERG介导的DLX 1的表达，用JQ 1处理稳定的RWPE1-ERG细胞，并使其减少。DLX 1观察到JQ 1在抑制ERG介导的转录调控中的作用。DLX 1(补充图。6C)。考虑AR与ERG无关的作用DLX 1然后，我们用jq 1处理C4-2，C4-2B和22Rv1细胞，推测DLX 1表达被注意到(补充图)。6d)。此外，与载体对照相比，JQ 1处理的VCaP和C4-2细胞的增殖明显降低(补充图)。6E)。此外，我们还利用DLX 1推测的靶标对JQ1处理的22Rv1细胞(GSE 162564)的可公开获得的RNA-Seq数据进行了GSEA分析(补充图)。3H)并观察到DLX 1靶基因在正常细胞中的富集(附图)。6f)。这些数据提示DLX 1可能的靶基因下调，导致JQ 1治疗后致癌作用减弱。

近期临床前和Ib/IIa期临床研究报告了BET抑制剂联合抗雄激素治疗CRPC的疗效。13,53。因此，我们研究了JQ 1和Enza是否能有效地抑制DLX 1的表达及其致癌性。因此，我们处理了VCaP细胞(TMPRSS 2-ERG阳性)单独使用JQ 1或Enza检测DLX 1及其靶基因的表达。有趣的是，我们观察到DLX 1DLX 1靶基因的表达以及相应的降低，即ALD-HA1和HNF1A在JQ 1处理的VCaP细胞与车辆对照(图1)。7C)。虽然JQ1和Enza联合处理VCaP细胞的效果更明显(~90%)(见图)。7C，d)。此外，为了研究JQ 1在ERG非依赖性背景下的抑制作用，我们用Beti和Enza对去势耐药22Rv1细胞(ERG阴性)进行了处理。据推测，类似的抑制作用在DLX 1, ALD-HA1，和HNF1A用JQ 1和/或Enza观察到，不存在与VCaP细胞相同的组合加性效应(图1)。7E，f)。尽管如此，单用Enza处理的PCA细胞增加了HNF1A与前几次报告相印证的表达26。为了研究jq 1在抗雄激素耐药细胞系中的作用，我们与耐甲氧西林的42D enz进行了类似的实验。R细胞(DLX 1阳性和ERG阴性)。据推测，42D enzRJQ 1单独治疗后，细胞DLX 1表达下降(附图)。6g，h)。此外，我们还观察了这些药物对ERG依赖性和非依赖性背景中致癌性质的影响，观察到vcap、22rv1和42denz的细胞增殖率明显降低。RJQ1单独处理的细胞如预期的那样。联合应用Jq1和enza对VCaP细胞的增殖有明显的抑制作用，而在22Rv1和42denz中则未见明显的抑制作用。R细胞(图1.7g-i)。同样，治疗VCaP、22 Rv1和42D enzRJQ 1和(或)Enza细胞的迁移和形成灶的能力降低，但这种抑制作用在联合用药的VCaP细胞中更为明显(图1)。7J-l和补充图。6i-k).

因为我们出现了ALD-HA1作为dlx 1的靶基因之一，我们接下来分析了在vcap、22 rv1和42denz中单独或与enza结合的ALDH活性。R细胞采用流式细胞术。有趣的是，仅用JQ 1处理的这些细胞ALDH活性降低，而药物组合只在ERG阳性的VCaP细胞中表现出轻微的增强作用(图一)。7m-o)。由于ALDHs在干细胞的维持和分化中起着至关重要的作用，我们利用VCaP细胞的三维前列腺圈试验评价了这两种药物的体外疗效。值得注意的是，与单独使用JQ 1相比，药物联合治疗细胞中形成的球体数量显著减少(图1)。7P)。此外，联合用药组VCaP细胞的肿瘤球形成能力明显降低。DLX 1表达与JQ 1相比(图1)。7q)。有趣的是，22Rv1和42D enzR细胞在联合处理JQ1和Enza时未能表现出增强的效应，表明参与了埃尔格融合-正负背景。总的来说，我们的数据揭示了JQ 1单独或与ENZA联合以ERG依赖和独立的方式靶向DLX 1驱动的PCA的有效性。

β-消除DLX 1介导的小鼠肿瘤发生和转移

为了研究Beti对DLX 1介导的肿瘤生长的抑制作用，我们在无胸腺免疫缺陷小鼠皮下植入22Rv1细胞，当肿瘤达到可触及阶段(平均体积~75 mm)。3小鼠随机分为4组(n6)给药。我们观察到单独使用JQ1或联合使用JQ1和Enza的小鼠在肿瘤消退方面表现出与车辆对照组相似的趋势(分别在19天和25天分别为50%和60%)，表明联合治疗没有任何加性效应(图1)。8a，b)。此外，在研究过程中未观察到对小鼠体重的不良影响。8C)。这一观察结果与我们的体外数据一致，在VCaP细胞中观察到JQ1和Enza组合具有加性的抗癌效应，而在ERG阴性的22Rv1细胞中则没有观察到。此外，先前的研究还报道了联合应用JQ1和Enza治疗VCaP荷瘤小鼠的疗效。53。也许，这些发现表明，jq1和enza组合的加性抗癌作用主要是在埃尔格-积极背景。接下来，为了确定药物治疗对自发性肿瘤转移的影响，我们在研究结束后切除了小鼠的肺和骨髓，并提取了基因组dna，然后进行定量PCR检测人的特异性。阿鲁-顺序。我们观察到，与车辆控制相比，JQ 1单独或与ENZA组联合使用的转移到这些器官的细胞数量明显减少(图1)。8D，e)。值得注意的是，联合用药组无明显增强作用。随后，为了研究这些药物在异种肿瘤移植中的作用，我们对细胞增殖标记Ki-67、ALD-Ha1和rna-ish进行了ihc染色。DLX 1表情。据推测，DLX 1Ki-67和ALD-HA1的表达在JQ 1和联合用药组中均有表达(如图1所示)。8F，g)。因此，我们在体内的发现证实了Beti和抗雄激素在阻碍DLX 1介导的肿瘤发生和转移方面的治疗作用。

综上所述，我们揭示了ERG和AR介导的调控机制，这些调节机制参与了PCa患者中DLX 1的上调。我们证明AR和FOXA 1作为协同调节转录因子与ERG相互作用，从而协调了DLX 1表达在TMPRSS 2-ERG正面背景。而在融合阴性背景下，AR和FOXA 1功能与ERG无关，可能与其他共同调节因子共同调节DLX 1。因此，这三种关键调控因子以上下文依赖的方式控制DLX 1的表达，通过上调多个DLX 1靶基因和生物学过程，导致DLX 1介导的肿瘤发生。重要的是，我们还展示了对DLX 1BET抑制剂在不依赖ERG的背景下，与抗雄激素结合在ERG依赖的背景下的转录回路(图)。9).

以分子生物标志物为基础的dlx 1和hxc 6诊断试验有助于减少不必要的活组织检查，并识别出高级别疾病风险增加的pca患者。18,54。在这里，我们显示更高的DLX 1在PCA患者标本中的表达与侵袭性疾病和整体生存不良有关。整合组学方法，如利用表观遗传特征追踪增强剂网络(Tenet)，已经确定dlx 1与100多个原发性PCA患者的肿瘤特异性活性增强子相关，从而表明了广泛的dlx 1循环对肿瘤进展的意义。23。此外，ERG和DLX 1均呈阳性表达，Gleason评分较高，生存概率较低，强调可能与疾病侵袭性和远处转移有关的致癌协同作用。类似于ERG介导的转录调控DLX 1，TDRD 1(包含1的Tudor结构域)，另一种已建立的PCA生物标记物，已被证明在埃尔格融合阳性患者，其中ERG调节甲基化模式TDRD 1启动子激活转录55。此外，对五项独立pca研究的基因表达数据进行的Meta分析表明，埃尔格带着DLX 1转录因子的递阶基因调控网络56表明ERG可能调控参与胚胎发育的TFs。作为这些独立研究的佐证，我们的发现引起了人们对ERG和DLX 1之间的分级调节网络的关注，其中出现了TMPRSS 2-ERG融合作为原发性PCA的早期事件，通过ERG/AR直接通过ERG/AR上调DLX 1的表达，从而促进疾病的进展。对此，我们发现了dlx 1和AR表达式之间的关联，而不管TMPRSS 2-ERG融合状态，AR信号在与ERG无关的背景下DLX 1转录调控中的作用。

Cpc的进展由持续的AR信号支持，这种信号主要依赖于不依赖于结构活性配体的AR-v7的表达。9。有几项研究报道了转移性crpc中AR转录周期的重新编程，其中一个细胞上下文依赖的转录网络在AR下游运行，它不同于雄激素依赖期的AR转录程序。57。此外，全基因组AR结合谱57显示了一个高度复杂的转录回路，AR可能通过远离启动子的增强子来传递靶基因的调控。2,3。尽管有证据表明ERG抑制AR的表达并抑制AR介导的正则基因的转录调控。3一些报道显示了这些tfs之间的协同性，其中AR在增强子区域结合，形成染色质环与ERG在基因启动子上相互作用，从而调节下游目标基因的表达。5,49。利用高通量测序和构象捕获技术了解基因组相互作用和染色质循环方面的最新进展，为深入了解正常细胞和pca细胞的高分辨率三维染色质前景提供了重要的见解。50。此外，rna-ol ii、AR和erg在pca中的映射的关键信息表明，这些tfs在pca中的基因组表达具有长期和短期相互作用。49,50。与这些研究相一致，我们的数据表明形成了一个活跃的转录复合物，其中包括AR-FL和FOXA 1在增强子区的招募。DLX 1，它还与占用的ERG进行交互作用。DLX 1启动子在融合阳性的情况下，可能与其他共同调节的TFs在融合-阴性的情况下。我们推测这种在增强子-启动子区域之间的短程染色质环结构DLX 1通过rna-ol ii相关的相互作用进一步启用DLX 1基因组区，涉及AR驱动的转录激活DLX 1以一种依赖于ERG和独立的方式。此外，我们的结果还表明，AR-V7在推测的增强子区富集。DLX 1进一步揭示了体质激活的AR-信号在调节其表达中的作用。综上所述，这些发现证明了AR信号的作用，其中AR-FL和AR-V7都在其中进行调节。DLX 1晚期PCA的转录激活。

众所周知，AR通过与组蛋白去乙酰化酶(Hdac)、含溴结构域蛋白(Brds)等转录辅调节因子以及erg等ets tf合作，促进转录调控。12,49,58。此外，Beti还可以通过破坏靶基因位点上的转录激活复合物来减弱rpc中AR和ERG介导的肿瘤发生。2,12,59。目前，溴结构域蛋白的靶向治疗已成为治疗包括crpc在内的多种恶性肿瘤的重要药物，例如，诸如otx-015、zen 003694和gs-5829等Beti已作为单一药物或与抗雄激素联合应用于crpc患者的临床试验中。60。此外，我们的结果表明，β单独和联合抗雄激素降低DLX 1及其靶基因的表达，从而表明DLX 1作为治疗靶点的效用。同时，我们也认为联合用药(Beti和抗雄激素)的增强效果在埃尔格融合-阳性背景。我们的研究结果表明，Beti和抗雄激素可以通过阻断AR和ERG的转录回路来减轻DLX 1的致癌作用，可以被认为是治疗ERG+/DLX 1+亚型PCA的一种潜在的治疗干预手段。

虽然，TMPRSS 2-ERG基因融合是PCA中非常普遍的基因改变，不像涉及致癌激酶的基因融合(例如RAF-激酶融合)。61，诸如ERG等转录因子对靶点具有挑战性。小分子抑制剂、肽类化合物的研究进展62，以及蛋白水解-靶向嵌合体(PROTAC)63显示出在肿瘤中靶向转录因子的前景，从而为利用DLX 1作为潜在的药物靶点铺平了道路。综上所述，本研究通过提供强有力的证据，为DLX 1阳性PCA亚型的临床治疗提供了强有力的证据，并与Beti或/和AR靶向治疗方案相结合，从而为晚期疾病患者开辟了新的治疗途径。