人肾上腺的单核转录序列揭示了低风险和高风险神经母细胞瘤的细胞特征

儿童神经母细胞瘤在预后上有显著的变异性。诊断年龄是最重要的预后因素之一，1岁以下的儿童预后良好。在这里，我们研究不同临床危险组和不同阶段的神经母细胞瘤的单细胞和单核转录，包括健康的肾上腺。我们比较了胚胎小鼠肾上腺交感神经衍生物和出生后人肾上腺肿瘤细胞的数量.我们提供的证据表明，低风险和高风险神经母细胞瘤有不同的细胞身份，代表两个疾病实体。低风险神经母细胞瘤呈现类似交感神经和嗜铬细胞的转录体，而在高风险神经母细胞瘤中富集的恶性细胞类似于在人类出生后腺体中发现的TrkB+胆碱能祖细胞的亚型。对这些群体的分析表明，在诊断时，不同的基因表达程序会导致最坏和更好的生存，并与年龄相关。我们的发现揭示了人类神经母细胞瘤的两个细胞特征和组成，反映了临床异质性和预后。

神经母细胞瘤(NB)是一种儿科癌症，起源于肾上腺交感神经-肾上腺细胞系(AG)。1。这种恶性肿瘤占所有儿童癌症病例的8-10%，是全世界15%的儿童肿瘤学死亡的原因。2。神经母细胞瘤的一个临床特征是异质性，其特点是从致死性进展到自发消退。利用INRGSS标准(即国际神经母细胞瘤风险分组分期系统)预测恶性肿瘤的临床行为及其对治疗的反应。1,3。年龄是这种风险分类最重要的和临床相关的因素之一。诊断时未满18个月的儿童比较晚诊断的儿童预后更好(即低风险)，而年龄反过来又会导致更差的预后(即高风险)。4,5。其他的预后标记被用于将患者划分为特定的危险组，例如倍体，染色体改变，MYCN神经营养素受体的扩增和表达，如TrkB(编码为TrkB)NTRK 2)与高风险和不良结局有关。相反，神经营养素受体TrkA的表达(编码为(NTRK 1)是与低风险和有利的结果有关的。2。为什么患者在诊断时的年龄是风险和结果的最有力的预测因素之一，目前还不清楚。

以前有报道称，大多数形成肾上腺髓质的小鼠嗜铬细胞起源于胚胎神经嵴后代，特别是来自多能雪旺细胞前体(SCPs)。SCPS是沿内脏运动神经向发育中的肾上腺附近迁移的神经相关细胞，约占嗜铬细胞的80%。6。其余的20%直接来自神经嵴细胞(Ncs)的迁移流，这些细胞与背主动脉附近有共同的交感神经肾上腺谱系。7,8，并被认为是神经母细胞瘤的来源。9,10。SCPS还能在小鼠胚胎发育过程中产生副神经，如祖克坎德尔器官(ZO)中的嗜铬细胞(chromaffin cells，ZO)和一些交感神经元。11。在小鼠中，zo在出生前不久达到最大细胞数，而人类的细胞数量在第三年左右达到高峰，这表明了特定物种的发育差异。12。然而，在小鼠胚胎发育过程中，SCPs被保留了相当短的时间，并在E15附近消失。6。因此，尚不清楚人类嗜铬细胞是如何在出生后产生和再生的，以及是否有任何不同的细胞群作为其祖细胞池。我们假设生后嗜铬细胞来源于与其发育来源不同的来源(即SCPs)，这种细胞来源的异常可以解释神经母细胞瘤的年龄依赖性风险分层。

在这里，我们从肿瘤的单个核(n=11)与健康的出生后肾上腺的不同危险组和交叉比较细胞簇转录体(人)n=3，鼠标n=5)。我们还包括最近发表的来自10X单序列NB肿瘤的单细胞测序数据集(n=8)13，E12-E13胚胎小鼠肾上腺胶原6，人胎儿肾上腺14，以及神经母细胞瘤间充质/NCC样和(NOR-)肾上腺素能细胞谱系的转录谱。15,16。我们发现一组TrkB+胆碱能细胞是人类出生后肾上腺特有的，与先前描述的胚胎雪旺细胞前体(SCP)不同。这群TrkB+细胞与高风险神经母细胞瘤中富含间充质性质的未分化细胞具有特定的基因特征。这些间充质细胞的基因特征与更大的498名神经母细胞瘤患者的存活率和较高的诊断年龄相结合。17。相反，分化程度较高的去甲肾上腺素能细胞在低风险病例中表达过高，并与肾上腺人和小鼠类似交感神经细胞和嗜铬细胞的转录序列分享特定的基因特征。我们的结果表明，高风险神经母细胞瘤的特征是祖细胞群，类似于出生后肾上腺的一种细胞类型，具有迁移和间充质特征，而低风险神经母细胞瘤类似于出生后和发育中的嗜铬细胞和交感神经母细胞。

为了了解为什么在18个月以上的儿童中会出现高风险的神经母细胞瘤，我们首先对出生后肾上腺正常细胞的数量进行分类，这是这种儿童恶性肿瘤的常见部位。我们定义了两个出生后人肾上腺正常细胞群的同一性。n=3,1536个单核)和小鼠(n=5,1920年单核/细胞RNA测序(SmartSeq 2，见“方法”部分)，平均深度分别为485,000和669,000读每细胞核/细胞(补充图)。1A，b，补充数据1)。从细胞核(人)或整个细胞(小鼠)获得的转录谱的技术和生物学特征在补充图中概述。1C.

生后人和小鼠肾上腺共有细胞，但嗜铬细胞有差异。

在期望恢复肾上腺皮质和髓质相关细胞的前提下，对人和小鼠肾上腺的细胞群进行注释(图一)。1A对于人类，1b用于鼠标，补充数据2)。一个正常肾上腺细胞群体的参考指南是通过给每个簇分配一个身份，交叉引用显著上调的转录本和文献中的标准标记(补充数据)来生成的。2)。肾上腺髓质细胞通过NOR和肾上腺素能标记物的表达来鉴定，包括PNMT, TH, DBH, CHGA，和CHGB(无花果)1D，补充数据2)。在人类中，hC4被鉴定为嗜铬细胞簇(“NOR”面板显著上调，FDR<0.01，Welch‘s)。T-测试图。1A，d，补充数据3而在小鼠中发现了两个嗜铬细胞簇(MC 11和mC 15)(NOR面板中的去甲肾上腺素标记显著上调，FDR<0.01，Welch‘s)。T-测试图。1B，d，补充数据2，补充数据4)。然而，小鼠嗜铬菌群mC 15与人嗜铬蛋白簇hC4有一个更为显著的特异性基因标记(FDR<0.01，Fisher‘s确切检验，图1)。1C，补充数据5)。为了了解这两个小鼠嗜铬菌群(MC 11和MC 15)之间的差异，我们研究了它们之间差异显著的基因的表达情况。表达CHGA, CHGB, PHOX2A，和PHOX2BMC 15显著高于MC 11(FDR<0.01，Welch‘s)。T-测试)，而PNMTMC 11明显高于MC 15(FDR<0.01，Welch‘s)。T-测试图。1D，补充数据2)。此外，mC 15簇的胆碱能、毒蕈碱和烟碱受体(mAChR和nAChR)的表达明显高于MC 11，包括CHRM 1, CHRNA 3, CHRNA 7，和CHRNB 4(FDR<0.01，Welch‘s)T-测试，补充图。2A，b，补充数据2)。人生后与小鼠嗜铬细胞形成对照PNMT+嗜铬细胞(HC4)显著表达交感神经母细胞标记物。PRPH(FDR<0.01，Welch‘s)T-测试图。2A).

aTSNEs代表指示基因在人类胆碱能祖细胞(粉红色)和色马芬(蓝色)群体中的表达。TSNET旁边的条形图说明了以每10,000个读取计数的对数来度量的表达式。b–e出生后人肾上腺(AG)在指定年龄的扫描图像(×20)概述。概览标尺：200μm，缩放框图像：10μm。b–dRNAScope原位杂交(ISH)TH(绿色)、CLDN 11(红色)NTRK 2(白色)mRNA和反染色DAPI(蓝色)。NTRK 2+ CLDN 11+肾上腺包膜和髓质中均有双阳性细胞。TH阳性细胞。e标记为for的4岁AG的RNAScopeTH(绿色)、CHRNA 7(红色)CLDN 11(白色)mRNA和核反染色(DAPI)如所示。在所有的RNAScope实验中，通过探针的不同组合显示了信号的分布模式和细胞形态特征，并在不同的样品上独立复制了三次。

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人出生后肾上腺胆碱能祖细胞群的鉴定

出乎意料的是，我们发现了人类出生后肾上腺(HC1)特有的细胞群，这些细胞显著表达了各种祖细胞和迁移标记，包括SOX 6，BCL11A，ERBB 3，NTRK 2(TrkB编码)、RTTN、PTPRZ 1、TP 63、ASXL3、POU6F2, SEMA3E, LAMA 3, DOCK 7，和CLDN 11(FDR<0.01，Welch‘s)T-测试，“祖先”和“Migrat”，用虚线突出显示，无花果。1D和2A，补充数据2和补充数据3)。此外，hc1祖细胞群体具有增殖性，并显著表达细胞周期基因，如MKI 67，ASPM，和泡泡1(“细胞周期”面板显著上调FDR<0.01，Welch‘s)T-测试，无花果。1D和2A和补充数据3)。然而，这些祖细胞并没有表达先前描述过的多功能雪旺细胞前体(Scps)标记，例如SOX 10, FOXD 3，和S100B(无花果)1D，补充数据2)。为了支持这一发现，在胚胎E12/E13天，曾描述过小鼠肾上腺胶原的SCPs。6，以及受孕后8-14周的人胎儿肾上腺(PCW)。14与人类出生后祖细胞簇HC1没有显着的特异性基因标记(Fisher‘s确切检验，补充图)。2C，d，补充数据5)。除scp、嗜铬蛋白和交感神经母细胞外，没有其他祖细胞被描述为胎儿肾上腺的祖细胞。13,14。在这方面，与人胎儿肾上腺和小鼠胚胎安拉根共有的唯一基因标记属于细胞周期基因，分别表达于循环交感神经母细胞(小鼠E13和人8-14 pcw)和循环嗜铬细胞(人8-14 pcw，fdr)。<0.05，Fisher‘s精确检验，补充数据5)。细胞速度的估计(即细胞轨迹和命运的计算重建，利用转录剪接来计算分化的方向和速度)18,19提示这类细胞(即HC1)能使生后人肾上腺中的嗜铬细胞重新生长(图1)。1E)。利用伪时间进行的速度驱动基因轨迹分析表明，前体细胞从具有高分化潜能的前体细胞过渡到分化的嗜铬细胞(图1)。1F-h)。此外，祖细胞(HC1)和嗜铬菌群(HC4)均表达烟碱型乙酰胆碱受体nAChRα7(CHRNA 7)，表明祖细胞在性质上是胆碱能的(FDR)。<0.01，韦尔奇的T-测试、补充数据2).

为了验证人胆碱能祖细胞(HC1)的表达和空间背景，对0岁和4岁儿童及成人的出生后肾上腺进行了一系列RNAScope原位杂交(ISH)。2B-E、补充图。2E和3)。我们首先阐明了髓质各部分腺体的解剖。TH)、皮质(CYP11B2)，和胶囊(RSPO 3)(补充图。2E)。为了鉴定属于HC1祖先群体的细胞，我们测试了在HC1群体中被确定为显著上调的标记：NTRK 2和CLDN 11(无花果)2B-d和补充图。3A-c). NTRK 2+CLDN 11+人肾上腺包膜和髓质中均有双阳性细胞。TH+细胞在所有年龄，但最丰富的在0岁，表明这些细胞下降随着年龄的增长。确认出生后的祖先CLDN 11+细胞具有胆碱能性质，我们与胆碱能烟碱受体进行原位RNA杂交。CHRNA 7(即nAChRα7)与TH和CLDN 11。两种细胞类型，TH+嗜铬蛋白和CLDN 11+祖细胞，表达nAChRα7。2E)。为了进一步证实人出生后腺体中的祖细胞与先前描述的胚胎多能性scps不同，我们进行了原位rna杂交和scp/glia标记。SOX 10(补充图。三维空间). NTRK 2+细胞完全来自Sox 10+人出生后肾上腺各年龄层的细胞。

不同的神经母细胞瘤风险组在细胞群体组成上存在差异。

接下来，我们用单核转录技术对11例不同临床危险组的神经母细胞瘤标本和基因亚群进行了表征(图1)。3A，b，补充数据1)。手术切除获得的深冻样本被用于nuc-Seq(SmartSeq 2)，共产生3212个高质量核，平均每个核具有709,676个高质量的读数(见“方法”和补充图)。1)。利用宝塔进行聚类分析，确定了10个细胞群，分为未分化(NC2和Nc3)、去甲肾上腺素能(NOR)(Nc5、Nc7、Nc8和NC9)和基质簇：间充质间质(MSC Nc1)、内皮细胞(Nc4)、巨噬细胞(Nc6)和T细胞(NC10)(图10)。3A，补充数据6)。每一组的身份是通过交叉引用定义簇的成绩单和文献中的标准标记(补充数据)来分配的。2)。群NC2和Nc3(称为“未分化”)显示了显著的前代标记的高表达。PROM 1，RTTN，ERBB 3，POU6F2，以及迁徙标记CLDN 11。值得注意的是，未分化的nc3簇具有显著的高表达MYCN、ALK、BRCA 1，和BRCA 2基因和祖先标记BCL11A，NTRK 2，SOX 5，SOX 6，TP 63，LGR 5和USH2A(FDR<0.01，Welch‘s)t-测试，无花果3C和补充数据2，补充数据6)。相反，去甲肾上腺素能簇(NOR，Nc5，Nc7，Nc8，nc9)表达显著高。NTRK 1(TrkA)和去甲肾上腺素能标记物TH，DBH，PHOX2A，PHOX2B，和岛1(FDR<0.01，Welch‘s)T-测试图。3C，d和补充数据2，补充数据6).

不同临床危险组和不同分期的神经母细胞瘤标本中含有不同的细胞，反映了这些临床组的临床异质性。高风险组间质组和未分化组细胞比例显著高于正常组和未分化组，而低风险组包括自发回归组(4S组)，主要为去甲肾上腺素能组(NOR)组(fdr<0.01)，卡方检验，图1。3B，补充图。4)。与这些观察相一致的是，对172个神经母细胞瘤大序列样本(nb172nci目标项目)的反褶积表明，在高风险患者中，间质和未分化nc3簇中的细胞比例明显较高(n在低风险情况下，Nc7、Nc8和NC9中的Nc7、Nc8和NC9细胞比例较高(n=14，FDR<0.01，卡方检验，补充图。4)。在NC2和Nc5团簇中观察到的单核和大容量SEQ之间的一些差异可能是同一风险组患者临床异质性的结果(补充图1)。4).

间充质标记物Prrx 1, YAP 1，和PDGFRA在未分化的Nc3和MSC Nc1中均有表达(FDR<0.01，Welch‘s)。T-测试图。3C，d和补充数据2)，与之形成对比的是PDGFRb其对MSC细胞的上调作用显著(Nc1，FDR<0.01，Welch‘s)T-测试图。3C，d和补充数据2)。与这一观察一致的是，未分化的nc3簇具有神经嵴样信号(第二类)和神经母细胞瘤细胞系先前描述的间充质基因(Mes)基因表达的大量上调基因。15,16Nc5、Nc7、Nc8和NC9呈显著高表达，表现为交感去甲肾上腺素能(I组)和ADR(肾上腺素能)信号(FDR<0.01)。3E，f，补充数据7)。此外，我们还将每组神经母细胞瘤的特异性基因标记与最近报道的8个gsh队列肿瘤中6个细胞簇的标记进行了比较。13。去甲肾上腺素能簇Nc5、nc7、nc8和nc9更接近GOSH交感神经样肿瘤簇1、2和3，而未分化簇nc3与分化程度较低的gosh肿瘤簇3(fdr=2.87×10)有较高的相似性。−36，费舍尔的精确测试，图1。第三代，补充数据7).

为了区分恶性和基质细胞簇，对基因组重排进行了分析，并进行了进一步的实验验证。以免疫细胞(T细胞、nC10和巨噬细胞Nc6)的变化为背景，计算每个样本的显着拷贝数变化，仅在有免疫细胞的7个样本中，如“方法”中所详述的那样。在大多数样本中，在未分化的Nc3簇(K87、K10、23、K55和K3)中，出现17q细胞增加、1p细胞丢失或11q细胞丢失。在MSC Nc1(K87)、未分化NC2(23、K3、K6和K87)和NOR Nc5簇(K6和K87，FDR<0.05，Fisher‘s确切检验)中，有显著数量的细胞重排。3H)。样品23、K10和K55的微阵列证实1p缺失，23和K87的11q丢失，K10、K3和K87的17q增益。如图所示，从这些样品中预测出明显的损益的细胞。3I.

接下来，我们验证了在神经母细胞瘤簇中发现的显着富集标记的表达。4，补充图。5)。RNAScope原位杂交MYCN-扩增神经母细胞瘤病例(K10，补充数据)1)是由比较基因组杂交(CGH)独立证实的。20，显示高度的瘤内异质性TH, MYCN，和ALK表达，与肿瘤区域强染色MYCN和ALK，阴性TH(无花果)4A，放大2)。其他肿瘤区域有少量弥漫性染色。TH+细胞核扩大阳性细胞MYCN，但对ALK(无花果)4A，缩放1)，而其他区域没有显示出TH, MYCN，和ALK(放大4)。有趣的是，原位杂交NTRK 1和NTRK 2(分别编码TrkA和TrkB)显示TH+细胞核增大的细胞是NTRK 1+但NTRK 2−，与周围的一切形成对比NTRK 1− NTRK 2+细胞核小的细胞(图。4B)。有可能是TH+细胞核增大的细胞(TH+，MYCN+，NTRK 1+，NTRK 2−、ALK(−)可能是细胞分化的原因21。神经营养素受体的表达NTRK 1被认为是一个有利的结果和低风险的标志，而NTRK 2表达与不良结局和高风险有关。2。与这些发现相一致的是，有利的低风险神经母细胞瘤病例的细胞(k6，4S期，补充数据)。1)是完全一致的NTRK 1+，TH+，NTRK 2−(附图)5A).

此外，我们验证了间充质标记物的表达。PDGFRA在高风险神经母细胞瘤群(Nc3)中，这一基因被确定为显著高表达。PDGFRA高风险表达MYCN-放大病例(即K10)在两种情况下都观察到NTRK 2+(无花果)4C(放大2)，同时也在CLDN 11+细胞(图1.4D，缩放2、3和4)，而在Lgr5+细胞未见PDGFRA信号(图1.4C放大1和图。4D放大1)。相比之下，低风险阶段的4S病例则完全阴性。PDGFRA和Prrx 1然而，在所有细胞的去甲肾上腺素能标记中，表达都是一致的。DBH和PHOX2B(补充图。5B，c)。2B期神经母细胞瘤DBH和PHOX2B表达式(附图)5D)，所有的细胞都没有表达Prrx 1很少有阳性细胞PDGFRA(补充图。5E).

在高风险神经母细胞瘤中富集的细胞群类似于人出生后肾上腺祖细胞群体。

高危神经母细胞瘤通常发生在18个月以上的儿童，经常起源于肾上腺。1。为了了解在高危和低风险病例中观察到的神经母细胞瘤群体与正常的出生后和胚胎肾上腺组织的关系，我们对他们的转录谱进行了比较分析。5, 6，和7)。(NOR-)肾上腺素能(NOR)标记的显著表达(即，CHGA，CHGB，DBH，TH，PHOX2A，和PHOX2B)是常见于健康交感神经肾上腺细胞和肿瘤或人群中发现的低风险神经母细胞瘤(fdr<0.01，韦尔奇‘s)。t-测试，无花果5A，补充数据2)。与此相一致的是，来源于神经母细胞瘤和成纤维细胞簇的特异性基因标记与小鼠胚胎(E12-E13)和人(8-14 PCW)嗜铬细胞簇以及人和小鼠出生后嗜铬细胞簇(FDR<0.01，Fisher‘s确切检验，图1)均有显著的同源性。5B-E，补充数据8，补充图。6A)。NOR Nc7和NC9与胎儿(8~14 PCW)交感神经母细胞(FDR=4.47×10)之间有更显著的相似之处。−33和FDR=5.38×10−32而NOR Nc8簇与胎儿(8~14 PCW)嗜铬细胞簇和交感神经母细胞簇(FDR=5.45×10)更接近。−18和FDR=1.08×10−18费舍尔的精确测试图。5E，补充数据8)。与小鼠胚胎转录谱的比较分析表明，NOR Nc7和NC9簇与小鼠胚胎嗜铬细胞和交感神经母细胞具有显著的基因特征(FDR<0.01，Fisher‘s确切检验，图)。5B，c，补充图。6A，补充数据8)。为了支持这些发现，神经母细胞瘤和簇对小鼠和人类发育中的肾上腺桥细胞、交感神经母细胞和嗜铬细胞以及人出生后嗜铬细胞的评分都很高(测量转录相似性，见“方法”)。6A-c)。此外，nor nc7和nc8簇的显著特异基因标记与一个大型神经母细胞瘤组(即Bonferroni校正组)的预后显著相关。p-数值<0.01,498例在SEQC中17，见“方法”，图1。6d).

与神经母细胞瘤和神经母细胞相比，未分化的神经母细胞瘤簇(Nc3，NC2)与小鼠胚胎和出生后交感神经母细胞和嗜铬细胞没有特殊的基因特征(图一)。5B-E)。然而，Nc3群与人类胎儿腺中的循环群有少量的特异性标记基因(即循环交感神经母细胞和嗜铬细胞，FDR<0.05，Fisher‘s确切检验，图)。5E)。尽管如此，这些只是细胞周期相关的基因(即，ASPM, 泡泡1, CENPE, CLSPN，和ESCO 2，补充数据8).

重要的是，与胎儿肾上腺相比，神经母细胞瘤Nc3簇与出生后人肾上腺胆碱能祖细胞群(HC1)有一个特定的基因特征(FDR<0.01，Fisher‘s确切检验，图)。5D，补充数据8)。此外，Nc3和HC1有显著的高表达(FDR<0.01，Welch‘s)t-测试)NTRK 2、间充质(即，COL1A2, COL6A3, COL12A1)、移徙(即，CLDN 11, DOCK 7)，以及祖基因(即，BCL11A, ErbB 3, RTTN, TP 63、ASXL3、POU6F2，和SOX 6，补充数据2，补充数据3和6)。此外，未分化的神经母细胞瘤簇(Nc3)在11个NUC-Seq-样本和172名患者的解离队列中所占的细胞比例较高(FDR<0.01，卡方检验，补充图)。4)，且其特异性标记基因在较大群体(即，Bonferroni校正)中存活概率较低的患者中的平均表达率略高一些。p-数值<0.05,498例在SEQC中17，见“方法”，图1。6d).

近年来，胚胎多能雪旺细胞前体(Scp)被认为是神经母细胞瘤的潜在来源。6。然而，胚胎SCPs在人胎儿和小鼠，只有特定的基因标记与神经母细胞瘤间质簇MSC Nc 1和内皮Nc4(图4)。5C，d，补充图。6A，补充数据8)。对他们共同的基因特征的详细研究表明，与细胞粘附和运动有关的基因的高表达(即GO期，FDR<0.05，Fisher‘s精确检验)，不包括SCP谱系标记(即，SOX 10，S100B，FABP 7，或PLP 1，补充数据8).

我们进一步详细分析了不同神经母细胞瘤簇的转录谱与更大群体(即SEQC中的498例)的存活率和诊断年龄的关系。17、图1.6e-h，补充数据9)。我们比较了498例患者中不同神经母细胞瘤群的特异性基因特征(1)危险组的差异表达(图1)。6E)，(2)与诊断年龄显著相关(图1)。6f)和(3)存活结果的差异表达(如图所示)。6g详见“方法”)。内皮细胞Nc4、巨噬细胞Nc6、未分化Nc3和NOR簇(Nc7、Nc8和NC9)特异性标记中的基因在中、低风险和较好的生存情况下均显著富集(FDR<0.01，Fisher‘s确切检验，图1)。6e-g，补充数据9)。然而，来自未分化Nc3和NOR NC 9簇的特异性标记中的基因也在高风险和最差生存患者中显著富集(FDR<0.01，Fisher‘s确切检验，图)。6e-g，补充数据9)。值得注意的是，在诊断时，未分化Nc3簇的特异性基因标记与年龄有着更显著的直接相关性(即它们更有可能在晚期表达，FDR=8.12×10)。−31，Fisher‘s精确检验)，而NOR NC9簇(FDR<1×10)的相关性更显著(FDR<1×10)。−50，费舍尔的精确测试，图1。6f，补充数据9).

对未分化Nc3和NOR NC9簇特异性基因特征的详细分析表明，这两个细胞群具有不同的基因方案，即：(1)与诊断时的年龄直接相关，与生存不良相关(Nc3比NC9更显著)；(2)在诊断时与年龄呈负相关，从而导致更好的存活(NC9比Nc3更显着，FDR<0.01，Fisher精确检验，Fig)。六小时，补充数据9)。Nc3和NC9细胞集落的细胞粘附和分化与诊断年龄呈负相关，也与存活相关(GO期，FDR<0.01，Fisher‘s确切检验，附图)。6d-g，补充数据10)。相反，NOR NC9基因在翻译、RNA处理和剪接中明显富集，而未分化Nc3群中与最坏存活相关的基因在DNA损伤、修复和细胞周期中富集，与诊断年龄较晚的相关基因在细胞运动中富集(Go期FDR<0.01，Fisher的确切检验，附图)。6d-g，补充数据10).

我们进一步研究了人类出生后肾上腺和神经母细胞瘤簇的共性，并在检测匹配的相互近邻的基础上进行了比较分析。22,23(无花果)7a，b)。我们利用人肾上腺将细胞状态投射到神经母细胞瘤数据(即查询)上。与确定的重要的共有基因签名一致(如图所示)。5D人生后嗜铬蛋白(HC4)群体与恶性NOR簇(Nc5、Nc7、Nc8和NC9)相匹配，而肾上腺祖细胞(HC1)与恶性未分化神经母细胞瘤NC2和Nc3相匹配(图3)。7a，b)。神经母细胞瘤中的内皮细胞、巨噬细胞和间充质细胞(即间充质细胞)有大量的细胞，其状态概率很高(也就是通过联合标记进行最佳转录匹配)。

此外，我们还询问了胚胎小鼠肾上腺嗜银质、神经母细胞瘤和正常人出生后肾上腺细胞的关系。我们根据欧几里德距离分析了除皮层和免疫细胞外，所有群体之间的转录相似性(图一)。7C，d)。分析表明，这些群体可分为4类，即(1)(NOR-)肾上腺素能组、(2)未分化组、(3)间充质组和(4)内皮细胞组(图4)。7C)。与确定的重要的共有基因签名一致(如图所示)。5B-d)，对这些欧氏距离的统计分析。7D结果表明：(1)人和小鼠的SCPs、胶质细胞、内皮细胞和间充质细胞和胚胎E12-E13细胞的转录谱相似；(2)人肾上腺祖细胞簇HC1与神经母细胞瘤未分化群体NC2和Nc3相似；(3)人和小鼠嗜铬细胞(生后和胚胎)的转录谱相似，与神经母细胞瘤Nc 5、NC 7、NC 8和NC 9相似。

为了了解神经母细胞瘤临床异质性的转录基础，我们对来自不同危险组的11例肿瘤的3212个高质量单细胞/细胞核进行了分析。我们对每个细胞核/细胞的平均读取量进行了71万个排序，并将其与3456个人类和小鼠发育和出生后的AG细胞进行了比较。虽然更多的细胞可以提供对肿瘤内不同细胞类型的更全面的观察，但大的测序深度和全长度的覆盖提供了更高的敏感性。最近的一项研究将Smart-seq2和10X基因组学(10X)的结果进行了比较，认为Smart-seq 2的检测灵敏度高于10倍。特别是，用Smart-seq 2测序的20个细胞的基因捕获率与10x的1000个细胞的基因捕获率相当。24。利用Smart-seq 2增强的敏感性，我们一致恢复了同一风险组神经母细胞瘤中相同数量的细胞，并将其与出生后和发育中的小鼠和人肾上腺进行了比较。

生后肾上腺中嗜铬细胞再填充的方式尚不清楚。而在小鼠胚胎发育过程中，多能雪旺细胞前体(即SCPs)6,11和交感神经-肾上腺祖细胞7可引起嗜铬细胞和交感神经母细胞，其出生后的存在尚未得到证实。在这项研究中，我们发现了生后人类肾上腺特有的一群细胞，这些细胞具有嗜铬细胞的前体特征，即(1)祖细胞和迁移标记的表达(即，NTRK 2, ErbB 3, BCL11A, ASXL3，RTTN, SOX 6, DOCK 7, LAMA 3, SEMA3E，和CLDN 11)，(2)高分化潜能；(3)计算(通过RNA速度计算)体内从祖细胞向嗜铬细胞转移的方向性。人类祖细胞和嗜铬细胞都表达胆碱能受体nAChRsα7(由烟碱乙酰胆碱受体基因编码)。CHRNA 7)，提示祖细胞具有胆碱能性。Nachrα7是胆碱能系统介导配体门控离子通道激活钙依赖性信号通路的关键成分。25，并参与对皮质醇和氧化应激的反应。26,27。由于生后的嗜铬细胞祖细胞群体不表达scp标记。SOX 10, S100B，也不是FOXD 3而且不存在于小鼠肾上腺中，有可能是人类独有的。RNAScopISH对人出生后肾上腺中不同年龄的祖细胞群体的标记特征进行了分析，证实了它们的存在，提示该群体随年龄的增长而下降。

比较分析不同临床危险人群生后人肾上腺和神经母细胞瘤的转录谱，发现已鉴定的生后胆碱能祖细胞群(HC1)与高危神经母细胞瘤的未分化簇(Nc3)有显著的转录相似性。高风险未分化群(Nc3)和出生后腺祖细胞(Hc1)均有显著高表达的神经营养受体。NTRK 2(编码TrkB))、间充质(即，COL1A2, COL6A3，和COL12A1)、移徙(即，LAMA 3, CLDN 11，和DOCK 7)，以及祖基因(即，BCL11A, ErbB 3, RTTN, TP 63、ASXL3、POU6F2，和(SOX 6)。相反，在低风险神经母细胞瘤中发现的簇的转录图谱与出生后腺体中发现的人类祖细胞不相似，相反，它们表现出正常的神经母细胞瘤的转录特征(即，NTRK 1，CHGA，CHGB，DBH, TH，和PHOX2B)与人、小鼠生后嗜铬细胞、胎人(8~14 PCW)和小鼠胚胎(E13)交感神经母细胞和嗜铬细胞的转录组相匹配。

此外，我们的结果表明，高风险相关细胞群(Nc3)有一个转录程序，随着年龄的诊断而变化，并与患者的低生存率相关。这个程序有利于老年患者细胞运动和转移相关基因的表达，以及在最坏的结果情况下与复制应激(即DNA修复和细胞周期)相关的基因的表达。相反，低风险富集或细胞簇呈现出与更高的生存概率和诊断年龄相关的转录程序。在这些簇中，NOR NC9是一个例外，因为它还显示了一个转录程序，它呈现出与年龄相关的最坏的结果。值得注意的是，这个程序是与RNA-(错误)剪接，而不是复制压力。我们的结果表明，在较小的年龄(诊断时)，NOR-细胞的细胞粘附和分化基因的表达(在较小程度上未分化)预示着更好的存活概率。相反，在老年患者中，NOR细胞RNA剪接基因的高表达，以及在更大程度上未分化细胞中的复制应激基因的表达，可能预示着最坏的结果。

在这方面，低风险神经母细胞瘤在诊断时年龄小于18个月的幼儿中很常见。1,5和NTRK 1表达(编码TrkA)是预后良好的组织学标记，而TrkB(编码为NTRK 2)与不良结果有关2。一种可能是不同的祖细胞群体在不同的年龄来源神经母细胞瘤，从而解释了显着的临床异质性，并与年龄。因此，年龄诊断是一个强有力的结果预测。具体来说，当SCPs分化为嗜铬细胞和神经母细胞时，有利的神经母细胞瘤可能起源于胚胎发育错误，而当TrkB+胆碱能祖细胞在出生后重新植入嗜铬细胞时，则可能产生不利的神经母细胞瘤。