HLA限制性新抗原嵌合抗原受体的结构工程

嵌合抗原受体(CAR)T细胞已成为一种很有前途的治疗药物，在临床上对一部分人的癌症产生了显著的反应。阻碍CAR治疗更广泛实施的一个主要挑战是肿瘤特异性抗原的缺乏。在此，我们描述了一种针对肿瘤特异性异柠檬酸脱氢酶2(IDH 2)的CAR 2的研制，该基因与人类常见的白细胞抗原等位基因HLA-B*07：02在细胞表面出现R140Q突变。轿车铰链域工程及IDH 2晶体结构优化R140Q-HLA-B*07：02-靶向性，提高CARS的敏感性和特异性，使其能够靶向该HLA限制性新抗原。因此，这一方法有望开发和优化其他难以通过常规手段进行治疗的癌症驱动基因突变的免疫疗法。

嵌合抗原受体(CAR)T细胞是一种新兴的治疗药物，在B细胞恶性肿瘤患者中引起了令人印象深刻的反应和主要的临床益处。1,2,3,4,5,6。CD 19在B细胞系中表达，尽管伴随着正常B细胞的减少，但CD 19靶向的CAR治疗有可控制的不良反应，患者通常能很好地耐受。到目前为止，大多数其他的car T细胞也是针对肿瘤相关抗原(Taas)的。7。虽然TAA通常在肿瘤上过度表达，但当非肿瘤细胞也表达TAA时，靶向TAA的CAR T细胞也会产生“靶上、非肿瘤”的毒性。这种TAA毒性分析已被证明是不可接受的，有时甚至是致命的。8,9,10,11,12。这些经验突出表明，有必要确定只在癌细胞中表达的抗原，以促进CAR疗法的更广泛实施。

在没有真正的肿瘤特异性抗原可用于car治疗的情况下，人们开发了联合抗原靶向的方法来降低肿瘤外毒性。13,14,15,16,17。例如，尽管Perna等人的努力。摘要为了识别急性髓细胞白血病(AML)的单一CAR靶点，无法发现CD 19那样的候选分子，本文描述了一种通用的联合抗原靶向的方法和发现平台。18。尽管联合抗原靶向技术的出现，但肿瘤特异性抗原的缺乏将继续阻碍诸如car T细胞等强大的免疫治疗药物向临床的转化。19.

推动肿瘤发生的基因改变可能会导致肿瘤特有的脆弱性，可以通过治疗加以利用。20,21。然而，针对癌症驱动基因热点突变等改变的治疗是有限的。22。大多数由常见突变的癌症驱动基因编码的蛋白质都是细胞内的，这就排除了标准的基于抗体的生物制品对它们的靶向性。21。在癌症中经常发生突变的一种细胞内蛋白是异柠檬酸脱氢酶2(IDH 2)，它的体细胞突变可以通过产生2-羟基戊二酸(2 HG)来促进AML的发生。23,24。致癌基因突变IDH 215-25%的AML患者发生在精氨酸残基R 140和R 172上，其中最常见的是r140q。25,26,27,28. IDH 2在胆管癌、软骨肉瘤和胶质瘤中也可以检测到突变。29.

从癌症驱动基因或突变相关新抗原(Manas)衍生的突变蛋白产品，可以被人类白细胞抗原(Hsa)分子加工并呈现为多肽。30,31,32。这种改变的多肽可以形成肽-HLA(Phla)复合物，从而形成肿瘤特异性抗原，可以在细胞表面被激活。33,34,35,36,37,38。最近，T细胞受体类似物(Tcrm)抗体被产生，这些抗体可以区分来自癌症驱动热点突变的蛋白质产物(即manas)和野生型(Wt)的pla复合物之间的细微差别。39,40。虽然tcrm抗体已转化为car T细胞治疗形式，但除一个目标HLA外，所有目标HLA都与来自taas的野生型肽而不是与来自癌症驱动基因的突变肽复杂。41,42,43,44,45,46,47.

TCR和TCRM抗体的结构分析显示了明显的结合特征。例如，TCR-Phla配合物的晶体结构一般倾向于典型的对角线结合模式，其中TCR Vα互补决定区位于肽的N-端，VβCDRs位于C-末端。48,49。然而，越来越多的与pla结合的tcrm抗体结构正开始显示出广泛的方向，如对接和入射角所测量的那样。48。对现有TCRm/Pla复合结构的比较未能显示结合方向与结合强度或结合机理之间的相关性。例如ESK 1抗原结合片段(Fab)，它只与威尔姆斯肿瘤蛋白1(Wt1)肽的N端接触。50与黑色素瘤相关抗原(MAGE)-phla-A1复合物中的Hyb 3-fab，其中fab仅与MAGE的C-末端相互作用。51。因此，对TCRM结合的更好的结构理解可以帮助设计更有效和更安全的TCRM抗体，包括汽车T细胞形式的TCRM抗体。

在这里，我们描述了一种针对idh 2的新抗原特异性tcrm抗体的鉴定。R140Q突变肽与一个共同的HLA等位基因(HLA-B*07：02)，其特异性的结构基础和功能活性的CAR T细胞形式。

针对HLA-B*07：02-受限IDH 2的汽车T细胞设计的产生R140Q肽

突变体IDH 2R140Q(AA 134-143，SPNGTIQNIL)和野生型IDH 2威汤哥(SPNGTIRNIL)肽是HLA-B*07：02上的Phla复合物52,53。NetMHCPAN预测与HLA等位基因结合的肽，估计突变的IDH 2R140Q与其他常见的HLA等位基因相比，肽与HLA-B*07：02等位基因结合紧密200倍。鉴定能选择性针对IDH 2的TCRm抗体R140Q-pla，筛选出两个显示单链可变片段(Scfv)的组合噬菌体库(Scfv)，以筛选可选择性针对突变体idh 2的结合剂。R140Q-HLA-B*07：02但不是野生型IDH 2威汤哥-HLA-B*07：0239,40。噬菌体展示方法不仅可以方便地移植到多种治疗平台上，而且还可以实现协议定制，有利于严格的负面选择。用含IDH 2的HLA-B*07：02 Phla单体进行阳性选择。R140Q肽，并对含有IDH 2的Phla单体进行了阴性选择。威汤哥肽。对筛选的噬菌体克隆进行扩增，评价其与RPMI-6666细胞结合的能力。RPMI-6666细胞内源性表达HLA-B*07：02，并通过流式细胞术表达突变体或WT肽。获得了5个选择性结合IDH 2的噬菌体克隆。R140Q但不是IDH 2威汤哥(补充图。1，补充表1).

设计一辆能够瞄准IDH 2的汽车R140Q-HLA-B*07：02，我们重点研究了CAR分子的胞外组分-结合区(这里是一个scFv)和Car的铰链区。基本CAR设计采用第三代结构，包括CD 28跨膜结构域和两个胞内结构域，4-1BB和CD3ζ信号域(图1)。1A)。Car铰链/间隔区的定制已被探索为提高治疗活性的一种手段。54,55,56,57,58,59,60,61。因此，在评估五个IDH 2之前R140Q新表位特异性单链抗体(ScFv)在CAR T细胞格式中，我们首先寻求优化汽车的铰链区域.筛选了以前在其他CAR设计中使用过的四个铰链区：一个来源于CD8α，两个来自不同长度的CD 28，另一个来自免疫球蛋白γ1(IgG 1，mufc)(图1)。1A)。CD8α和短CD 28(CD28s)铰链来源于各自受体的膜-近端茎区，直至其Ig-样V型结构域。长CD 28铰链(CD28l)与CD28s铰链相似，但包含一部分Ig样V型结构域，直至膜近端半胱氨酸残基负责二硫键内键合。突变片段结晶区(Mufc)铰链是由恒重链2(C)推导而来的。H2)，以及恒重链3(C)H3)IgG 1区。在pg1-fcγ受体(fcγr)的pg1-fcγ受体(fc g1-fcγreceptor，fc fc r)中加入突变，以减少非目标car的激活。62。为了确定一个特定的铰链是否会促进多个HLA限制的MANA目标的更好的靶向性，四个汽车铰链与三个tcrm scfv联合测试，每个tcrm scfv针对来自三个常见HLA等位基因的独特突变phla复合体：kras。G12V-HLA-A*02：01，β-cateninCTNB1S45F-HLA-A*03：01和IDH 2R140Q-HLA-B*07：0239,40。采用基于mRNA的表达系统，快速检测人T细胞中的候选CAR结构。优化的系统允许近100%的电穿孔效率，同时保持较高的细胞活力(附图)。2)。用上述CAR构建物构建的T细胞与负载相应突变体和WT肽的靶细胞共孵育后，通过干扰素-γ(IFN-γ)释放来评估T细胞的反应性。在所有三个被检测的目标HLA等位基因中，CD8α铰链在突变肽浓度谱中提供了最高的信号，因此被选为首选的铰链设计(图1)。1B).

针对IDH 2的五个scFVS(1Q4，2Q1，2Q3，2Q8，2Q29)R140Q-HLA-B*07：02移植到CD8α铰链优化CAR结构中，在原代人T细胞中表达。与cos-7细胞共孵育时，可与编码HLA-B*07：02的质粒共转染，或与全长IDH 2共转染。R140Q或IDH 2威汤哥，携带2q1轿车的T细胞对IDH 2表现出最强的激活信号。R140Q，用干扰素-γ释放评价。此外，这些T细胞对IDH 2的反应性最低威汤哥(无花果)1C)。因此，2Q1轿车被选为主要候选车型。值得注意的是，cp8α铰链优化的2q1轿车对idh 2高度敏感。R140Q新抗原，作为质谱数据，从转染的COS-7细胞表明IDH 2。R140Q抗原密度为25拷贝/细胞53。表面等离子共振(SPR)进一步评价克隆2Q1的特异性。在高浓度时，克隆2q1与IDH 2有可检测的结合。威汤哥-HLA-B*07：02KD>800 NM(图1)。1D)。相比之下，克隆2q1与IDH 2更紧密地结合在一起。R140Q-HLA-B*07：02KD=44海里，ak在……上面1.59×106 M−1 s−1，以及k脱9.66×10−2 s−1(无花果)1E，补充表2).

IDH 2R140Q表位埋藏在肽-HLA-B*07：02结合分裂中。

为了研究2Q1选择性的结构基础，我们确定了肽结合HLA-B*07：02的结构。2A-E表1)。IDH 2威汤哥和IDH 2R140Q肽结合在基本相同的构象中，与肽Cα原子排列，产生0.193的均方根偏差(如图所示)。2F)。两种HLA结合肽的唯一差异在于突变位点。令人惊讶的是，表位残基IDH 2140，深埋在HLA-B*07：02结构的肽结合沟中，与其他MANA-Phla靶标形成对比(图1)。2B，d，e)40,49,63。在IDH 2中威汤哥肽，IDH 2R 140由位于HLA-B*07：02的β板地板和α2螺旋中的残基保存。具体来说，IDH 2R 140是通过盐桥与asp 114(β-Sheet)、与Arg 156(α2)和Tyr 116(β-Sheet)的氢键以及π-π与Tyr 99(β-Sheet)的相互作用来实现的。2F)。在IDH 2中R140Q肽，IDH 2R140Q也与Arg 156和Tyr 116相互作用，但较短的侧链长度阻止了与Asp114的相互作用。2F)。此外，IDH 2的替代R 140谷氨酰胺废除π-π与Tyr 99的相互作用。这种相互作用的损失导致络合物的熔化温度降低了5°(附图)。3).

aIDH 2的总体结构威汤哥与HLA-B*07：02结合的肽(PDB ID 6UJ8)。IDH 2威汤哥-HLA-B*07：02复合物在重链之间形成杂二聚体，以白色表面表示，β2-微球蛋白以卡通形式表示。IDH 2的解析威汤哥-HLA-B*07：02结构为2.25，平均B-因子为402. bIDH 2的鸟瞰威汤哥肽坐在HLA-B*07：02肽结合槽。IDH 2氨基酸残基威汤哥肽被标记。cIDH 2的总体结构R140Q与HLA-B*07：02结合的肽(PDB ID 6UJ7)。重链表示为白色表面，β2-微球蛋白表示为卡通.IDH 2的解析R140Q-HLA-B*07：02结构为1.9，平均B-因子为342. dIDH 2的鸟瞰R140Q肽结合在HLA-B*07：02结合口袋。利息剩余，IDH 2R140Q，被埋在肽结合槽中。e不同取向d)强调兴趣表的向下位置。f对WT和突变的IDH 2肽进行了结构比对，显示了感兴趣的表位残基与HLA-B*07：02的β板上的残基之间的相互作用。IDH 2肽残基用单字母氨基酸编码标记。HLA-B*07：02残基以绿色(突变体)和覆盆子(WT)标记，用三个字母的氨基酸编码标记，氢键用虚线表示。

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IDH 2 2Q1选择性的结构决定因素R140Q-HLA-B*07：02

肽结合构象与掩埋表位残基IDH 2有显著相似之处。R140Q，提出了2Q1如何选择性地结合突变体Phla的问题(图1)。1)。结晶scFv-phla复合物的尝试没有成功，因此2Q1 scFv序列被嫁接到IgG 1格式中，并以全长抗体的形式表达。经木瓜蛋白酶切割纯化2Q1-Fab片段。纯化2Q1-Fab/IDH 2的晶体结构R140Q-HLA-B*07：02三元复合体(附图)4A，b，c，d)在不对称单元中的一个复杂分子被改进为2.9--分解(如图所示)。3A表1)。尽管数据的分辨率有限，IDH 2的结合界面仍观察到了清晰的电子密度。R140Q肽和CDRs的2Q1-Fab(补充图。4E)。2Q1-Fab停靠IDH 2R140Q-HLA-B*07：02平行定位，对接角为20°。3B)被移到IDH 2的C端。R140Q多肽，入射角19°。2Q1-Fab/IDH 2的总埋地面积R140Q-HLA-B*07：02接口为12642，重链的贡献是轻链的两倍(802和462)2(分别)(补充表)3)。总体而言，2q1-fab总共与idh 2进行了43次接触。R140Q肽，主要由CDR-L1和CDR-H3介导。值得注意的是，IDH 2R140Q与2Q1-Fab直接接触，主链羰基与Arg 102(CDR-H3)侧链形成氢键。3A，c)。所有其他触点都与IDH 2上的相邻残基发生接触。R140Q肽。具体来说，IDH 2的主干网G 137在Asn 30(cdr-l1)的氢键范围内，而ddh 2。I 139位于由Asn 30，Thr 31，Ala32(CDR-L1)，Tyr 92(CDR-L3)，Trp 101和Arg 102(CDR-H3)组成的2Q1-Fab界面中。3A，c，d)。此外，IDH 2的羧基侧链N 141与Arg 102(CDR-H3)的主链氮形成氢键。相反，HLA-B*07：02的识别是由所有六种CDR介导的(如图所示)。3A)。2Q1-Fab与肽结合的α链共有116个接触，每条链的贡献相等。

从这些接触中可以看出选择性的决定因素。2Q1-Fab绑定和非绑定IDH 2 HLA-B*07：02的结构比对R140Q-pla结构在肽结合槽中没有明显的构象变化(补充图)。5A，RMSD 0.66Aover277Cα的HLA-B*07：02)。然而，2q1-fab束缚IDH 2的叠加R140Q-Phla和IDH 2威汤哥-Phla结构显示IDH 2的主链羰基有轻微变化。R140Q，这是该残基与2Q1-Fab之间唯一的直接相互作用。三维空间，补充图。5B)。我们假设在2q1-fab的arg 102(cdr-h3)与IDH 2的主链羰基之间形成电荷辅助氢键。R140Q是其选择性的关键(图一)。3A，c，d，补充图。5B)。Wt精氨酸残基IDH 2的长侧链R 140，被深埋在肽结合槽中，并与asp 114(Hla)形成额外的电荷相互作用，以及π-π与Tyr 99(Ha)的相互作用，即idh 2。R140Q无法形成(图)2F)。这在突变的肽骨架中创造了更大的灵活性，允许Fab结合引起的肽骨架的构象发生微妙的变化，并在Arg 102(CDR-H3)和肽之间形成氢键(如图所示)。3A，d，补充图。5B)。虽然仍有可能在WT Phla复合体中形成，但这种微妙的构象变化在突变的Phla复合体中可能更有活力。IDH 2之间羰基氧原子坐标的1.2aShiftR140Q在三元配合物(PDB ID 6UJ9，2.9 Au)和IDH 2中威汤哥在WT Phla结构(PDB ID 6UJ8，2.25Au)中，虽然很小，但大约是估计坐标误差0.41和0.2的3倍。为了验证这种氢键对亲和力的重要性，我们将Arg 102(CDR-H3)突变到一个丙氨酸残基(R102A)上，并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)评价了该克隆(2Q1.1)与WT和突变体Phla-B*07：02的结合。3E)。我们发现r102A突变完全消除了与WT和突变体phla的结合，证实了这个氢键对2q1与idh 2的整体亲和力和相互作用的重要性。R140Q-HLA-B*07：02

为了加深对2Q1识别的认识，我们对HLA-B异型进行了结构分析，重点研究了可能影响肽-MHC结合和TCRM抗体识别的多态性残基。例如，埋在HLA-B*07：02(HLA-B*27：01中的Asp116，HLA-B*35：01中的Phe 116)中的Tyr 116位于β片基上，处于IDH 2的氢键距离。R140Q，新抗原显示。这将显著影响新抗原与HLA的结合。另一个值得一提的多态残基是HLA-B*07：02中的Asn 63(HLA-B*27：01中的Glu63和HLA-B*13：01中的Glu63)，因为谷氨酸多态性会与IDH 2位置2处的脯氨酸锚定残基发生冲突。R140Q肽64.

2q1-fab在与目标idh 2结合时会经历构象变化。R140Q-HLA-B*07：02

为了评估Phla结合后的2Q1-Fab是否有构象变化，我们以自由形式确定了2Q1-Fab的结构。在不对称单元中有4个2Q1-Fab拷贝，肽Cα原子对齐，成对RMSD值为0.25~0.32。总的来说，这四个拷贝的结构是相似的，唯一的显著差异是CDR-H3(补充图3)的构象。6)。这很可能是这个循环固有的构象灵活性的结果。非束缚2Q1-Fab分子Cα原子与IDH 2的结构排列R140Q-HLA-B*07：02绑定2Q1-Fab显示一对RMSD值在1.2和1.4之间。这个叠加显示轻链中的RMSD为1.3Au位移(最大RMSD为3.6Au)，而重可变链的β片外链扩展以适应与HLA-B*07：02的结合，RMSD为1.5(最大RMSD为7.4Au)(补充图)。6)。2Q1重链的三个CDR均表现出明显的构象变化(图1)。4A)。具体而言，与HLA-B*07：02α1和α2的N末端结合分别引起CDR-H1和-H2的构象变化，而与IDH 2肽的C-末端结合则导致CDR-H3构象的改变，从而优化了与Phla的结合(图1)。4A，b).

2Q1瞄准单元的结构导向优化

为了提高2q1的选择性，我们在感兴趣的idh 2表位残基(Idh 2)的8个中突变了所有cdr残基。R140Q，对其他19种天然氨基酸进行分析，并计算突变体Phla亲和力的预测变化。选择8个针对CDR-H3(氨基酸W 101，Y 103)和CDR-L1(氨基酸A32)的单氨基酸替代物，根据它们的结合亲和性进行实验评价(附图)。7A，补充表1)。这些变异体，连同亲本2Q1，在细菌中以scFVS(补充图)的形式重组表达。7b)或在哺乳动物细胞中以IgG1s(补充图1)的形式表达。8).

首次用滴定ELISA法研究了2q1及其变体与固定化IDH 2的结合情况。R140Q-HLA-B*07：02和IDH 2威汤哥-HLA-B*07：02单体。虽然大多数被测变异体与突变单体失去结合，但2Q1.4scFv和IgG 1(Y103H突变)仍然与突变单体结合，与WT单体无明显结合；这与亲本2Q1 scFv和IgG 1形成对照，后者显示与WT单体有可检测的结合性(图一)。5A，b，补充图。9).

为了进一步探讨2Q1.4的Y103H突变所赋予的特异性，采用扫描诱变技术，通过系统地替换目标IDH 2的每个氨基酸，得到一个肽库。R140Q含有其余19个氨基酸的肽(SPNGTIQNIL)65。然后通过流式细胞术检测2Q1和2Q1.4IgG1s与RPMI-6666细胞的结合情况。与2Q1 IgG 1相比，2Q1.4 IgG 1在多个位置上的结合特征比包括P3(IDH 2)在内的2Q1 IgG 1更特异。N 136)，P5(IDH 2)T 138)，以及突变氨基酸P7(IDH 2)的位置。R140Q)(图1.5C，d，补充图。10)。2Q1和2Q1.4的识别模式也被说明为序列标识(图1)。5C，d)。SPR进一步评价2Q1.4的结合特性和特异性。高浓度时，克隆2q1.4与IDH 2无明显结合。威汤哥-HLA-B*07：02(图1)5E)。然而，2q1.4与亲本2q1相比，与亲本2q1相比，亲和力下降了4倍，对突变单体的亲和力降低了4倍。KD=175海里(图1。5F，补充表2).

确定2Q1.4是否能提高汽车抗IDH 2的活性R140Q-携带靶细胞，表达2q1或2q1.4 scFv的CAR T细胞与负载IDH 2的rpmi-6666细胞共同孵育。R140Q或IDH 2威汤哥肽。与酶联免疫吸附试验和肽定位扫描结果一致，2q1.4 car对idh 2的反应减少了离靶效应。威汤哥而且，令人惊讶的是，对IDH 2的反应改善了目标的活性。R140Q用干扰素-γ的释放来评估。6A)。同时，细胞毒性曲线也反映了细胞因子的释放(图1)。6B).

2q1变异的CAR T细胞与rpmi-6666细胞与IDH 2共同孵育。R140Q或IDH 2威汤哥效应器与靶(E：T)之比为1：1的多肽.a用酶联免疫吸附法(ELISA)测定IFN-γ释放的T细胞活性.条形图表示三个技术复制的平均值±SD，而开圆表示单个数据点的平均值。b用稳态-Glo法测定细胞毒性。条形图表示三个技术复制的平均值±SD，而开圆表示单个数据点的平均值。源数据作为源数据文件提供。

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肿瘤特异性抗原的缺乏仍然是临床上广泛应用诸如CAR T细胞等强大免疫治疗药物的主要障碍。癌症的基因改变，特别是热点驱动基因突变，提供了靶向特异性，传统的TAA相关靶标由于其在肿瘤中的独家存在，而不是正常细胞。此外，驱动基因突变的克隆性以及它们在肿瘤进展中所起的重要作用，与传统的肿瘤靶标相比具有重要的优势。传统的肿瘤靶点存在与肿瘤异质性相关的问题，以及抗原下调或缺失引起的抗药性问题。在这里，我们描述了一个概念的证明方法，使用CAR T细胞来利用这些基因弱点来治疗携带MANA衍生的突变肽与HLA复合的癌症。

各种蛋白质和细胞工程方法已被用于靶向肿瘤抗原等，包括tcr-CD3双专一性药物。66，TCRm-CD3双专一性63，TCRM：TCR-T细胞67，TCR-T细胞34，以及这里描述的TCRM：CAR T-cell方法。TCRM：CAR T方法可以通过CD 28和4-1BB将抗原依赖性的共刺激结合起来，这一特性在成功地将CAR T细胞转化到临床中是必不可少的。

针对呈现wt肽的phla复合物的CARS已经产生；然而，据我们所知，只有另外一个针对反复的司机基因突变的汽车报告。47。最近报道的一种基于质谱的分析证实了IDH 2的加工和呈现。R140Q-HLA-B*07：02并量化IDH 2抗原密度R140Q转染COS-7细胞的肽约为25拷贝/细胞53。Tcrs是phla复合物的天然靶向分子，它可以引起对一种或几种抗原的反应，而迄今为止发展起来的大多数car似乎都需要一个抗原密度阈值，即每个细胞几百到数千个。16,61,68,69,70,71,72,73。为了解决这一问题，我们设计了CAR设计，以提高灵敏度，适用于低抗原密度靶标，如本文所述的MANA衍生突变肽与HLA络合。Cars铰链区域的优化曾被报道为一种提高肿瘤细胞抗TAA靶点(如CD 19、psca和ror 1)的治疗活性的手段。54,55,56,57,58,59,60,61,74。然而，针对MANA-Phla综合体的汽车铰链区域的定制还有待探索。在此，我们系统地筛选了针对不同HLA等位基因背景(A*02：01、A*03：01、B*07：02)的三个新抗原特异性TCRMscFVS的4个铰链，并确定CD8α铰链对我们已知的肿瘤特异性MANA-Phla复合物最为敏感。鉴于这三种靶抗原都具有相似的结构，CD8α铰链被普遍证明是最敏感的--可以想象，通过在CAR T和靶细胞之间提供最佳间距来促进更高质量的免疫突触，这一点也就不足为奇了。然而，针对其他抗原的CAR T细胞可能需要单独的优化努力来确定给定目标的最有效的铰链。

本文描述的三元复合结构提供了对2q1-fab tcrm与埋藏的idh 2的独特结合特性的洞察。R140Q突变残基及其特异性的结构基础。由于掩埋残余物的长度和相互作用，骨架柔韧性和构象的细微差别使得2Q1-Fab具有选择性。这与已知的隐藏病毒逃逸突变体形成鲜明对比，后者会导致肽膨胀。75。重要的是，晶体结构使TCRm/Phla相互作用的分子模型得以建立，从而确定了一种具有更好的结合性能的变异体(2Q1.4)--特别是识别突变体Phla与野生型Phla的特异性--然后可以转化为汽车目标平台。

目前尚不清楚2Q1.4中CDR-H3处Y103H的简单变化如何使整个肽序列的选择性有如此显著的提高。Cdr-H3直接通过生成重要的氢键，间接地影响CDR-L1、L2和L3的构象，对肽的识别起着重要的作用。我们建议单氨基酸从酪氨酸转变为组氨酸，通过CDR-H3向CDR-L1-L3传递构象变化，从而影响IDH 2肽序列的选择性。关于突变体与wt的选择性，组氨酸可能允许arg 102(cdr-h3)更好地定位，从而在idh 2的主干上形成关键的电荷辅助氢键。R140Q.

值得注意的是，虽然2Q1.4的亲和力低于亲本2Q1克隆，但2Q1.4 CAR不仅对WT-肽细胞的失靶活性较低，而且对突变肽呈递细胞的反应性增强。这可以用相互作用的动力学来解释。虽然2Q1.4的亲和力较低，但其下降率却慢了112倍，导致住院时间更长，功能效力更好。然而，利率则慢了三个数量级(324倍).一个潜在的解释是，亲本Fab，2Q1的构象集合偏向于结合构象，并导致更快的结合率。2Q1.4重链Y 103向组氨酸的突变改变了这一构象系综，使其不再偏斜于结合构象，也改变了结合构象。反过来，关联更紧密的Phla-2Q1.4-Fab会导致较慢的下降率.这些结果表明，与仅结合亲和力相比，关闭率是一种更好的功能效能指标。76。未来的研究结合了基于无偏高通量单元的筛选方法，并结合计算结构建模，可以帮助进一步澄清设计参数并提高变体识别的命中率。

以体细胞突变为目标的其他治疗方法IDH 2已经被开发出来了。Enasidenib是一种小分子抑制剂，最近被fda批准用于治疗复发或难治性疾病。IDH 2-突变型AML23,77,78,79。不幸的是，依那西丁下的复发发生在大多数患者身上，最近的一项研究表明，获得性耐药的一种机制是随着继发部位的出现而发生的。IDH 2突变(Q316E和I319M)，与突变体R140Q一起，破坏enasidenib的结合并诱导产生2 HG的突变(Q316E和I319M)28,80,81。这种耐药机制类似于其他酪氨酸激酶抑制剂治疗后产生的继发性耐药突变。82。相比之下，我们针对IDH 2的策略R140Q通过HLA的表面呈现，不仅提供了一种针对这种关键突变的替代方法，而且还绕过了小分子抑制剂常见的二次位点抗性突变。这一方法也可以推广到治疗其他癌症的IDH 2突变，但目标治疗尚未成功。

我们研究的一个局限是缺乏对细胞内表达IDH 2的测试。R140Q和HLA-B*07：02。据我们所知，这将是检测我们的CAR T细胞的最理想的环境，但我们无法找到任何商业上可获得的细胞株，这些细胞体内含有必需的IDH 2突变和相应的HLA-限制性元件。

综上所述，我们已经证明，有可能开发出一种基于CAR T细胞的治疗模式，包括一个工程铰链结构域和一个结构导向的结合单元，可以针对在一个常见HLA等位基因背景下出现的热点驱动基因突变。这一方法建立在CAR T细胞治疗血液系统恶性肿瘤的临床成功的基础上，并作为一项概念研究的证据，将这一治疗平台扩展到其他具有传统方法治疗挑战的突变的癌症。尽管包括临床前动物模型和人类临床试验在内的后续研究最终将决定这种方法是否能成功地治疗癌症患者，但本文所描述的目前的工作为这种未来的探索奠定了基础。