ScRNA-seq表征的ESCC生态系统综述 为了破译ESCC肿瘤内的细胞组成，我们用10X基因组学平台对60例ESCC肿瘤和4例相邻正常组织标本进行了scRNA-seq和T细胞受体(TCR)-seq(仅针对CD 45+细胞)的检测。1A ；补充图。 1A ；补充数据 1 A和 2 )。在质量控制后，我们保留了208,659个细胞的单细胞转录组，包括97,631个CD 45−和111,028个CD 45+细胞。根据阅读深度和线粒体阅读计数进行回归后，对CD 45−和CD 45+数据集进行基于图形的聚类，并用已建立的标记基因对聚类进行标注(图一)。 1B，c ；补充图。 1B，c )。我们鉴定了8个主要细胞群：上皮细胞( N =44,730)，成纤维细胞( N =37,213)，内皮细胞( N =11 267)，周细胞( N 和成纤维细胞网状细胞(FRC)； N =1 319)来自CD 45−数据集和T细胞( N =69 278)，B细胞( N =22,477)和髓系细胞( N =19 273)来自CD 45+数据集。上皮细胞表现出典型的上皮标记物的高表达水平，包括 埃帕姆 , SFN， 和细胞角蛋白，和高度的基因组不稳定性，证明了严重的拷贝数变异(CNVS)推断的转录组数据集和整体基因组测序(WGS)结果(补充图)。 1D-g )，表明大多数上皮细胞是恶性的。然后，我们系统地分析了每个ESCC的生态系统组成，发现在患者内部和患者之间，细胞类型的比例变化很大，有些变化与组织类型和肿瘤分期有关(补充图)。 氢 )。与癌旁正常组织相比，ESCC肿瘤有更多的上皮细胞和周细胞，而成纤维细胞较少( P < 0.05; Fig. 1B ；补充图。 1I ；补充数据 3 和 4 )。B细胞在Ⅱ/Ⅲ期ESCC肿瘤中所占比例明显低于Ⅰ期肿瘤( P =0.013；附图。 1J )。这些结果表明，ESCC生态系统具有高度异质性，应在下面的分析中进一步加以解释。
图1：以scRNA-seq为特征的ESCC生态系统概述。 a 总体研究方案设计。 b , c TSNE 97,631个CD 45-细胞图( b )和111,028个CD 45+细胞( c )，按单元格类型( 左边 )和组织类型( 右上角 )。正常组织和肿瘤组织中细胞类型的比例显示在右下角(颜色如左面板)。肿瘤组织中显着增加的细胞类型(填充颜色的固体线)或减少的细胞类型(双面Wilcoxon检验)， P < 0.05) are indicated by links between normal and tumor bars. P 值：0.001(上皮细胞)，0.001(成纤维细胞)，0.010(周细胞)。
上皮细胞肿瘤内异质性与肿瘤间异质性的相关性 然后我们研究了上皮细胞表达状态是否和如何变化。通过分析52个上皮细胞>100个的肿瘤中上皮细胞的转录组型，我们发现它们可以分为38个簇(图1)。2A )。然后我们分析了患者对每个簇的贡献，发现24个簇有来自单独个体患者的细胞(≥75%)，而其他14个簇有多个患者共享的表达模式(图1)。2B )。我们将24个簇定义为第1组(≥为75%的个人细胞)，其余为第2组。我们发现第1组细胞增殖和EMT的途径活性增加，而第2组出现免疫相关的激活，如补体、炎症和IL2/STAT 5信号(补充图)。 2A )。我们还比较了每个食管鳞癌的上皮成分，发现21例食管鳞癌主要由1组组成(≥60%)，31例由多组2组组成(图1)。 2C )。这些结果表明在ESCC中存在着广泛的肿瘤内和肿瘤间异质性.
图2：上皮细胞的肿瘤内异质性与肿瘤间异质性的相关性。 a TSNE图：44,122个上皮细胞，成簇着色。只显示至少100个上皮细胞的肿瘤。 b 饼图显示来自每个病人的细胞比例，在每个簇中检测到，由病人着色。按最主要病人的比例排列簇，分为第1组或第2组。 c 层叠的直方图显示每个病人的上皮细胞簇所占的比例，按簇着色，如( a ). d 根据病人的平均(黄星)和全局平均(红星)，示意图地显示了每名患者的肿瘤内(实线)和肿瘤间(虚线)异质性的定量方法。 e 散射图显示肿瘤内异质性与肿瘤间异质性呈正相关。双边Spearman相关系数和 P 表示值。阴影区域表示相关的95%置信区间。 f 包涵体图显示1组(绿色组)和无1组组(黄色组)患者肿瘤间相对异质性水平。盒形图显示中间线(中心线)，25%-75%的四分位数范围(盒限)，±1.5倍的IQR(图基晶须)。
我们用主成分测量上皮细胞的肿瘤内和肿瘤间异质性水平。肿瘤内异质性定义为细胞从每个样本中的平均分散，而肿瘤间异质性的特征是每个样本与全球平均水平之间的细胞距离，如图所示。 二维空间 (见“方法”)。我们对肿瘤内和肿瘤间异质性的水平进行了综合量化，发现它们是正相关的。 r =0.64， P =7.3×10 –7 ；图1. 2E ；补充图。 2B，c )。在肿瘤内异质性水平相同的患者中，具有第1组异质性的患者肿瘤间异质性水平相对较高( P =1.2×10 –7 ；图1. 2e，f；补充图2D )。相对异质性水平与ESCC患者的年龄和饮酒状况有关(附图)。 2E )。年龄>60岁的食管鳞癌的相对异质性水平显著高于年龄>60岁的食管鳞癌的相对异质性水平(P<0.01)。 P ，而非饮酒者的ecc亦高于饮酒者的ecc( P =0.048)。
食管鳞癌上皮细胞8种常见表达程序的鉴定 我们开发了一种元聚类方法来揭示多个样本中恶性细胞间的共同表达程序。我们首先在每个样本中对上皮细胞进行聚类，在52个ESCC肿瘤中共产生274个肿瘤内亚群。然后，我们为每个子簇定义了一个表达模块，每个子簇中有30个优先表达的基因，然后将274个模块聚合到多个递归表达程序中，根据它们的表达谱进行层次聚类。我们鉴定了8个不同功能和细胞状态的表达程序(图)。 3A，b ；补充图。 2F，g ；补充数据 5 )并将表达≥基因的70%的细胞定义为程序细胞(补充图)。 2H )。通过与非程序细胞的比较，我们选择了程序细胞中最活跃的通路来分析它们的功能(如图所示)。 3C )。粘膜免疫样(粘膜)程序的特点是与先天免疫反应相关的基因的表达(例如， S100P )和粘膜防御机制，包括粘膜趋化因子(例如， CXCL 17 )和粘液的产生(例如， AGR 2 和 MUC 20 )。粘膜细胞表现为补体激活、肿瘤坏死因子α信号传导、细胞凋亡和炎症反应通路。应激反应(压力)程序包括即时的早期基因(例如， Egr1 , 君， 和 FOS )在广泛的细胞刺激下被激活，并表现出对肿瘤坏死因子α信号、紫外线反应、p53和凋亡通路的上调。抗原呈递(AP)程序增加了主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子的表达(例如， CD 74，HLA-DPA 1， 和 Hla-DRA/B1/B5 )参与启动适应性抗肿瘤免疫反应。免疫相关途径，如同种异体排斥反应、干扰素-γ、干扰素-α反应、补体通路等，在AP细胞中被激活，可能表明其对肿瘤新抗原的反应性。细胞周期计划的特点是细胞增殖相关基因的高表达(例如， CENPW , CKS1B， 和 BIRC 5 )并呈现E2F靶点、G2M检查点和MYC靶通路的激活，提示肿瘤细胞增殖。两个程序与上皮分化(Epi1/2)有关。Epi1程序的特点是应力角蛋白的表达。 KRT 6 , KRT 16 ，和 KRT 17 )与角质形成细胞增殖有关，因此可能在促进肿瘤发生和肿瘤生长中发挥作用。 35 ,36 ,37 。Epi1细胞具有促进细胞生长和增殖的途径，如mTORC 1信号通路和PI3K/AKT/mTOR信号通路，以及氧化磷酸化和糖酵解等代谢途径。Epi 2程序具有与终末分化相关的高表达基因，如包膜蛋白(Epi2)。 SPRR1A/1B )和钙保护素( S100A8/9 )、根尖表面、PI3K/AKT/mTOR信号、补体和p53通路。间充质细胞样特性(Mes)程序由以下基因组成： 维姆 和 SPARC 并显示上皮间充质转换(EMT)和血管生成途径的激活。最后，氧化应激或解毒(Oxd)程序的特点是表达多种过氧化物酶和还原酶(例如， GPX 2 和 AKR1C1 )参与防御氧化损伤。
图3：食管鳞癌上皮细胞8种常见表达程序的鉴定。 a 热图显示来自52个肿瘤的274个模块的配对相关性。跨肿瘤的共同表达程序聚集成簇。 b 热图显示单个细胞内每个程序中基因的表达。每个程序随机选择500个单元。列上的颜色对应于单元格状态(请参阅方法)。 c 热图显示每个程序的程序细胞和非程序细胞在路径活动上的差异。每一列都以z记分进行归一化，以指示相关的通路活动. d 热图显示每一对程序(行、列)的比数比，如果它们是并发的(≥2，红色)或排他性(≤0.5，蓝色)，则是偶然的。 P < 0.05). P 数值是从成对的Fisher精确测试中得出的。 e 显示每个肿瘤的程序细胞比例(以下称为程序评分)的示意图( N =52)在8个表达式程序中，按中位程序得分排序。盒形图显示中间线(中心线)、25%-75%的四分位数范围(盒限)、±1.5倍的IQR(图基晶须)和所有数据点，其中最低值和最高点分别表示最小值和最大值。 f 聚类热图显示每个肿瘤中所有程序的归一化程序分数。
我们进行了依赖分析，推断了表达程序之间的成对交互作用，确定了5个显著的共现程序对以及7个优势比为≥2和≤0.5的互斥程序对(ALL)。 P < 0.05) (Fig. 三维空间 )。Epi1与Epi2高度共存，可能反映了Epi1和Epi2对上皮细胞分化的需要。Epi1程序也与循环程序同时发生，可能反映了Epi1细胞中细胞生长和增殖途径的激活。Epi2程序与粘膜程序高度共存，提示粘膜免疫存在于高分化上皮细胞中。粘膜程序不包括循环程序和MES程序，而MES程序不包括Epi1、Epi2和Oxd程序。AP程序不包括Epi2和Oxd程序。通过将程序分数量化为相应程序单元的比例，我们进一步测量了这些程序在每个ESCC中的活动(如图所示)。 3E )。然后根据项目评分对患者进行分级聚类(图一)。 3F )。我们观察到大多数ESCC肿瘤含有表达多个程序的上皮细胞，Epi1评分在肿瘤中差异很大，中位数为0.38(0~0.97)。Epi1评分高的患者常有较高的循环评分。Epi2和粘膜计划的活动量很小，患者的中位得分为0.03。这些结果表明，ESCC肿瘤的上皮细胞有8个表达程序，且每个程序的活性在肿瘤间高度不均匀。
免疫抑制型ESCC肿瘤微环境的研究 由于T细胞是最丰富的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，在TME中具有高度异质性，解剖T细胞群可以准确地描述肿瘤的免疫状态。我们重新聚集了69,278个T细胞，并鉴定出9种不同的T细胞亚型和表型相关的自然杀伤(NK)/自然杀伤T(NKT)细胞(图)。 4A ；补充图。 3A，b ；补充数据 6A )。T细胞亚型包括幼稚T(T) N )细胞，T助手17(T) H 17)细胞，滤泡辅助T(T) FH 1/2)细胞，调节性T(T) 雷格 )细胞，记忆T(T) 米姆 -CD4/CD8)细胞，效应T(T) EFF )细胞与精疲力竭的T(T) 前 )细胞。与T FH 2细胞，T细胞 FH 1细胞在表达时更具有典型性。 CXCR 5 这对T很有帮助 FH 细胞定位于B细胞卵泡，促进B细胞的分化和成熟。我们发现ESCC肿瘤富含T。 雷格 和T 前 T细胞 N 、T 米姆 ，和T EFF 细胞与邻近正常组织比较，表明TME存在免疫抑制状态(图一)。 4A ；补充图。 3C ；补充数据 3 和 4 )。II/III期肿瘤T细胞较少 H 17和T FH 1个细胞，但T细胞较多 前 细胞比Ⅰ期肿瘤(补充图)。 三维空间 )。我们计算细胞毒性评分和衰竭评分来量化CD8+T细胞的特性(补充图)。 3E，f (见“方法”)并发现T 前 细胞毒性和衰竭评分最高。大部分T 前 细胞可能是肿瘤反应性T细胞，因为CD 39的高水平( ENTPD 1 )和CD 103( ITGAE )和非常低的水平 KLRG 1 (补充图。 第三代 )38 ,39 ,40 ,41 。我们还生成了一个Treg评分来量化CD4+T细胞的活性(补充图)。 3H )。我们发现，与Ⅰ期肿瘤相比，Ⅱ/Ⅲ期ESCC肿瘤的衰竭和Treg评分明显升高，表明ESCC TME中的免疫抑制状态随着肿瘤的进展而恶化(图一)。 4B ).
图4：免疫抑制性ESCC肿瘤微环境的特征。 a 69,278个T细胞的TSNE图，按细胞类型着色( 左边 )和组织类型( 右上角 )。正常组织和肿瘤组织中细胞类型的比例显示在右下角(颜色如左面板)。见图。 1B 线指示的图例。 b 示意图显示精疲力竭得分( 左边 )和Treg分数( 正确的 T细胞在Ⅰ期(N=16)和II/III期(N=44)的患者中均有不同程度的分布。 P 给出了双边Wilcoxon检验的数值.盒形图显示中间线(中心线)、25%-75%的四分位数范围(盒限)、±1.5倍的IQR(图基晶须)和所有数据点，其中最低值和最高点分别表示最小值和最大值。 c T细胞克隆大小着色的TSNE图。 d 条形图显示每个T细胞亚型中增殖细胞的分数。T细胞亚型的细胞数标记在右边。 e 按细胞类型着色的19,273个髓样细胞的tSNE图( 左边 )和组织类型( 右上角 )。正常组织和肿瘤组织中细胞类型的比例显示在右下角(颜色如左面板)。见图。 1B 线指示的图例。 f 小提琴图显示参与免疫抑制和血管生成的选定基因在单核细胞和TAM集群中的表达分布。 g 小提琴图显示参与DC成熟和免疫抑制的选定基因在三个DC簇中的表达分布。 h 表示 Pd-L1 和 Pd-l2 肿瘤组织中TDC含量较高( N =60)与正常组织比较( N =4；双面学生的 t -测试)。数据呈均值±扫描电镜。 i , j 用10：1的96孔板与人T-活化因子CD3/CD 28共培养100,000人外周血CD8+T细胞和tDCS。用100μg/ml滴注抗pd-L1，第1天和第2天用血细胞计计数t细胞数。 i )。用bd细胞珠阵列试剂盒测定共培养上清液中IL-2和IFN-γ的水平(P<0.0 5)。 j )。在( i , j ), P 值是由双面Wilcoxon检验得出的；* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. The data presented as mean ± SD and mean ± SEM in (i )和( j )分别。数据( i , j )代表每组的三个独立实验。 k 聚类热图显示肿瘤标本中免疫细胞亚型比例的双边Spearman相关系数。 P < 0.05 is used as the cutoff value.
我们对TCR序列进行了剖析，分析了ESCC中T细胞的谱系结构，发现TCR的克隆型组成和增殖细胞比例在不同的T细胞亚型之间差异很大(图1)。4C，d ；补充图。 3I )。T 前 克隆扩增水平最高(克隆大小为≥3细胞；附图)。 3I 增殖率最高(几乎是增殖T的10倍)。 EFF 细胞)(如图所示)。 4D )。通过测量与另一种T细胞亚型(次级表型)共有的T细胞亚型(初级表型)中的克隆型比例，发现CD8+细胞亚型具有高度的克隆性共享和T细胞间的广泛转换。 EFF 、T 前 ，和T 米姆 亚型(附图) 3J )。CD4+T细胞亚群，T除外 FH 1和T FH 2细胞，与T细胞的克隆共享程度较低，与T细胞的零共享程度较低。 雷格 细胞。这些结果表明T 前 在整个ESCC进展过程中，免疫抑制性TME中的细胞高度增殖和活跃。通过对4例配对肿瘤及癌旁正常标本的scTCR-seq和scrna-seq数据的分析，发现肿瘤中23.9%的T细胞克隆与正常人有共同之处，提示T细胞的平行扩张。 EFF 和T 米姆 -这些地点的CD8(补充数据) 7 )42
我们还分析了B细胞( N 在ESCC肿瘤和癌旁正常组织中均产生5种亚型，分别为静息B、活化B、生发中心B(GC B1/B2)和浆细胞(附图)。 4A，b ；补充数据 6B )。高 MKI 67 和 TOP2A GC B2细胞中的表达表明这些细胞具有增殖活性(附图)。 4B )。GC B、FRCs和T的存在 FH 细胞表示存在三级淋巴样结构(TLSs)，在其他免疫抑制性TME中发挥抗肿瘤作用。 43 。这些B细胞亚型提供了在ESCC肿瘤中B细胞活化、增殖和分化的关键快照。
TDC在免疫抑制ESCC微环境中的作用 由于肿瘤浸润性髓系细胞(Tims)已被证明是调节先天和适应性免疫反应和促进肿瘤血管生成、侵袭和转移的基础。 44 ,45 ，我们重新聚集所有髓系细胞( N 审查它们在经济、社会和文化委员会中的地位和潜在作用。我们发现ESCC中有11个亚型，包括单核细胞(Mono01-03)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM01-04)、肥大细胞(Mast)和树突状细胞(DC)。 4E ；补充图。 4C ；补充数据 6C )。DC有三种不同的亚型，即常规DC(CDC)、耐受性DC(TDC)和浆细胞样DC(PDC)。我们发现单核细胞和TAMS不仅表达与免疫抑制相关的基因(例如，TGFβ1 和 COX 2 )，也包括与血管生成有关的基因(例如， VEGFA , CXCL 8 , MMP 9 和 MMP 12 )(图1. 4F ). VEGFA 在单核细胞中被上调，而 MMPs 主要表达于TAMS。
成熟的cdc有高表达的mhcⅡ类分子(例如， 拉德拉 )，共刺激因子(例如， CD 80 和 CD 86 )和促炎细胞因子(例如， 肿瘤坏死因子 和 IL1B )，可以激活T细胞和其他抗肿瘤免疫(如图所示)。 4G )。与成熟的cdc相似，tdc也有较高的mhcⅡ类分子和共刺激因子的表达，而促炎细胞因子的无表达。 肿瘤坏死因子 和 IL1B 表明这些细胞具有半成熟的表型。此外，我们发现贸发局的表达水平最高。 CCR 7 ，这在本质上有助于免疫和免疫耐受。 46 ,47 ,48 ；pdc专门表达 ICOSLG ，一个与T的扩张有关的基因 雷格 细胞(附图) 4D )。此外，在所有免疫细胞亚型中，TDC的免疫检查点基因表达量最高( IDO 1 , Pd-L1 和 Pd-l2 )(图1. 4G ；补充图。 4D-f )。我们还发现ESCC肿瘤中有丰富的TDC和表达。 PD-L1/L2 TDC在肿瘤组织中明显高于癌旁正常组织(图1)。 4H ；补充图。 4G ；补充数据 3 和 4 )。配体-受体相互作用分析表明，在免疫抑制方面，TDC与多种T细胞的相互作用强于CDC、PDC或TAM(附图)。 4H )。从1例患者ESCC组织中分离的TDC和从人外周血中分离的CD8+T细胞与抗CD3/28刺激的自体CD8+T细胞共培养实验表明，tDCS对CD8+T细胞的增殖有明显的抑制作用。 4I )。此外，与tDCS联合培养的CD8+T细胞减少了IL-2和IFN-γ的产生.结果发现，在共培养中加入抗Pd-L1抗体后，CD8+T细胞增殖减少，IL-2/IFN-γ产生被抑制，提示TDC对CD8+T细胞增殖和活化的抑制作用可能是通过PD1和Pd-L1相互作用介导的。 4i，j )。这些结果表明TIM之间的tDCS在免疫抑制ESCC TME中起着至关重要的作用。
ESCC微环境中免疫细胞相互交织实体的鉴定 然后，我们研究了肿瘤标本中不同类型免疫细胞之间的相互作用和相互关系。细胞被聚成多个组，具有与其相关功能相一致的不同的关联模式(图)。 4K )。我们发现T N 、T FH 1、B细胞(活化、静息和GC B细胞)以及T细胞 H 17、T EFF ，和T 米姆 CD8细胞聚集成两大类，促进免疫应答。我们还鉴定了一个由T组成的免疫抑制组 雷格 、T 前 而血浆细胞与抑制型与有效免疫细胞亚型呈负相关。此外，我们发现CXCR 5+T的比例 FH 1细胞与胃癌B细胞高度相关( r =0.66， P =2.4×10 −9 ；图1. 4K ；补充图。 4I )，这与已知的事实是一致的，即这两种细胞类型在生发中心是直接相互作用的。 49 。这些结果表明，这些免疫细胞亚型之间存在广泛的相互作用，可能在构建免疫抑制型ESCC微环境中发挥重要作用。
成纤维细胞和周细胞分化特异性轨迹的表征 成纤维细胞和周细胞可通过周细胞-成纤维细胞的转变分化为肌成纤维细胞，是TME的两个重要组成部分，它们可能促进肿瘤的侵袭和转移。 23 ,50 ,51 。因此，我们研究成纤维细胞和周细胞在ESCC TME中的复杂性和动态关系。我们发现它们可分为正常粘膜成纤维细胞(NMF)、正常活化成纤维细胞(NAF 1/2)、癌相关成纤维细胞(CAF 1-4)、周细胞和血管平滑肌细胞(VSMC)9种亚型。 5A ；补充图。 5A，b ；补充数据 6d )。如图所示，这些成纤维细胞亚型具有明显的标记基因表达和通路活性。 5B 和补充图。 5C 。NMF表达了一组编码蛋白酶抑制剂的基因(例如， 斯皮 和 PI16 )以及参与补体、凝血、过氧化物酶体和凋亡途径的基因。NAF 1/2表达与伤口愈合反应相关的基因(例如， IGF 1 , C7， 和 APOD )。CAF 1和CAF 2表达促炎趋化因子(例如， CXCL 1 和 CXCL 6 )和其他细胞因子参与招募免疫细胞，显示出活化的炎症状态。有趣的是，虽然CAF 1表达了高水平的 CCL 2/11 和 CXCL 14 ，CAF 2细胞表达活化的周细胞特异性细胞因子。 CXCL 5/8 和 CSF 3 52 在所有成纤维细胞亚型中，炎症反应途径的基因表达最显著。CAF 3的表达模式类似于CAF 4(即肌成纤维细胞)，并且表达了较低水平的肌成纤维细胞标记基因(例如， TAGln，ACTA 2， 和 ACTG 2 )超过CAF 4。CAF 3和CAF 4对根尖连接和EMT通路均有上调作用。在所有成纤维细胞亚型中，CAF 4具有最高的糖酵解和血管生成活性，这是肿瘤的两个标志。此外，我们发现每种亚型都有不同的胶原储备；例如，nmf所有胶原基因的表达都低于cff，而cf4的表达水平最高。 COL1A1/2 , COL3A1 , COL5A1/2， 和 COL6A1/2/3 (补充图。 5D ).
图5：成纤维细胞和周细胞分化的特异性轨迹特征。 a 40,315个成纤维细胞的TSNE图，按细胞类型染色( 左边 )和组织类型( 右上角 )。细胞类型在正常组织和肿瘤组织中的比例显示在右下角。见图。 1B 线指示的图例。 b 点图显示各细胞簇中所选成纤维细胞标记的表达状态。 c 成纤维细胞扩散图。点表示按群集着色的单细胞。两支主要分化支用实心箭头表示。 d 成纤维细胞亚型的Paga分析。线路厚度对应于连接的级别。 e 显示CAF 3比例的方框图( 左边 )和CAF 4( 正确的 )在正常组织中( N =4)，第一阶段( N =16)和第二/三阶段( N 44)肿瘤(双侧Wilcoxon检验)。盒形图显示中间线(中心线)、25%-75%的四分位数范围(盒限)、±1.5倍的IQR(图基晶须)和所有数据点，其中最低值和最高点分别表示最小值和最大值。 f 11,267个内皮细胞的tSNE图，按细胞类型着色( 左边 )和组织类型( 右上角 )。细胞类型在正常组织和肿瘤组织中的比例显示在右下角。见图。 1B 线指示的图例。 g 热图显示不同内皮簇间GSVA对每个细胞的通路活性的差异。 h 小提琴图显示所选基因在内皮细胞簇中的表达分布。 i 显示选定配体-受体相互作用的点阵图。的平均表达水平的平均值。 PDGFB 在TECs和相互作用的受体中， PDGFRA 和 PDGFRb ，成纤维细胞亚型以颜色表示。 j 的平均表达与Spearman的相关性 PDGFB 在TECs和周细胞与内皮细胞的比值。 k 的平均表达与Spearman的相关性 PDGFB 在技术经济体系和CAF 2中所占的比例( 左边 )和CAF 4( 正确的 )分别在所有样本中。 l 聚类热图显示肿瘤标本中免疫和非免疫细胞亚型比例的双边Spearman相关系数。 P < 0.05 is used as the cutoff value.
扩散图和主成分分析显示成纤维细胞有两种不同的发育轨迹。 5C ；补充图。 5E 见“方法”)。在一个分支中，我们检测到从NMF到NAF 1/2、CAF 1、CAF 3和CAF 4的连续表型，但在另一个分支中，我们发现周细胞、CAF 2和CAF 4形成一个连续的连续路径。我们利用基于分区的图抽象(PAGA)分析推断了这些亚型之间的连通性结构，发现CAF 1与NAFS和CAF 4连接，而CAF 2是周细胞与CAF 4之间的连锁，这与扩散图分析的结果是一致的。 5D )。我们还发现转化生长因子-β通路在成纤维细胞向肌成纤维细胞转化过程中起着关键作用。 53 在CAF 1/2/3中激活(附图)。 5C )。提示正常成纤维细胞和周细胞均可分化为肌成纤维细胞。
有趣的是，NMF和NAF 1在正常组织中所占比例高于肿瘤组织，而CAF 2/3/4、VSMC和周细胞在肿瘤组织中所占比例明显高于正常组织。 5A ；补充图。 5F ；补充数据 3 和 4 )。此外，我们发现II/III期ESCC肿瘤有更多的CAF 3和CAF 4，但CAF 1较I期肿瘤少(图1)。 5E ；补充图。 5G )。这些结果表明在ESCC微环境中CAFs，尤其是肌成纤维细胞的积累可能在肿瘤的进展中起着关键的作用。
识别高 PDGFB TECs水平及其在周细胞-肌成纤维细胞转化中的作用 由于血管和内皮细胞(EC)在TME中经常表现出异常的表型和功能，这可能限制了它们对抗血管生成治疗的反应，因此我们讨论了这些问题。我们将EC(N=11,267)分为6个亚型，其中正常EC 3例(NEC1-3)，肿瘤EC 3例(TEC1-3)。 5F ；补充数据 6E )。NEC 1/2表达血管内皮标记物(例如， CPE 和 ACKR 1 )而Nec3则表达动脉标记物(例如， SEMA3G 和 GJA 5 )54 (补充图。 5H )。NEC 1在正常组织中普遍存在，而TECs仅存在于ESCC肿瘤中，TEC 2/3的表达增加。 ANGPT 2 这会破坏周细胞-EC的相互作用，从而促进血管生成。 23 (无花果) 5F ，补充图。 5H，i ；补充数据 3 和 4 )。我们发现，TECs在细胞增殖、血管生成、转化生长因子-β信号、内皮移植和能量代谢等方面具有特异性的激活途径。 5G )。值得注意的是，与抗原表达相关的基因表达水平较低(例如， CD 74 和 Hla-DQA 1 )和细胞粘附(例如， ICAM 1 和 VCAM 1 和NECS相比，NECS有阻止免疫细胞浸润的作用。 55 ，但与血管生成相关的分子表达较高(例如， VEGFR 1/2/3 和 PDGFB )比NECS(图1. 5H ).
由于PDGFb-PDGFRb信号通路在周细胞-肌成纤维细胞转化中起着关键作用，PDGFb主要由内皮细胞分泌。 51 我们分析了其在TECs与成纤维细胞特别是周细胞相互作用中的作用。根据配体-受体相互作用分析，我们发现TECs和周细胞之间有很强的相互作用。 5I )。周细胞与ECs的比值与细胞的水平呈正相关。 PDGFB 在技术经济共同体( r =0.52， P =8.6×10 −6 ；图1. 5J )的征聘作用。 PDGFB 为周细胞。此外， PDGFB 在TECs中，CAF 2所占的比例( r =0.64， P =1.2×10 −8 )和CAF 4( r =0.46， P =1.2×10 −4 ；图1. 5K )。此外，景观分析表明，MAPK下游的几种ETS家族转录因子(EHF、ELF 3和ETS 2)在CAF 2中被激活，并可被PDGFB-PDGFRb通路所诱导。 5J )56 。这些结果提示ESCC TME中的TECs可能通过诱导周细胞向肌成纤维细胞过渡而促进肿瘤血管生成，从而促进肿瘤的进展。
ESCC微环境中免疫和非免疫间质细胞的相互作用 接下来，我们根据免疫和非免疫基质细胞的关联模式，对相关的细胞亚型进行聚类，从而探讨免疫间质细胞与非免疫基质细胞之间的联系，从而形成良性和恶性的细胞群。 5L ；补充图。 5K-m ；补充数据 3 见“方法”)。良性组包括NMF、NAF 1、CAF 1和NECS亚型，恶性组包括CAF 2−4、TECs和VSMC。我们观察到良性组与有效免疫细胞(包括静息B、GC B、T)之间有很强的相关性。 N 、T FH 1、CDC和活化的B细胞，而恶性组则倾向于与抑制性免疫细胞(如T细胞)相关。 雷格 、T 前 、TDC和PDC。T型 雷格 细胞比例与CAF 2、−4和TEC 1/2成正相关，与NMF、NAF 1和NEC 2呈负相关。T型 前 细胞比例与VSMC和CAF 3成正相关。此外，T的比例 H 产生白细胞介素-17的17细胞，这是一种与周细胞活化有关的细胞因子。 52 ，与CAF 2的比例相关。 r =0.36， P =0.004；附图。 5N )，这与周细胞的发育轨迹一致，提示CAF 2可能是激活的周细胞。免疫和非免疫间质细胞之间广泛的相互作用可能形成免疫抑制的ESCC、TME，从而促进肿瘤的进展。我们还发现，患者的一些临床特征，如性别、吸烟状况和饮酒状况与TME细胞类型的比例显著相关(附图)。 5o ).
上皮表达程序和基因组改变与TME组成的关系 接下来，我们想看看在ESCC TME中，恶性上皮细胞和其他细胞之间的相互作用(图)。 6A 见“方法”)。我们发现黏膜计划评分较高的ESCC肿瘤的T值较高。 N 、T FH 1，NK/NKT，GC B和CDC，但T较少 前 、血浆、TDC和PDC。这类食管鳞癌也有较多的NEC 2，但CAF 2−4较少。AP程序评分较高的ESCC肿瘤表现出较多的T。 EFF 细胞，静息B细胞和NEC 2，但CAF 4和TEC 2较少。然而，循环计划评分较高的ESCC肿瘤T值较低。 米姆 CD8细胞、NMF、NAF 1/2、CAF 1和NEC 1/2较多，CAF 2/3和TEC 2/3较高，细胞毒性、耗竭性和Treg评分较高。Epi1评分高的ESCC肿瘤减少了有效免疫细胞的浸润(T) FH 1和GC B)和良性基质细胞(NMF、NAF 1/2和NEC 1/2)。相反，这些ESCC肿瘤含有更多的恶性CAF 3/4和TEC 1，具有较高的细胞毒性和Treg评分。
图6：黏膜程序中基因表达水平与食管鳞癌存活的相关性。 a 热图显示肿瘤组织的程序评分与TME组成的比例以及T细胞功能相关分数(以下简称T细胞分数)之间的双边Spearman相关系数。 P < 0.05 is used as the cutoff value. b 泡图显示了WES衍生的频繁突变基因的突变状态与程序评分、TME组成的比例以及T细胞评分之间的关系。突变肿瘤中显著增加或减少的成分(双面Wilcoxon检验)， P < 0.05) are indicated by purple or green, respectively. Circle size represents P 价值。突变型；野生型。 c 发现队列中程序基因表达水平与ESCC存活的关系( N =139)和验证组1( N =94)。基因在两个群体中的显着性是通过颜色来表示的。 P 对数秩 d 发现群的Kaplan-Meier(Km)曲线( N =139)按粘膜指数(MI)分组。 e 验证队列1的KM曲线( N =94)按MI分类。 f 3种粘膜基因在验证队列2中产生的IHC的代表性图像。所显示的是含有MI 1(12-9_A4和12-8_B4)和MI 2(12-4_C4)的样品。标尺，50μm。 g 验证队列2(N=226)的KM曲线按MI分组。 h 上皮细胞表达比例的关系 AGR 2 , CXCL 17 或 MUC 20 肿瘤组织总表达>0，粘膜评分。双边Spearman相关系数和 P 表示值。 i 发现组和验证组中粘膜基因高表达和低表达的肿瘤，GSVA所选择的通路活性差异较大。所示为 t 线性模型中的值。 P 数值为( d , e , g )是从对数秩测试中导出的。
接下来我们试图知道基因组的改变是否会影响ESCC生态系统。我们用全外显子测序法(WES)检测到了11个在ESCC中突变的驱动基因，其中最常见的突变基因是。 TP 53 (89.1%)和 NOTCH 1 (28.3%)(附图) 6A )。通过分析与TME相关的上皮表达程序评分和TME细胞类型比例的差异。 TP 53 或 NOTCH 1 突变状态下，我们发现ESCC肿瘤与突变体 TP 53 与野生型肿瘤相比，有更高的周期和Epi1项目评分和更高的免疫抑制水平。 TP 53 (无花果) 6B ；补充图。 6B )。这个 TP 53 突变还与更高的细胞毒性和Treg评分，增加TAMS，但降低T N 细胞和单核细胞浸润。相比之下，ESCC肿瘤 NOTCH 1 突变的Epi 1和Epi 2程序得分较低，而MES评分较高，反映了突变体的作用。 NOTCH 1 上皮分化中的信号传递(图。 6B ；补充图。 6C )。肿瘤伴 NOTCH 1 突变也增加了T EFF 细胞浸润比无肿瘤浸润 NOTCH 1 突变，表明突变可能产生了新抗原。通过综合分析 TP 53 和 NOTCH 1 ，我们发现了唯一的突变 TP 53 与T的比例降低有关 N 、T FH 1、GC B、静息B、单核细胞、NEC 2，血浆、TAM、TEC 1比例增加，细胞毒性和Treg评分较高(补充图1)。 6d )。对于肿瘤 TP 53 突变，突变 NOTCH 1 高渗T EFF 细胞，但Epi 1和Epi 2分数比野生型降低。 NOTCH 1 。突变信号还与恶性细胞的异质性水平和TME组成有关(附图)。 6E，f )。这些结果提示食管上皮细胞中某些驱动基因的体细胞突变可能导致上皮表达程序的改变和促进肿瘤进展的TME成分的改变。
黏膜程序中基因表达水平与食管鳞癌存活的相关性研究 由于上皮表达程序可以反映基因组改变信息，并推动ESCC TME成分的重构，因此，我们分析了上皮表达程序与疾病结局之间的关系。我们发现，在ESCC患者中，识别出的14个基因的表达水平与生存时间显著相关(DiscoveryCohort， N =139；全部 P 对数秩 6C ，补充数据 1 B和 8 )。在14个相关基因中， AGR 2 , CXCL 17 和 MUC 20 在粘膜计划中，94例ESCC患者的生存时间也显著相关(验证队列1；ALL；ALL)。 P 对数秩 7a，b ；补充数据 1 C和 8 ). AGR 2 编码一种对产生肠粘液必不可少的内质网蛋白，介导基本的先天免疫。 57 CXCL 17 产生一种粘膜相关的趋化因子，支持固有免疫和粘膜的稳态和完整性。 58 MUC 20 编码一种黏液蛋白，它是不溶性黏液屏障的一部分。 59 。这三个基因在上皮细胞中特异表达，因此可以通过大量组织RNA-seq(补充图)来测量。 7C )。我们进一步将这3种基因的表达水平归类为高(>中)或低(≤中位数)，并将其作为粘膜指数(MI)进行进一步分析。我们发现，在发现队列和验证队列1中，高MI(MI≥2)患者的中位生存期明显长于中度MI患者(MI=1)( P =0.057和 P 分别=0.039)或低MI(MI=0)( P =3.7×10 −4 和 P 分别=0.001)(图1。 6d，e )。另一组患者共226例，通过免疫组化染色证实3个基因表达水平与ESCC存活时间的相关性(验证队列2；图2)。 6f ；补充数据 1D 结果还表明，高表达的蛋白质(以H-评分形式表达)与ESCC的存活时间显著相关(ALL)。 P 对数秩 6g ；补充图。 7D-f )。我们发现上皮细胞表达的比例 AGR 2/CXCL 17/MUC 20 与scrna-seq数据中的粘膜程序评分相关( r =0.77， P =2.4×10 −11 ；图1. 六小时 )，表明这三个基因可以共同用来预测粘膜程序的活动。
我们进一步研究了粘膜程序相关的上皮变异体组织rna-seq数据的发现队列和验证队列1使用GSVA(图)。 6I )。在粘膜基因高表达和低表达的肿瘤间差异表达的标记通路中，EMT和血管生成通路在粘膜高表达肿瘤中均有明显下调，提示具有高粘膜活性的肿瘤具有抑制迁移和促血管生成的能力。抑癌基因p53相关通路在粘膜高表达肿瘤中明显富集，提示粘膜高肿瘤相对较轻。我们还发现，E2F靶点和G2M检查点通路在发现队列中被下调，表明具有高粘膜活性的肿瘤细胞增殖受到抑制。这些结果共同指出了一个相对较低的恶性表型和较好的粘膜高ESCC的TME(图一)。 6A )，这也许可以解释为什么粘膜高企的ESCC患者有更好的预后。
