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DNA测序样品制备指南

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发表时间:2018-08-18 09:52作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

DNA测序样品制备指南


一、PCR产物:

1、未纯化: 确信PCR产物电泳检测条带清晰无杂带,片段长度通常大于200bp,提供浓度大于50ng/ul,总量必须大于2μg。

2、已纯化:电泳检测条带必须单一,纯度OD260/OD280=1.6~2.0。最好溶解在已灭菌的去离子水中,浓度要求>50 ng/μl,提供10μl以上。同时请您提供PCR引物,并注明浓度。

注意事项:

(1)PCR产物的纯度是PCR产物直接测序成功的关键,所以提倡切胶回收PCR产物。如果有几条PCR产物长度相近,用电泳胶也无法分开,此时的PCR产物便无法直接测序。这种情况建议把PCR产物克隆后测序。

(2)PCR产物直接测序成功的另一要因是引物,测序用引物要求较高,引物的3’端必须与模板完全匹配,含有Mix碱基的引物一般不能测序(特别是3’端)。此外,测序引物长度一般为20个碱基左右,GC含量必须在50~60%左右。而且用于测序的引物一定要经过PAGE纯化,纯度必须大于90%。

(3)在PCR扩增时,难以扩增(扩增后的PCR带较弱)的PCR产物在测序时一般成功率较低。

(4)小于150 bp的PCR产物直接测序效果不好,建议克隆后测序。

二、质粒:

如果质粒纯度达到全自动测序的要求,即OD260/OD280=1.6~2.0,可以直接提供质粒。浓度要求>200ng/μl,提供10μl 以上。 无论提供菌液或质粒,请您务必写明:

1、载体的名称和详细图谱

2、插入片段的大小和酶切位点

3、选取的测序引物名称和序列,并且标明测序引物距离插入片段的位置(注:测序引物以后可能会有20~30个碱基不明晰)

4、如果提供特殊测序引物,请写明序列,并且一定要提供经PAGE纯化的引物,浓度大于5pmol/μl

三、菌液:

1、说明载体抗病类型,我们提供常规抗生素为氨卞青霉素、卡那霉素、氯霉素。其余抗生素请自备并告知使用浓度。

2、应为高拷贝质粒,对于低拷贝质粒,请提供约1ug纯化质粒。

3、提供200ul以上过夜培养的新鲜菌液,装于1.5ml离心管中封口保存,防止交叉污染或泄漏。另外请确保菌种的准确性,如因菌种自身问题引起的任何测序结果误差,我们将收取全额的测序费用。

四、以下情况请您直接提供抽提好的DNA模板:

1、噬菌体DNA

2、低拷贝质粒

3、cosmid, BAC DNA

纯化DNA模板时请注意:纯化的DNA模板要求纯度高。纯化以后的DNA模板要溶解于无菌去离子水。浓度要求>200ng/μl,(载体较大的,请提供>500ng/μl),提供10μl以上(一般情况下,经测序部检测合格后才可使用)。


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