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针刺通过免疫和神经元调节抑制骨癌疼痛

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发表时间:2021-07-30 14:14作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

晚期癌症患者常因骨转移和骨质破坏而遭受严重疼痛,目前尚无有效的治疗方法。在此,利用多个小鼠骨癌模型,我们报告了免疫调节剂刺痛(干扰素基因刺激剂)的激动剂对癌症疼痛、骨破坏和局部肿瘤负担有显著的保护作用。反复全身注射针刺激动剂可有效减轻骨癌引起的疼痛,改善运动功能。有趣的是,针刺激动剂通过直接神经元调节产生急性疼痛缓解。此外,刺激动剂通过调节肿瘤微环境中的破骨细胞和免疫细胞功能,防止局部骨破坏,减轻局部肿瘤负担,提供长期的癌症疼痛缓解。最后,这些体内效应依赖于宿主内在的叮咬和IFN-I信号传导.总之,针刺激活提供了独特的优势,在控制骨癌疼痛,通过独特的和协同作用的伤害感受器,免疫细胞,和破骨细胞。

导言

晚期肺癌、乳腺癌、甲状腺癌和膀胱癌患者骨转移后常伴有癌痛,伴有溶骨性病变和严重疼痛。1,2。研究估计,75%的晚期癌症患者有中、重度疼痛。3,4,5,超过一半的转移癌疼痛患者报告说,目前可用的药物治疗方案没有足够的疼痛缓解。6,7。转移癌患者疼痛控制不当往往伴随着抑郁、焦虑、功能受损和生活质量显著下降,导致发病率和死亡率增加。8,9,10...因此,除了开发能够治疗潜在癌症的新疗法的持续挑战之外,还迫切需要开发新的治疗方法,为癌症患者提供姑息治疗,以减轻疼痛和提高生活质量。值得注意的是,内卡那滨已经被证明可以减轻小鼠骨癌疼痛,而不会产生类阿片的副作用。11。一种理想的治疗方法是能够积极地治疗潜在的癌症,同时抑制与癌症相关的疼痛,从而治疗疼痛和潜在的疾病。

干扰素(IFN)基因刺激因子是一种细胞内DNA传感器,通过诱导Ⅰ型干扰素(IFN-I),包括干扰素-α和干扰素-β,在天然免疫中起着重要的作用,促进病原体的清除和对宿主细胞的损伤。通过临床前的研究,小鼠刺刺激动剂dmxaa或异种针刺激动剂adu-s 100已被证实能抑制肿瘤的进展,并以适应性免疫细胞依赖性的方式提高生存期。12,13,14,15,16,17。此外,有几组研究表明,针刺激活微纳米颗粒在促进小鼠原位和基因工程肿瘤模型中的天然免疫和适应性免疫方面也显示出有效的作用。18,19,20。这些研究已经导致了adu-s 100和其他小分子针刺激动剂的探索,并在几个正在进行的临床试验中作为潜在的免疫治疗剂进行了测试。21,22。我们最近的研究表明,针刺激动剂可以有效地控制天真动物和病理性疼痛动物的伤害感觉。23。然而,目前尚不清楚刺刺激动剂是否能有效治疗骨癌,尤其是考虑到骨髓被认为是一种免疫抑制性肿瘤微环境。24.

以往的研究表明,IFN-Ⅰ信号通路抑制破骨细胞的形成,刺激通路的激活促进了小鼠骨自身免疫性疾病模型的骨形成。25,26,27,28。这是值得注意的,因为肿瘤引起的破骨细胞过度活化是导致骨溶解和癌痛的主要机制。29。人们普遍认为,由癌细胞和破骨细胞释放的可溶性介质激活痛觉伤害感受器(伤害感受器)会导致骨癌疼痛。在这些研究的基础上,结合有望成为肿瘤免疫治疗药物的针刺激动剂,我们认为,在骨癌中激活刺刺通路可能是一种独特的协同作用途径,可同时促进抗肿瘤免疫,抑制骨破坏,并提供疼痛控制。

在本研究中,我们验证了这样的假设,即用多个同基因小鼠的骨癌疼痛模型,刺痛激动剂在减轻癌痛方面特别有效。因此,在本研究中,我们证明小分子刺激剂通过对痛觉伤害感受器、适应性免疫细胞和破骨细胞的独特和协同作用,通过一种依赖于IFN-I信号的机制,长期缓解癌症引起的骨痛。

结果

针刺激动剂减轻骨癌所致疼痛及恢复运动功能

我们首先寻求通过全身注射DMXAA来确定刺激是否能在小鼠转移性骨癌模型中提供长期的治疗效果。为此,我们通过接种Lewis肺癌(LLC,2×10)建立了小鼠骨癌疼痛模型。52)细胞进入C57BL/6小鼠股骨。车辆或DMXAA(20 mg/kg)腹腔注射(I.P.)肿瘤植入后第3天(3d)和第7天(第7天)分别注射两次。在接种LLC前(BL)、7d(注药前)、10d和14d对荷瘤腿后肢进行行为试验,包括机械性疼痛的vonFrey试验和冷异体痛的丙酮反应持续时间。肿瘤注射后第14天评估自发性/持续性疼痛的退避和防护行为(图1)。1A)由于在模型的早期时间点很少观察到自发疼痛行为。DMXAA治疗可显著减少d7、d10和d14的机械性痛觉(图1)。1BLLC植入术后D10和d14的冷痛(图1)。1C)。在d14,DMXAA治疗也减轻了自发性和持续性疼痛的措施(图1)。1D)。DMXAA对雄性和雌性小鼠骨癌疼痛的治疗作用均无明显性别差异(附图)。1A-d),这与我们上一次报告是一致的。23。此外,我们观察到车辆和DMXAA治疗组之间的体重没有差异(图一)。1E),表明本实验方案相对安全,无全身胃肠道(GI)毒性。值得注意的是,存活并不是本研究的终点,鉴于该模型后期的动物经历了严重的疼痛和功能损害,所有小鼠在d17接种后都会被处死,以保持合理的健康状况和减少痛苦,就像我们最近的研究一样。30.

图1:针刺激动剂可减轻骨癌引起的疼痛和功能损害。
figure1

a研究DMXAA在骨癌LLC模型中的抗接种效应。bVonfrey试验测定癌症诱发的机械性异基因痛觉,以停药阈值(左)或戒断频率(0.16g刺激;右)作为评价指标,用车辆或DMXAA(20 mg/kg,I.P.)治疗小鼠。n=11只接受车辆治疗的老鼠n=9只DMXAA小鼠)*P < 0.001. c载体或DMXAA治疗小鼠LLC后癌性冷性痛觉的评价(英文)n=11只接受车辆治疗的老鼠n=9只DMXAA小鼠)。dD14荷瘤小鼠畏缩行为(左)和保护行为(右)表现为自发性疼痛的比较(P<0.05)。n=11只接受车辆治疗的老鼠n=8只DMXAA小鼠)。e车辆或DMXAA处理小鼠在指定时间点的体重测量(n=11只接受车辆治疗的老鼠n=9只DMXAA小鼠)。f在接种后d14进行开场试验,以确定车辆或DMXAA处理小鼠在30分钟内的旅行距离(M)和平均速度(cm/s)。n=8只小鼠/组)。左:代表痕迹。右:量化。gVonFrey试验测定了阿杜-S 100(20 mg/kg,I.P.)治疗的小鼠癌症诱发的机械性疼痛。或Za(唑来膦酸;100克/千克,I.P.),n=8只经过车辆治疗的老鼠n=7只Adu-S 100小鼠,和n=8只Za小鼠,*P < 0.001. h荷瘤小鼠接种LLC后第7、10、14天肿瘤致冷性痛觉的测定n=8只经过车辆治疗的老鼠n=7只Adu-S 100小鼠,和n=8只Za处理的小鼠)。i自发疼痛由接种后14天的退缩行为(左)或守卫行为(右)确定,间隔2分钟。n=8只经过车辆治疗的老鼠n=7只Adu-S 100小鼠,和n=8只Za处理的小鼠)。j小鼠体重测定方法(n=8只经过车辆治疗的老鼠n=7只Adu-S 100小鼠,和n=8只Za处理的小鼠)。k在接种肿瘤后第14天,在汽车、Adu-S 100和Za处理的小鼠体内进行开放野外试验,测量运动距离(M)和平均速度(cm/s),持续时间为30 min。n=6只小鼠/组)。左:代表痕迹;右:量化。所有显示的数据均为平均±扫描电镜,重复测量的双向方差与Bonferroni的后特别检验(b, c, e, g, h, j);双尾学生的t-测试(d, f);与Bonferroni‘s的单向变异临时试验(i, k)。源数据作为源数据文件提供。

临床上,晚期癌症患者骨转移的一个重要的共病是活动能力减弱或丧失,导致功能受损和生活质量下降。2,8。为了确定DMXAA刺激是否能改善运动功能,我们在野外试验中对运动活动进行了评估。重要的是,DMXAA治疗小鼠在接种肿瘤后第14天表现出更大的整体移动距离和更快的移动速度(图1)。1F)。因此,DMXAA能明显改善骨癌小鼠的运动功能。

双膦酸盐通过促进骨吸收性破骨细胞的凋亡,广泛用于预防和治疗骨转移癌诱导的骨相关事件。唑来膦酸(Za)是最有效的双膦酸盐之一。31,也被报道具有抗肿瘤作用。32。此外,由于DMXAA对小鼠的特异性,其翻译意义有限,我们还试图验证Adu-S 100是否能发挥类似的治疗作用。在使用车辆后,Adu-S 100(20 mg/kg)或Za(100微克/千克),如先前的研究所示,是一种高度有效的剂量,毒性最小。31,32在d3和d10时,我们发现Za不能降低肿瘤所致的机械性痛觉,但在D10肿瘤植入后可以将戒断频率降低到低阈值刺激(0.16g vonfrey丝)。在D10和d14上,Adu-S 100治疗均能明显减轻机械性痛觉,其效果优于Za(图1)。1g)。在接种肿瘤后14天,Za可减少冷痛,而Adu-S 100可减少D10和d14的冷痛,这种作用在Adu-S 100组显著高于Za组(图14)。)。此外,与车辆处理的小鼠相比,阿杜-S 100而非Za治疗小鼠的自发性和持续性疼痛减少(图1)。1I)。我们发现这些剂量的Adu-S 100和Za对整体体重没有影响(图1)。1J),表明它们相对安全,没有严重的胃肠道毒性。为了再次评估Za和Adu-S 100对功能和移动性的潜在益处,我们在d14、adu-S 100和za分别在d3和d10对小鼠进行了开放实地测试。值得注意的是,与车辆治疗组相比,Adu-S 100治疗组而非Za治疗组小鼠的整体运动距离增加,运动速度加快(图1)。1K)。加在一起,Adu-S 100在减轻癌症引起的疼痛和改善运动功能方面优于Za。

针刺激动剂对癌症所致骨破坏的保护作用

骨癌诱发的疼痛通常伴随着肿瘤性骨破坏的发生而发展.据了解,骨癌疼痛是由癌细胞直接产生的因素引起的,这些因素作用于肿瘤微环境中的传入伤害性神经纤维(TME)。33,34。此外,癌细胞通过加速破骨过程,产生破骨细胞,释放伤害性因子,促进骨吸收,促进骨破坏和骨折,间接促进骨癌疼痛。30,35。因此,骨肿瘤微环境中的癌细胞通过直接和间接机制促进骨痛(附图)。1E)。在体内,已知llc细胞通过肿瘤诱导的破骨细胞形成和活性的激活而导致骨破坏。30,概述人类骨转移性溶骨癌的发病机制。因此,我们试图持续评估X线片对荷瘤小鼠骨破坏的影响,用载体或DMXAA(20 mg/kg,I.P.)治疗荷瘤小鼠。在d3和d7)。骨破坏级别为0~5分,采用荷瘤股骨高分辨率X线片进行评分,如Honore等人所述。36。在这个模型中,我们观察到LLC接种会产生一种逐渐恶化的骨质破坏模式,它定位于股骨远端,而股骨的近端相对不受干扰(图一)。2A)。此外,连接股骨和髌骨的肌腱经常被切断(箭头;图)。2A)。DMXAA处理可降低接种LLC后d8、D11和D15的骨质破坏评分(图1)。2A,b)。DMXAA对骨破坏的保护作用无性别差异(附图)。1F,g)。为了探讨骨的显微结构,我们还利用显微计算机断层扫描(Micro-CT)和三维重建技术对荷瘤股骨远端进行了三维重建分析。在D11肿瘤植入和载体或DMXAA治疗后,如图所示。2A和3D重建显示,与车辆组相比,DMXAA组小鼠骨小梁骨丢失较少,皮质骨损伤较少。2C)。值得注意的是,在接种LLC后的D11,皮质骨的丢失与无瘤小鼠相比最为明显。定量评估的骨微结构参数显示,有较高的小梁骨连接密度(Conn.D)相对于天真和LLC承载,车辆处理的小鼠(图一)。二维空间)。此外,DMXAA拯救了LLC所致的皮质骨丢失(根据皮质骨体积/总体积(BV/TV;图1)评估)。二维空间)。DMXAA对小梁骨其他显微结构参数的保护作用不明显,但我们观察到小梁数量明显增加。2A-d)。接下来,我们分析了阿杜-S 100或Za(d3和d10)治疗后的骨破坏情况,如图所示。1g)。与DMXAA相似,Adu-S 100和Za治疗均能降低肿瘤接种后D11和D15的骨质破坏评分(图1)。2E,f).

图2:针刺激动剂可减轻癌症引起的骨破坏。

a载体或DMXAA治疗小鼠荷瘤股骨的典型X线片。每张图像均显示骨质破坏评分,箭头显示骨性病变,得分在3分以上,箭头显示分离的髌骨。b量化(a) (n=11只接受车辆治疗的老鼠n=9只经DMXAA处理的小鼠),*P < 0.001. c微CT图像显示接种LLC后股骨远端小梁和皮质骨破坏。鳞片,1毫米。d显微CT图像的形态计量学定量分析,分析无瘤小鼠股骨小梁骨(Conn.D;上部)或皮质骨(bv/tv),以及车辆接种或DMXAA治疗小鼠的股骨(LLC)中的骨小梁骨(Conn.D;上部)或皮质骨(bv/tv)。n=5只天真的老鼠,n=5只经药物处理的荷瘤小鼠,及n=7只DMXAA荷瘤小鼠)。e, f荷瘤小鼠接种阿杜-S 100或Za所致骨破坏的X线分析。e有代表性的X光图像。每张照片底部都有骨头破坏分数,箭头表示骨头破坏分数超过3分。f图像量化e (n=8只经过车辆治疗的老鼠n=7只Adu-S 100小鼠,和n=8只Za处理过的小鼠),*P < 0.001. gD17荷瘤小鼠股骨图像及接种LLC后荷瘤小鼠股骨骨折比例的定量研究。箭头表示股骨远端的断开和缺失(n=8只小鼠/组)。h荷瘤股骨的图像,在LLC接种后(左)在D17上进行指示性治疗,并量化与骨折的比例(右)。箭头表示股骨远端的损伤和丢失(n=8只经过车辆治疗的老鼠n=7只Adu-S 100小鼠,和n=8只Za处理的小鼠)。所有数据显示平均±扫描电镜,重复测量与邦费罗尼的双向变异数。临时试验(b, f双尾学生t检验(d();双边Fisher‘s精确检验(g, h)。源数据作为源数据文件提供。

图3:针刺激动剂的保护作用是由宿主IFN-Ⅰ信号介导的.
figure3

a肿瘤植入d3后BL、DMXAA或Adu-S 100治疗后4h、24h血清IFN-α(左)和IFN-β(右)水平分析n=7只经过车辆治疗的老鼠,n=5只DMXAA小鼠,和n=5只Adu-S 100小鼠),*P < 0.001. bDMXAA或Adu-S 100处理小鼠骨髓溶解液中IFN-α(左)和IFN-β(右)水平n=8只经过车辆治疗的老鼠,n=5只DMXAA小鼠,和n=5只Adu-S 100小鼠),*P < 0.001. cVonfrey试验测定戒断阈值(左)和频率(右)伊夫纳1+/+伊夫纳1−/−小鼠用车辆或DMXAA(2x20 mg/kg,I.P.)治疗。d车用或DMXAA治疗的冷异体痛觉分析伊夫纳1+/+老鼠和伊夫纳1−/−老鼠。ef年荷瘤股骨X线片骨破坏评分伊夫纳1+/+伊夫纳1−/−小鼠注射LLC后d0、d8、d11和d15。箭头显示骨头损伤,破坏分数超过3分。e有代表性的X光图像。f定量化e. g车辆或DMXAA治疗后的体重测量。样品尺寸cg情况如下:n=7辆车伊夫纳1+/+老鼠,n=7 DMXAA-经过处理伊夫纳1+/+老鼠,n=6辆车伊夫纳1−/−老鼠,n=6 DMXAA-经过处理伊夫纳1−/−老鼠。所有数据显示平均±扫描电镜,重复测量与邦费罗尼的双向变异数。临时试验(a, c, d, f, g);与Bonferroni‘s的单向变异临时试验(b)。源数据作为源数据文件提供。

肿瘤诱导的溶骨性骨破坏的发展和进展常导致骨骨折,这是骨转移患者SRES的重要组成部分,并与患者的整体生存率降低有关。37。在D17接种LLC后,对小鼠进行安乐死,收集荷瘤小鼠股骨,并对发生骨破坏的荷瘤股骨远端进行分析。值得注意的是,我们发现87.5%(7/8小鼠)的车辆处理的小鼠发生了骨折,而只有12.5%(1/8小鼠)的DMXAA小鼠发生远端骨骨折(图1)。2G)。同样,Adu-S 100治疗组0%(0/7小鼠)和Za组25%(2/8小鼠)出现骨折(图1)。2H表明针刺激动剂和Za均能显著减少骨破坏。

针刺激动剂对乳腺癌骨痛和骨质破坏的保护作用

与肺癌相似,乳腺癌也容易向骨骼转移并导致骨质破坏。8。为了探讨针刺激动剂对乳腺癌骨破坏的潜在保护作用,我们利用E 0771型乳腺癌细胞系建立了雌性C57BL/6小鼠乳腺癌骨痛模型,98%的乳腺癌发生在雌性小鼠身上。38。与LLC类似,用E 0771线建立的肿瘤也会引起骨溶解性病变。39。小鼠股骨内接种后,分别用载体、DMXAA或Adu-S 100对荷瘤小鼠进行行为测试和X线摄片(附图)。3A)。与我们在LLC骨癌疼痛模型中的结果相似,我们发现DMXAA和Adu-S 100治疗能明显减少机械性疼痛、寒冷性疼痛和自发性疼痛(补充图1)。3B-d)但对体重没有影响(补充图。3E)。此外,DMXAA和Adu-S 100也可以减轻E 0771股骨X线图像中的骨质破坏(附图)。3F,g)。因此,刺激动剂可以防止癌症引起的骨疼痛和骨破坏,由多个容易发生骨转移的癌症亚型引起。

DMXAA对骨痛的保护作用及其对骨破坏的影响

为验证DMXAA对小鼠的抗感染和骨合成作用,本实验采用针刺、WT小鼠和针刺“金票子”敲除(刺)的方法。GT/GT)小鼠40将LLC细胞在股骨内接种,然后给予车辆或DMXAA(20 mg/kg)(I.P.)。在d3和d7后LLC注射。值得注意的是GT/GT在VonFrey试验中,小鼠的后足戒断阈值明显降低,戒断频率明显高于WT小鼠。DMXAA治疗能明显减轻WT小鼠机械性和冷性痛觉,但这种作用在针刺中被取消。GT/GT小鼠(附图)4A,b)。我们还通过对荷瘤小鼠股骨远端骨破坏的X线检查来测量癌症引起的骨破坏。我们观察到在d11和d15肿瘤接种后,dxaa处理的WT小鼠骨破坏评分下降,这种作用在针刺中被消除。GT/GT小鼠(附图)4C,d)。我们没有看到体重变化后的实验操作(补充图)。4E)。因此,正如预期的那样,DMXAA对癌症引起的疼痛和骨破坏的保护作用是由刺痛介导的。

IFN-Ⅰ信号转导介导针刺激动剂对骨癌的保护作用

圈套激活导致干扰素应答基因的转录诱导和Ⅰ型干扰素(包括IFN-α和IFN-β)的大量产生和释放。为了证实系统给药刺激剂在肿瘤微环境中引起系统和局部的IFN-I反应增加,我们用ELISA法分析了IFN-α和IFN-β的水平。结果发现,单次腹腔注射后4h,血清IFN-α水平提高了1 0 0 0~1 0 0 0倍.肿瘤接种后d3注射DMXAA(20 mg/kg)或Adu-S 100(20 mg/kg),持续24 h,同时,DMXAA和Adu-S 100给药后4h血清IFN-β水平也显著升高(见图)。3A)。在LLC植入后第3天,取荷瘤股骨骨髓(BM),分别于术后4h、DMXAA或Adu-S100 I.治疗后用ELISA法进行分析。DMXAA或Adu-S 100处理的小鼠骨髓裂解液中IFN-α和IFN-β均显著升高(图1)。3B)。因此,全身给药促进了系统和骨癌肿瘤微环境中的IFN-I反应。

干扰素-α/β受体(IFN-receptor,IFNAR)是一种异二聚体信号转导受体复合物,由IFFAL 1和IFFAR 2组成,两者都是IFN-I信号传递所必需的。为了测试IFN-I信号如何在骨癌模型中发挥针刺激动剂的保护作用,我们再次将llc细胞导入了小鼠股骨。伊夫纳1+/+(WT)或伊夫纳1−/−(KO)小鼠在缺乏IFN-I信号的情况下建立骨癌模型.就像老鼠身上没有刺一样,我们发现伊夫纳1−/−与WT小白鼠相比,小鼠在基线时表现出机械性超敏反应(图1)。3C)。经车辆或DMXAA(20 mg/kg,I.P.)治疗后。在d3和d7),我们发现DMXAA治疗能有效地减轻wt小鼠因癌症引起的机械性痛觉和冷性痛觉。伊夫纳1−/−老鼠(图1.3C,d)。在接种肿瘤后的D11和D15上,DMXAA治疗也显著降低了WT小鼠的骨破坏评分而不改变体重,但这种作用在小鼠体内被完全消除。伊夫纳1−/−老鼠(图1.3E-g)。因此,诱刺激动剂对骨癌引起的癌痛和骨质破坏的保护作用需要通过IFF-I信号通路。

DMXAA抑制骨癌致DRG伤害性神经元的高兴奋性

鉴于在我们的模型中,癌症引起的骨痛是由背根神经节(DRG)的外周伤害感受器传递的,我们下一步将探讨外周感觉神经元中的刺信号是否参与了针刺激动剂在骨癌疼痛中的抗伤害作用。鉴于我们先前的报告,我们证明了刺激动剂可以直接抑制化疗诱导的周围神经病变(Cipn)慢性疼痛模型中的伤害感受器过度兴奋。23为验证这一假说,我们将荷瘤小鼠接种LLC细胞建立骨癌模型,在D11上分离L3-L5 DRGS,与Vehicle或DMXAA(30M)体外孵育2h,用膜片钳记录测定伤害性兴奋性(Fig)。4A)。重要的是,在这一范式中,来自荷瘤小鼠的DRG相对于天真小鼠的DRG保持其超兴奋状态,使我们能够测试DMXAA介导的DRGS中的针刺激活是否能直接降低伤害感受器的兴奋性。与车辆相比,DMXAA孵育DRGS明显增加了伤害感受器的流变酶,这是唤起动作电位所需电流的量度(图一)。4B,c)。此外,通过对电流诱发动作电位的检测,我们发现,当载体处理的荷瘤小鼠相对于无瘤小鼠表现出伤害性高兴奋性时,DMXAA可以完全逆转这种癌症诱导的伤害性感受器高兴奋性(图1)。4D-E)。虽然我们的样本规模相对较小,鉴于这种体外电生理记录方法的复杂性,特别大的影响程度使我们能够看到统计意义重大的结果。综上所述,这些数据表明,用DMXAA刺激可抑制癌症引起的DRG伤害感受器的超兴奋性。鉴于该制剂中的DRGS是被切断的,从而使它们与可能导致兴奋性变化的外周或中央细胞类型分离,我们得出结论,DRG内存在的细胞足以介导这些效应。

图4:体内外刺激活抑制荷瘤小鼠DRG神经元高兴奋性.
figure4

a全贴装DRG制备原理图、药物治疗原理图和用一个小直径神经元(伤害感受器)上密封的记录微移液管的亮场图像。b有代表性的流变酶的痕迹:电流钳记录小直径DRG神经元的膜电位,无论是否含有DMXAA(30 M,2 h)。动作电位诱导电流注入从0 Pa开始,每步增加10 Pa,持续30 ms。c单纯小鼠、车辆或DMXAA治疗组的流变酶平均值(天真:n=8个神经元/4只小鼠;载体:n=9个神经元/4只小鼠;DMXAA:n=10个神经元/4只小鼠)。d左:注入电流步骤诱导动作电位从0 Pa开始,每步增加10 Pa,持续300 ms。右图:有代表性的追踪显示,在接受DMXAA治疗或不使用DMXAA治疗的小鼠小直径DRG神经元的110 Pa电流注入(红色线在左)的反应。e作为动作电位对天真小鼠或骨癌小鼠加或不加DMXAA的电流幅度增加的反应(天真:n=8个神经元/4只小鼠;载体:n=9个神经元/4只小鼠;DMXAA:n=10个神经元/4只小鼠),*P < 0.001. All data indicate the mean ± SEM, one-way ANOVA with Bonferroni’s 临时员额试验(c);用Bonferroni‘s进行单因素方差分析临时试验(e)。源数据作为源数据文件提供。

重复使用针刺激动剂可以通过减少肿瘤负担、减少骨破坏、通过直接抑制伤害感受器活动的神经元机制或上述三种机制的结合来抑制癌症引起的骨痛。我们的电生理数据表明,刺刺激动剂可以通过直接的神经机制抑制骨癌引起的疼痛,这种机制与肿瘤生长或骨破坏无关。为验证急性给药针刺激动剂是否能抑制骨癌所致疼痛,我们在单次注射后4h在小鼠体内进行了D11小鼠行为测试。注入车辆,DMXAA,或Adu-S 100。值得注意的是,两种针刺激动剂都能显著减少机械性痛觉、寒冷性痛觉和自发性疼痛(如图所示)。5A-C和补充图。5A,b)。由于刺痛的天然激活因子是胞内双链dna(Dsdna),通过cgas依赖的途径,以及cgas不依赖于细菌来源的循环二核苷酸(如3‘3’cgAMP)的途径。41我们还评估了dsDNA和3‘3’-cGAMP能否在骨癌模型中产生抗接种作用。有趣的是I.P。D11 LLC植入术后4h,给予dsDNA(30g,与LyoVec络合,以促进细胞穿透)或cGAMP(20 mg/kg)可减轻冷异体痛或/及机械性痛觉(附图)。5C-f)。鉴于骨癌疼痛经常用吗啡等类阿片治疗,我们测试了DMXAA相对于吗啡(10 mg/kg)的镇痛效力。值得注意的是,吗啡和DMXAA在给药后1h都能迅速减轻机械和寒冷的痛觉,但其作用持续时间要长得多(见图)。5B,c)。此外,我们还通过注射DMXAA(20 mg/kg,I.P.),测试了DMXAA的急性抗接种作用是否具有刺痛和Ifnar1的依赖性。进入WT,刺GT/GT老鼠和伊夫纳1−/−小鼠注射后4h测定机械性和冷性痛觉。我们发现DMXAA能减轻WT小鼠的机械性痛觉和冷性痛觉,但对刺痛无明显影响。GT/GT老鼠或伊夫纳1−/−老鼠(图1.5D,e)。为了进一步确定神经型IFN-i信号通路是否参与了针刺激动剂的急性镇痛作用,我们用缺乏的小鼠建立了骨癌疼痛模型。伊夫纳1选择性感觉神经元FX/FXv1.8CRE;Ifnar1-CKO),或它们的野性小白蚁。重要的是,我们发现了单次注射DMXAA(20 mg/kg,I.P.)所产生的抗接种作用。均存在于WT,但未见Ifnar1-CKO小白蚁(图1)。5F-g)。鉴于这些效应的即时性,并结合我们的电生理数据,我们得出结论:针刺激动剂通过在依弗纳1依赖机制中直接作用于伤害感受器而发挥抗接种作用。

图5:针刺激动剂的直接抗伤害作用与感觉神经元的针刺和Ifnar1有关。
figure5

aVonfrey试验测定癌症所致的机械性异基因痛觉,用停药率来评估。n=12只小鼠),DMXAA(20 mg/kg,I.P.,n=6只小鼠)或Adu-S 100(20毫克/千克),n=6只老鼠),*P < 0.001. Measurement of mechanical allodynia as indicated by paw withdrawal frequency (b)或寒冷的痛觉(c单次注射后1h、4h或24h。车辆注射(n=8只小鼠),DMXAA(20 mg/kg,n=9只小鼠),或吗啡(10毫克/千克,n=8只小鼠,接种LLC后在D11上,*P < 0.001. d-e冯·弗雷法测量机械性痛觉(d)和由丙酮引起的冷痛觉反应(e)DMXAA后。注射在WT,刺GT/GT伊夫纳1−/−老鼠(n=7只小鼠/组)。冯·弗雷法测量机械性痛觉(f)和冷痛经丙酮反应持续时间(g)在车辆/DMXAA I.P.之后。注射法FX/FXv1.8CRE(Ifnar1-CKO)小鼠(n=6只小鼠用于车辆组和n=9只小鼠(DMXAA组)或FX/FX(WT)小鼠(n=5只小鼠用于车辆组和n=7只小鼠(DMXAA组),#P=0.0027(伊夫纳1FX/FX+车辆大战伊夫纳1FX/FX;Nav1.8-CRE+车辆);P=0.0011(伊夫纳1FX/FX+车辆大战伊夫纳1FX/FX;NAV1.8CRE+DMXAA);P=0.0020(伊夫纳1FX/FX+DMXAA;伊夫纳1FX/FX;Nav1.8-CRE+车辆);P=0.0006(伊夫纳1FX/FX+DMXAA;伊夫纳1FX/FX;Nav1.8-CRE+DMXAA);*P < 0.001. hi用vonFrey法测定DMXAA和Adu-S 100治疗后的机械性痛觉(分别为d3和d7,I.P.)刺痛FX/FXv1.8-CRE(刺-CKO)小鼠或针刺FX/FX(WT)小鼠。h实验设计原理图。i爪子退出频率。n=6只小鼠用于叮咬FX/FXv1.8-CRE(车辆)组和n=其余各组的7只小鼠,*P < 0.001. Notably, DMXAA and ADU-S100 attenuated mechanical allodynia at later time points (d10, d14) in STING-cKO mice. All data indicate the mean ± SEM, repeated-measures two-way ANOVA with Bonferroni’s 临时试验(ai)。源数据作为源数据文件提供。

为了正式测试针刺信号在外周感觉神经元中的作用,我们利用缺乏针刺的小鼠在感觉神经元中选择性地进行了针刺FX/FXv1.8-CRE;SING-CKO)或它们的野性小白蚁。类似刺痛GT/GT小鼠,叮-CKO小鼠在基线时表现出机械性超敏反应,这是我们以前报道过的。23。股内注射LLC细胞后,在d3和d7处分别给SING-WT和Sting-CKO小鼠注射DMXAA或Adu-S 100。值得注意的是,行为测试是在DMXAA给药前第7天和给药后4小时进行的,使我们能够评估针刺激动剂的急性作用(图一)。5H)。值得注意的是,DMXAA和Adu-S 100均在给药后4h明显减轻了小鼠的机械性痛觉,但这种作用在Sting-CKO小鼠中被消除,提示急性抗接种效应依赖于外周感觉神经元的Sting信号。然而,有趣的是,在稍后的时间点(D10,d14)机械性痛觉的减少被观察到在刺-WT和刺-CKO小鼠(图1)。5I)。这些数据表明,针刺激动剂的长期保护作用取决于它们的抗肿瘤免疫特性。

针刺激动剂抑制局部骨癌、肿瘤负担及进一步转移

在一些临床前动物研究中,肿瘤内注射针刺激动剂通过促进T细胞介导的抗肿瘤免疫来抑制肿瘤生长。12,17,20,42。然而,目前尚不清楚的是,全身注射针刺激动剂是否能减缓骨髓中肿瘤的进展,这通常被认为是一种免疫抑制性肿瘤微环境。24。为了回答这个问题,用荧光素酶标记的LLC细胞(LL/2-Luc2细胞)通过股内接种建立了骨转移瘤模型,从而可以通过体内生物发光成像测量局部肿瘤负荷。小鼠给予车辆或DMXAA(20 mg/kg,I.P.)。在d3和d7),然后在d8、d11和d15进行体内生物发光成像。值得注意的是,以荷瘤小鼠LL/2-Luc2细胞的总通量来衡量,DMXAA处理的小鼠在D11和D15时表现出较低的局部肿瘤负担(图一)。6A)。到D17时,可以目视观察到股骨远端正常解剖边界以外的肿瘤生长情况,从而使荷瘤(同侧)大腿的周长比对侧增加。为了对此进行量化,我们测量了最大大腿围(同侧/对侧)的比值,该比值准确地反映了局部肿瘤的体积。43...值得注意的是,在LLC和E 0771诱导的骨癌模型中,DMXAA和Adu-S 100治疗,而不是Za治疗,都能降低D17的最大大腿围比(图1)。6B,c)。为了测试这些效应是否依赖于宿主内部的刺痛和ffnarl,我们用d17大腿围测量了局部肿瘤负担。GT/GT伊夫纳1−/−老鼠发现这种保护作用在既没有刺又没有刺的老鼠身上被消除了。伊夫纳1(补充图。6A-c)。因此,全身给药的针刺激动剂减少了局部骨癌的负担,以一种针刺和Ifnar1依赖的方式。然而,DMXAA和Adu-S 100的抗肿瘤作用仍然存在于叮咬-CKO小鼠身上,并在伤害感受器中被敲除(补充图1)。S6d)。这一结果表明,针刺激动剂的长期保护作用取决于它们的抗肿瘤免疫功能。

图6:全身针刺激动剂可减轻骨肿瘤微环境中局部肿瘤的负担。

a载体或DMXAA(2×20 mg/kg,I.P.)对荷瘤股骨中LL/2-Luc2癌(LLC)细胞放射通量的体内生物发光效应(2×20 mg/kg,I.P.)肿瘤接种后d8、d11和d15测量值(n=10只经过车辆治疗的老鼠,n=11只DMXAA小鼠)。术后15 min摄片(左)。D-荧光素素注射液(30 mg/kg)。右,实验方案和量化a. b反映小鼠局部肿瘤负荷的最大大腿周长比值,分别在LLC植入术后的D17上进行治疗。左、车或DMXAA(2×20 mg/kg,I.P.);n=11只接受车辆治疗的老鼠n=9只DMXAA小鼠)。右,车辆,Adu-S 100(2×20 mg/kg,I.P.)或Za(唑来膦酸;2×100 g/kg,I.P.)治疗(n=8只经过车辆治疗的老鼠n=7只Adu-S 100小鼠,和n=8只Za处理过的小鼠),*P < 0.001. c用车辆、DMXAA或Adu-S 100(2×100μg/kg,I.P.)给药小鼠的最大大腿围比值。E 0771乳腺癌细胞植入后的D17n=7只小鼠/组),*P < 0.001. d小鼠肺肿瘤结节的图像,显示接种LLC后D17的治疗效果。左,有代表性的背侧和腹侧鼠肺图像,箭头显示转移性肿瘤结节。左肺切片右侧H&E染色。箭头表示有肿瘤细胞的区域,标尺,2毫米。1和2分别显示肿瘤组织和瘤周区域。标度棒,50m.注意肿瘤细胞有大而不规则的细胞核,缺失正常的肺泡结构。eD小组的量化(n=8只经过车辆治疗的老鼠,n=7只Adu-S 100小鼠,和n=8只Za处理的小鼠)。f-gCD4的流式细胞术分析+和CD8+T细胞(f)或Treg细胞(g)在小鼠骨髓肿瘤微环境中,用载体或DMXAA(2×20 mg/kg,I.P.)D8后LLC接种(n=5只小鼠/组)。此图的浇口策略在补充图7中提供。h局部肿瘤负担由车辆或DMXAA治疗后最大大腿围之比决定。n=10只小鼠用于车辆或DMXAA组)和Rag1−/−老鼠(n=LLC植入后D17上的13只小鼠(车辆或DMXAA组),*P < 0.001. i局部肿瘤负荷由最大大腿围之比决定Batf 3+/+Batf 3−/−LLC植入术后D17对小鼠的指示治疗作用(n=8只小鼠/组),*P < 0.001. Data indicate the mean ± SEM, repeated-measures two-way ANOVA with Bonferroni’s 临时员额试验(a, b, c, h, i);与Bonferroni‘s的单向变异临时员额试验(e);双尾学生的t-测试(f, g)。源数据作为源数据文件提供。

LLC是一种小鼠肺腺癌细胞系,与原注射部位向肺叶转移具有亲和力,形成可见的肿瘤结节。44,在我们的模型中,可以利用这种现象作为一种转移的衡量标准。测试阿杜-S 100(20 mg/kg I.P.)的全身给药情况。或Za(100克/千克国际P.)在d3和d7时,我们分析了股内LLC接种D17时,载体、Adu-S 100-或Za处理小鼠的肺转移能力。我们发现接受Adu-S 100治疗的小鼠比使用载体或Za治疗的小鼠表现出较少的肺肿瘤结节(如图所示)。6d-e)。因此,用Adu-S 100系统刺激肿瘤,既能抑制局部肿瘤负担,又能抑制肿瘤的进一步转移。

机械地说,针刺通路激活的抗肿瘤作用主要归因于抗原提呈细胞(APC)介导的CD8活化。+T细胞45。检测系统性针刺激活是否能促进CD8。+在我们的骨癌模型中,T细胞浸润到骨髓免疫抑制性肿瘤微环境中,用DMXAA(20 mg/kg)灌胃给药。第3、7天,第2次注射DMXAA后24h,取荷瘤股骨骨髓,用流式细胞术(附图中提供的门控策略)分析肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)。S7)。重要的是,我们发现DMXAA治疗显著增加了(CD11b)的比例。CD3+)CD8+T细胞不明显改变(CD11b)的比例CD3+)CD4+骨髓肿瘤微环境中的T细胞。6f)。我们进一步分析了免疫抑制的比例(CD3)。+CD4+)Foxp 3+,IL-17调节性T(Treg)细胞和发现DMXAA治疗降低了Treg细胞在骨髓中的比例(图)。6g)。为了验证针刺激动剂是否是由于T细胞介导的抗肿瘤免疫而引起的肿瘤负担减少,我们将LLC细胞引入WT或Wt的股内腔。Rag1−/−缺乏成熟B细胞和T细胞的小鼠,其次为载体或DMXAA(20 mg/kg腹腔注射)。在d3和d7接种后),并在d17测量最大大腿周长,如图所示。6B。我们发现DMXAA只在WT小鼠中有效地降低了最大大腿周长的比值,但在wt小鼠中却没有降低。Rag1−/−老鼠(图1.六小时).

其次,鉴于传统的1型树突状细胞(Cdc 1)已被证明对交叉启动适应性T细胞对肿瘤的反应至关重要,我们还利用了cdc 1缺陷。Batf 3−/−小鼠的急性和/或长期保护作用将取决于适应性抗肿瘤免疫。如预期,在股部接种Batf 3+/+Batf 3−/−荷瘤小鼠LLC细胞Batf 3+/+老鼠但不是Batf 3−/−DMXAA治疗后,小鼠在D17时局部肿瘤负荷减少(图1)。6I)。因此,我们得出结论,系统激活宿主固有的刺刺介导的IFN-I信号通过促进TIL进入正常免疫抑制的骨髓TME而促进抗肿瘤免疫。

为进一步观察针刺激动剂对骨癌疼痛的保护作用,我们采用尾动脉注射LLC细胞(100μ1,200,000)建立了更多的骨转移生理模型(附图)。8A),最近有报道说,它能将癌细胞输送到后肢和尾椎,具有很高的疗效,并导致骨质破坏。46。我们发现DMXAA重复治疗在第3,7,11天(补充图)。8B)也足以减轻局限于尾椎的骨质破坏,降低LLC注射后D21椎体骨折的比率(补充图)。8C,d)。这说明刺痛激动剂能保护癌症所致的骨破坏。在一种典型的肿瘤转移模型&尾动脉LLC注射模型中,我们还发现DMXAA可以减少肺癌模块的数量(附图)。8E)。此外,我们还发现,接种肿瘤后在D11处使用DMXAA可有效地抑制骨癌所致的机械性同种异体痛(补充图)。8f)。

针刺激动剂通过IFN-Ⅰ信号通路抑制肿瘤诱导的破骨细胞分化

干扰素-α和干扰素-β曾被报道抑制小鼠和人破骨前细胞向破骨细胞的分化。26。鉴于我们的数据表明,针刺激动剂可以减少骨破坏,我们试图确定骨保护作用是否是由直接影响破骨作用。为此,我们在接种载体或DMXAA(20 mg/kg I.P.)后,测定了荷瘤股骨远端D11处破骨细胞的数量。在d3和d7)。值得注意的是,DMXAA处理的小鼠表现出的破骨细胞要少得多(如图所示)。7A),但在成骨细胞中没有观察到变化(如图所示)。7b)。为了进一步评价破骨细胞和成骨细胞的活性,我们收集了荷瘤小鼠在llc接种后的bl和d17血清,并分别测定了血清ctx-i和pinp的水平,它们分别是骨吸收和骨形成的标志。30,47。DMXAA能有效降低D17的CTX-I水平,但对血清PINP水平无明显影响。7C)。这些数据表明,DMXAA能抑制骨肿瘤驱动的破骨细胞的形成及其骨分解活性。

图7:针刺激动剂可减轻癌症所致的破骨作用。

aTRAP染色的代表图像(左)和定量(右)显示荷瘤小鼠股骨远端的破骨细胞数量(2×20 mg/kg,I.P.)。LLC接种后在D11上的测定(n=3只小鼠为天真组和n=5只小鼠为车辆或DMXAA组)。标尺,500米。bALP染色图像(左)和定量(右)显示D11荷瘤小鼠股骨远端成骨细胞。n=3只小鼠为天真组和n=5只小鼠为车辆或DMXAA组)。标尺,500微米。c用ELISA法测定车辆和DMXAA(2×20 mg/kg,I.P.)中BL或D17血清CTX-I和PINP水平。治疗小鼠(n=8只经过车辆治疗的老鼠n=7只DMXAA小鼠)。dTRAP染色显示RAW264.7细胞经35 ng/ml RANKL刺激后,在DMXAA浓度增加的情况下,破骨细胞数增加。箭头表示陷阱+多核破骨细胞。左边,有代表性的陷阱染色图像。对,量化(n=3个独立于生物的实验副本),*P < 0.001. Scale bar, 200 µm. eDMXAA(30 M)或Adu-S 100(30 M)共孵育24h后,ELISA定量检测BMDM细胞培养液中IFN-α和IFN-β水平。RANKL:35 ng/ml,MCSF:20 ng/ml(n=3个独立于生物的实验复制)。f, g小鼠BMDM细胞分化破骨细胞TRAP染色GT/GT老鼠或伊夫纳1−/−小鼠,每只用车辆,DMXAA(30 M)或Adu-S 100(30 M)。RANKL:35 ng/ml,MCSF:20 ng/ml。fTRAP染色的代表性图像。箭头表示陷阱+多核破骨细胞。标尺,100米。g量化(f), ***P < 0.001. Sample sizes for f-g参考从单个小鼠身上提取的独立培养物,其内容如下:WT/Vehicle:n=6,WT/DMXAA:n=6,WT/Vehicle:n=6,刺痛GT/GT/车辆:n=3,刺痛GT/GT/DMXAA:n=3,刺痛GT/GT/Adu-S-100:n=3,伊夫纳1−/−/车辆:n=3,伊夫纳1−/−/DMXAA:n=3,伊夫纳1−/−/Adu-S-100:n=3.数据显示平均±扫描电镜,与Bonferroni‘s的单向方差。临时员额试验(a, b, d, e, g);重复测量与邦菲罗尼的双向方差。临时试验(c)。源数据作为源数据文件提供。

鉴于全身针刺激动剂在体内减少破骨细胞数量,我们试图确定针刺通路激活是否能促进破骨细胞体外分化。用RANKL(35 ng/ml,连续6天)处理小鼠巨噬细胞原264.7细胞,促进破骨细胞分化。30在车辆存在或DMXAA或Adu-S 100剂量不断上升的情况下。重要的是,我们发现DMXAA和Adu-S 100都有剂量依赖性地抑制破骨细胞的分化。7D,补充图。9a,b)。来自WT,刺的骨髓细胞GT/GT,或伊夫纳1−/−以20 ng/mlM-CSF诱导小鼠分化为巨噬细胞,共3d.用20 ng/ml M-CSF和35 ng/ml RANKL进一步诱导骨髓巨噬细胞(Bmdm)分化为破骨细胞7天。30。用DMXAA或Adu-S 100孵育24h后收集BMDM培养基,发现两种激动剂均能显著提高培养基中IFN-α和IFN-β的水平,但IFN-β的诱导量要大得多(如图1所示)。7E)。TRAP染色表明,DMXAA或Adu-S 100处理(各30μm)均能显著抑制WT小鼠BMDM破骨细胞的形成,但无明显的刺痛作用。GT/GT伊夫纳1−/−老鼠(图1.7F,g)。为了进一步证实这些作用依赖于干扰素-α/β信号,将抗IFN-α(600 ng/ml)或抗IFN-β(600 ng/ml)的中和抗体加入到BMDM的诱导培养基中,并对破骨细胞的形成进行分析。我们发现抗IFN-β抗体可以阻断DMXAA或Adu-S 100对破骨细胞形成的抑制作用。9C-f)。综上所述,这些数据表明,激活针刺/IFN-I信号轴可以抑制破骨作用。

我们的发现表明,针刺激动剂产生抗接种感,减少肿瘤负担,减少骨破坏和破骨发生。可以认为,抗接种作用和骨保护作用都是T细胞介导的抗肿瘤免疫的次要作用。为了检验这种可能性,我们再次将LLC细胞引入WT或Rag1−/−小鼠,其次为车辆或DMXAA(20 mg/kg I.P.)接种后第3天和第7天。值得注意的是,在WT和Rag1−/−小鼠在早期阶段(d7和d10),但不在后期阶段(d14;图1)。8a,b)。同样,DMXAA治疗使WT和WT的骨破坏评分提高。Rag1−/−小鼠在D11,但不是在D15和D17,因为骨折(图)。8C-e)。因此,这些数据表明DMXAA在早期可抑制T细胞无关机制中的疼痛和骨破坏,因此,这些作用可能是由于直接抑制伤害感受器兴奋性和破骨作用所致。随着晚期局部肿瘤负担的增加,T细胞介导的抗肿瘤免疫可能成为控制疼痛和骨破坏的关键。为了进一步验证这些发现,我们使用了Batf 3+/+Batf 3−/−建立小鼠骨癌疼痛模型。DMXAA(20 mg/kg灌胃给药,d3和d7)可减轻大鼠机械性痛觉或冷性痛觉。Batf 3−/−小鼠接种肿瘤后第7天和第10天,而不是第14天(附图)。10a,b)。DMXAA也减少了d8和d11的骨质破坏,但没有减少d15的破坏。Batf 3−/−小鼠(附图)10C,d)。这些数据提供了一系列额外的证据,表明DMXAA在早期阶段抑制了T细胞无关机制中的疼痛和骨破坏。

图8:针刺激动剂对T细胞缺乏的镇痛和骨保护作用。Rag1−/−老鼠。

aVonFrey试验在WT或Rag1−/−小鼠用车辆或DMXAA(2×20 mg/kg,I.P.)在基线(BL),肿瘤接种后第7,10,14天。左边,戒断阈值。右,撤离频率,*P < 0.001. b丙酮试验引起的冷痛觉在WT或Rag1−/−接受指示疗法的小鼠,*P < 0.001. c, d骨破坏的X线分析Rag1−/−小鼠接种LLC后,分别在BL、d8、D11和D15接种后分别给药或DMXAA。c有代表性的X光图像。每张照片的底部都标有骨质破坏分数,箭头表示骨头破坏分数超过3分。d量化(c). e定量测定小鼠远端骨骨折的比例,分别于接种后的D17、所指示的基因型和治疗组进行分析。样品尺寸ae情况如下:n=10只经车辆处理的WT小鼠,n=10只DMXAA处理的WT小鼠,n=13辆车Rag1−/−老鼠,和n=13 DMXAA-经过处理Rag1−/−老鼠(来自两个独立实验)。数据为平均±扫描电镜,重复测量与Bonferroni‘s的双向方差。临时员额试验(a, b, d();双边Fisher‘s精确检验(e)。源数据作为源数据文件提供。

针刺激动剂对无瘤小鼠骨折性骨痛的抑制作用

最后,我们采用骨骨折模型,即无瘤骨痛模型,研究了针刺激动剂与其抗肿瘤特性无关的保护作用。该模型是通过控制旋转的棒插入到小鼠股骨的股骨腔(图)。9A)。鉴于该模型在损伤后几乎立即产生剧烈疼痛,小鼠接受了车辆、DMXAA或Adu-S1003D(20 mg/kg I.P.)的治疗。骨折后,进行行为测试,测量机械性和寒冷性痛觉(如图所示)。9B)。有趣的是,我们观察到DMXAA和Adu-S 100都能有效地抑制机械性和冷性痛觉长达24小时(图1)。9C,d)。为了评价在该模型中重复给针刺激动剂是否能促进疼痛的缓解和功能的恢复,给小鼠注射药物DMXAA或Adu-S 100(20 mg/kg I.P.)。在骨折后d3,d7,d10,d14和d42测量机械性痛觉和运动功能(图14和d42)。9E)。值得注意的是,我们发现DMXAA和Adu-S 100在伤后d14和d42各有一定的保护作用(图1)。9F)和由rotarod试验评估的强劲改善的运动功能(图1.9g)。因此,在不依赖于癌症的骨痛模型中,急性给药能瞬时减轻疼痛,而重复使用针刺激动剂则能促进骨折后疼痛的缓解和功能恢复。

图9:针刺激动剂可减轻无瘤小鼠骨折所致的骨痛。

a骨折致骨痛小鼠模型的建立。b表明单一处理车辆,DMXAA或Adu-S 100和行为测试的实验图表。c, d冯·弗雷试验的机械性痛觉(c)和来自丙酮试验的冷痛觉(d)用车辆、DMXAA或Adu-S 100(20 mg/kg I.P.)治疗小鼠。骨折后第3天*P < 0.001. e重复使用车辆、DMXAA或Adu-S 100的实验图和用于测量长期效应的行为测试。f用停药阈值(左)或停药频率(右)测定小鼠机械性痛觉的冯·弗雷试验(3×20 mg/kg,I.P.)。骨折后d14和d42,*P < 0.001. g车辆、DMXAA或Adu-S 100(3×20 mg/kg,I.P.)对小鼠运动功能的影响伤后d14和d42。样品尺寸c, d, f,和g情况如下:n=6只经过车辆治疗的老鼠,n=7只DMXAA小鼠,n=7只Adu-S 100小鼠。数据为平均±扫描电镜,重复测量与Bonferroni‘s的双向方差。临时员额试验(c, d, f, g)。源数据作为源数据文件提供。

总之,我们提出了一种机制,通过这种机制可以诱导I型干扰素的大量产生,从而直接抑制伤害性感受器的兴奋性和破骨作用,同时促进T细胞介导的抗肿瘤免疫。因此,我们假设刺激动剂可以通过直接作用来剧烈地抑制癌症疼痛,同时通过抑制破骨细胞介导的骨破坏和减轻局部肿瘤负担来长期缓解骨癌引起的疼痛(图一)。10).

图10:刺痛激动剂直接和间接减轻骨癌所致疼痛的机制原理图。

a在未经治疗的骨转移癌中,导致癌痛的病理生理学是多方面的。骨髓肿瘤微环境(TME)中存在的转移性癌细胞产生促破骨信号,驱动肿瘤诱导的破骨发生和破骨细胞过度活化。癌细胞和破骨细胞都产生伤害性介质,直接激活TME中存在的外周伤害性传入,通过直接机制产生疼痛。此外,癌症引起的破骨细胞过度激活也会导致骨吸收增加,导致骨质破坏和骨折增加,这也会通过伤害感受器的激活产生疼痛。b针刺激动剂通过多种机制显著减轻转移性骨癌相关疼痛,每一种机制都是由宿主固有的Ⅰ型干扰素信号介导的。首先,针刺介导的IFN-I信号直接抑制外周伤害感受器(神经调节)的兴奋性,导致在IFN-I反应持续期间的急性疼痛抑制。此外,针刺介导的IFN-i信号转导促进CD8。+T细胞向骨髓TME迁移,增强抗肿瘤免疫,减轻肿瘤负担。此外,IFN-Ⅰ还能抑制癌症诱导的破骨作用.这两种非神经元的免疫调节作用通过(1)减少癌细胞和破骨细胞衍生的前伤害感受介质和(2)减少破骨细胞介导的骨吸收,从而减少随后的骨质破坏和经常引起疼痛和骨骼相关事件的骨骨折(SRE),导致疼痛的持续抑制。因此,针刺激动剂的免疫调节和神经调节作用分别通过不同细胞类型的作用来抑制疼痛,并通过共同下游作用的汇合协同抑制癌症疼痛。触骨前破骨细胞,TILs肿瘤浸润淋巴细胞。

讨论

我们的发现阐明了针刺激动剂作为治疗转移性骨癌疼痛及其并发症的治疗策略的独特和协同优势,包括肿瘤引起的骨破坏和功能损害(如不动)。据我们所知,没有其他已建立或潜在的免疫治疗药物已被证明具有组合抗肿瘤,抗接种性,和骨抗分解代谢的特性。值得注意的是,虽然我们证明了针刺介导的IFN-I信号通过直接抑制伤害感受器兴奋性(神经调节)而对疼痛产生直接作用,但在体内的镇痛作用可能与肿瘤负担和骨破坏的联合抑制(免疫调节)和对伤害性感觉神经元的直接作用有关。在我们的骨肿瘤股内接种模型中,肿瘤细胞直接导入股内间隙(如骨髓),随着肿瘤细胞的骨吸收增加,开始侵入骨腔外组织,常导致股骨远端骨折和连接股骨和髌骨的肌腱断裂,导致骨皮质骨破坏的累进模式。鉴于我们的数据表明,SING/IFN-I信号轴直接抑制破骨细胞分化,刺痛激动剂可能对直接作用(如抑制破骨发生)和间接效应(例如减少肿瘤负担)引起的骨破坏具有特别的保护作用。这些相互关联和协同作用的针刺激动剂(概述见图)。10)对于转移性骨癌的治疗似乎具有特别的优势,由于系统性疾病的持续存在,以及与癌症相关的sr和严重疼痛本身都会增加癌症死亡率,这给转移性骨癌的治疗带来了独特的挑战。48。不管针刺激动剂似乎会带来多少好处,重要的是要考虑干预可能具有治疗价值的时间点。虽然我们的研究主要集中在较早的针刺激动剂的使用(第3天和第7天,肿瘤接种后),保护作用持续对骨癌疼痛,骨破坏和局部肿瘤负担持续到相对较晚的时间点。早期干预很可能比晚期干预更有效,而且需要注意的是,许多骨癌患者是在疾病相对较晚的阶段被诊断出来的。49。因此,针刺激动剂是否能在疾病的中晚期给予长期的保护是一个有趣而重要的未来方向。

值得注意的是,针刺激动剂足以在天真的小鼠体内以一种依赖于Ⅰ型干扰素的方式产生抗接种感。23。在胫骨骨折所致的无瘤性骨痛模型中,针刺激动剂能有效地降低机械性和寒冷性超敏反应,并进一步改善运动功能(图一)。9)。这些观察进一步表明,刺通过调节感觉神经元、破骨细胞和癌细胞的活动,在多个水平上控制疼痛(图1)。10)。有趣的是,老鼠缺乏刺痛和伊夫纳1骨痛在基线时明显增加(机械性痛觉),支持针刺/干扰素-i在稳态条件下对疼痛的调节中的关键作用。23。考虑到SING是许多PRR信号通路的整合者,并且它本身也是来自共菌群、入侵病原体和宿主细胞的DNA的传感器,一个关键的问题仍然是:是什么信号激活了SING/IFN-I信号轴来影响生理伤害感?有趣的是,共有微生物区系已被证明可以通过类收费受体信号来调节系统IFN-i的基本水平,从而启动保护性免疫。50,51。是否有类似的针刺介导机制存在于感觉神经元内,以抑制生理疼痛是一个有趣的未来方向。同样,在骨髓微环境中,大量的证据表明肠道微生物通过骨免疫调节在生理骨稳态中发挥着重要的调节作用,尽管其净效应是合成的还是分解的还存在争议。52,53.

我们注意到本研究的几个局限性。首先,针刺和Ifnar1缺乏小鼠的疼痛敏感性增加,可能会使针刺激动剂的抗接种作用的解释复杂化。然而,针刺激动剂未能提高这些敲除小鼠的疼痛阈值。此外,针刺激动剂可能通过对本研究中未分析的其他细胞类型,如外周免疫细胞或背根神经节或脊髓背角内的胶质细胞的作用来减轻癌痛和骨痛。因此,研究针刺/IFN-Ⅰ通路镇痛作用的特异性免疫细胞和胶质细胞类型将是未来重要的研究方向。有趣的是,小胶质细胞是在脊髓背角表达刺痛的主要细胞类型。23,小胶质细胞是慢性疼痛(包括癌症疼痛)发病的重要因素。54,55。第三,我们的电生理研究集中在SING/IFN-I信号如何改变小直径伤害感受器(主要是无髓C-纤维)的活动,因为这些神经元是导致骨癌疼痛的关键因素。33。然而,还需要注意的是,肿瘤细胞对支配骨髓和矿化骨的无髓和有髓感觉神经纤维都有致敏和损伤作用。56。因此,研究针刺激动剂是否也能调节A-纤维的活性也很有意义,因为在小鼠DRG中,C-纤维和A-纤维都表达IFN-Ⅰ受体成分。23,57。最后,鉴于临床前和临床研究中日益强调严密性和可重现性,进一步研究刺痛在癌痛中的作用将是非常重要的,既可以验证本研究的结果,也可以探讨针刺激动剂在癌症疼痛和其他疼痛条件的附加模型中的通用性。

到目前为止,大多数临床试验探索针刺激动剂在人类患者中的疗效,主要集中在肿瘤内给药,主要是在晚期实体肿瘤中。虽然全身给药可能会增加治疗相关的副作用(Tres),但对于转移性疾病和/或长期预后不良的患者来说,增加毒性可能是可以接受的,特别是在伴有减轻癌症疼痛和改善功能的情况下。此外,虽然免疫介导的抗肿瘤作用可能通过肿瘤内给药而最大化,但这种给药方式可能不足以产生我们这里所展示的镇痛或骨合成效应。值得注意的是,在人类患者中,针刺激动剂作为一种单一疗法几乎没有什么疗效,但与抗PD-1免疫治疗联合使用时,已经显示出了效果。然而,在这些研究中,结果通常是以客观反应率(ORR)来衡量的,后者只考虑肿瘤大小的缩小。值得注意的是,抗pd-1治疗在llc诱导的小鼠骨癌模型中减轻了癌痛,但没有改变肿瘤负担。30。尽管在临床前和临床研究中,刺痛激动剂在控制肿瘤生长方面存在争议,但我们的发现强调了基于刺刺的免疫疗法在治疗癌症疼痛,尤其是骨癌疼痛方面的应用,这是由于针刺通路在免疫调节、神经调节和神经免疫相互作用中的多种作用(图1)。10)。因此,临床试验测试潜在的针刺免疫治疗药物也应考虑测量癌症相关的共患病,包括功能损害和疼痛的参数,因为改善癌症患者的生活质量与延长生存期同等重要。


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