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谱系界定的平滑肌肉瘤亚型在诊断前几年就出现了,并决定了病人的生存

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发表时间:2021-07-29 10:09作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

平滑肌肉瘤(LMS)是沿平滑肌线分化的基因异质性肿瘤。目前,LMS治疗是不知情的分子亚型,并与高度可变的生存。尽管疾病部位继续支配着临床管理,但遗传因素对LMS亚型、起源和时间的贡献尚不清楚。我们分析了LMS的70个基因组和130个转录序列,包括多个肿瘤区域和配对转移。分子特征分析强调了LMS的早期起源。我们发现了三种LMS的特殊亚型,它们可能是从不同的平滑肌细胞谱系发展而来的。其中,免疫浸润程度高的去分化LMS和以妇科肿瘤为主的肿瘤存在着基因组dystrophin缺失和/或dystrophin表达缺失,获得了最高的基因组突变负担,且与生存相关。同源重组缺陷导致基因组范围的突变特征,对PARP诱捕器和其他DNA损伤反应抑制剂的敏感性,为LMS提供了一种有前途的治疗策略。最后,通过系统发育重建,我们提出的证据,克隆播种致死性转移出现在几十年前的LMS诊断。

导言

平滑肌肉瘤是一种平滑肌分化的恶性肿瘤,占肉瘤诊断的10-20%。1。其原发部位和临床过程的异质性,包括肿瘤转移的发展和治疗的反应,使得LMS的治疗尤其具有挑战性。常见的表现部位包括四肢、子宫和腹部,后者主要来自后腹膜,但也来自内脏。虽然所有的LMS,无论解剖来源,沿着平滑肌谱系分化,疾病的部位继续被用来分层的护理途径。10年的转移率因疾病部位而异(31%在四肢,58%在腹部,53-71%在子宫)。2,3。然而,导致这些位点特异性存活差异的分子因素是否与疾病发生或获得的起源细胞中的谱系、分化状态或突变过程有关,目前尚不清楚,这些因素涉及独特的驱动基因突变。

由于主要的失败模式是转移的发展,LMS患者的预后没有得到改善,因为目前系统治疗的整体效果仍然很差。4。最近利用靶向测序和/或rna-seq进行的研究证实了TP 53, Rb1, PTEN,和ATRX,以及17p11.2-p12的反复放大(MYOCD)5,6。其中一项研究还表明,LMS对聚合酶链反应抑制(PARPI)可能是敏感的。BRCA 1/BRCA 2。“BRCAness“本研究报告了48/49例(98%)患者的突变特征。5。如果得到验证,这将支持在LMS中使用PARPI。全基因组测序(Wts)通常比外显子测序多产生100倍的突变,因此,它是验证和完善突变特征分析的首选方法,特别是用于相互分离相关的签名。7.

大多数LMS患者在50-60岁时出现非特异性症状.这些肿瘤可能在几年内逐渐发展。因此,更好地了解LMS突变的时间,将为肿瘤的发展提供知识,并可能有助于早期发现。同样,了解LMS的持续突变动态,包括其突变率和肿瘤进化的总体模型,可以在转移扩散发生之前为患者确定合理的监测策略。

本文通过对113例LMS患者70个全基因组和130个转录体的分析,研究原发性和转移性LMS的突变过程。这包括来自单个肿瘤的多个区域和/或及时分离的远处转移复发的样本。我们观察到在原发肿瘤和转移性复发之间广泛的遗传多样性,特别是在只有WGS才能检测到的重排和聚集突变方面。这些结果为LMS的分子分型提供了令人信服的支持,并为诊断前的早期系统性传播提供了证据。这项研究还强调了DNA损伤抑制剂(DDRI)的潜在应用,包括PARP诱捕器,作为治疗这些患者的一种有希望的途径。

结果

一个独特的lms队列的全基因组和转录组序列分析

为了重建支持LMS的分子事件,我们对LMS中体细胞突变的模式、位置和进化进行了分析,无论是在肿瘤之间还是在肿瘤内部。共分析了LMS的70个基因组和130个转录组(附图)。1A)。其中,来自34例患者的53份样本进行了新的基因组测序。另有18个全基因组,以前由癌症基因组图谱(TCGA)报告。6,包括在内。仅使用TCGA-SARC程序批准的经验证的LMS样本(补充图).1B,见方法)。所有患者均以匹配的血液或组织作为参考。我们对包括TCGA在内的所有标本进行了详细的病理回顾。在这篇综述中,我们发现了一种致病性试剂盒变异体已知与胃肠道间质瘤有关8(GIST)在一个TCGALMS样品中,促使其从进一步分析中去除。所有的基因组都是通过相同的信息学管道进行处理的。9检测体细胞突变,包括替换、小插入或缺失(Indels)、拷贝数变化、结构重排以及群集和复杂事件(补充数据)16)。对于7例患者,我们对单个肿瘤和/或远处转移复发的多个区域进行了空间或时间上的分离。从这些患者中挑选了16个信息丰富的样本进行额外的、靶向的、深度测序(~700 X),以验证这些多区域或匹配的原发转移样本中存在的替换、indels和结构变异(补充图)。2)。对130例(多伦多51例,TCGA 79例)的转录产物进行了RNA序列分析和融合基因分析。据我们所知,这项工作是迄今为止对LMS中体细胞突变的最广泛的分析。

LMS的三种分子亚型,具有不同的基因组和转录程序,与患者的生存密切相关。

虽然LMS是一种以平滑肌分化为特征的单一疾病,但其临床表现和行为变化很大。10。这种变异在多大程度上是由基因组和转录特征解释的,这在很大程度上尚不清楚。作为一个起点,我们检查了肿瘤的整个转录序列,并通过主成分分析发现了三种主要的基因表达亚型,这些亚型没有被疾病部位完全解释(图一)。1A)。我们观察到三种LMS亚型与以前的研究一致。5,6,11,12,13,14其中含有已建立的生存基因表达标记(补充图)。3A)。混合型:妇科43.4%,四肢30.4%,腹部13.0%,转移8.6%,其他4.3%。亚型2主要为腹部肿瘤和轻度四肢肿瘤(63.5%为腹部肿瘤,17.6%为四肢肿瘤,1.1%为妇科肿瘤,15.2%为转移瘤,2.3%为其他肿瘤),而第3亚型几乎完全由妇科LMS所组成(90.9%,9.1%其他)。转录组定义的亚型也与全基因组突变负担的差异有关(图一)。1B,补充数据7)。LMS亚型1和3(分别为混合和妇科)有较高的总体体细胞突变负担,与2亚型(腹部/四肢;补充图)相比,总体存活率和疾病特异性较差。3B、C)。所有类型的突变都是如此,包括替换(2.7对1.9 Mut/Mb,N.S.),indels(605 vs 359 v indels,p < 0.05, Welch’s t-测试)和大规模重排(224对82重排,p < 0.01, Welch’s t-测试)。

图1:LMS转录亚型的基因组差异和正常细胞谱系。
figure1

aLMS转录谱的主成分分析(PCA)n=79 TCGA RNA-seq和n=51多伦多RNA-seq)导致三种明确的LMS亚型,其中分离受到解剖位置的广泛影响。亚型1是所有部位(四肢、腹部和妇科)的混合体,而第2亚型主要是腹部,并伴有一些肢体肿瘤。亚型2可进一步细分为2a和2b亚型。2亚型转移灶与原发灶相匹配。有两个1亚型转移瘤来自同一患者。最后,亚型3主要代表妇科(子宫,阴道,输卵管)的亚型。b亚型2的基因组点突变、插入/缺失(Indel)和结构变异(SV)负担低于亚型1或3。水平黑线代表每个亚型的中值。源数据在补充数据中提供7. cLMS分子亚型具有明显的平滑肌谱系:三角图的顶点代表血管、消化组织和妇科组织的平滑肌。单个点代表LMS癌症以及它们在簇中的位置。相邻等高线图显示了LMS分子亚型的密度分布。d均匀流形近似和投影(UMAP)显示了271个肌肉相关的GTEx正常组织类型(来自基因-组织表达程序)和130个LMS显示明显的平滑肌谱系的LMS亚型。e脂质体代表平滑肌(SM)基因的表达(以百万份转录本表示):LMOD 1(平滑肌素1)、MYOCD(肌钙蛋白)、DES(Desmin)和CALD 1(Caldesmon)是LMS中常见的关键平滑肌基因。方框代表第25和第75百分位数(框的底部和顶部)和中值(水平带)。晶须表示上下四分位数的变化。这些基因在血管(n=110),消化(n=119)和妇科(妇科)n=42)正常平滑肌。基因也在亚型2(n=85)和第3亚类(n=22)LMS,但在LMS第1亚型(n=23)。

然后,我们使用基于均匀流形逼近和投影的正交方法验证了这些表达式子类型(UMAP)。15)和基于密度的带噪声应用空间聚类(DBSCAN)16见方法)。为了优化亚型的产生和分类,我们采取了两种实验方法。首先,我们在分析中包括了12,419个不同组织学类型的肿瘤。其次,我们将130例lms肿瘤与来自无癌供体的1735例正常组织进行了聚类。17,18。我们使用泛癌聚类方法发现了同样的亚型,但我们现在能够将亚型2分成两类:2a亚型(几乎完全由腹部LMS组成)和2b亚型(包括腹部和四肢肿瘤)。(补充图。4)。在130个RNA样本中,有3例(2.3%)聚在三种LMS亚型之外。我们回顾了每个病例的组织病理学,但没有发现任何进一步的证据来支持诊断的改变。在一个例子中,胃LMS类似于来自TCGA的胃癌。起源组织的差异可以解释这些罕见的LMS肿瘤。第二种方法是将肿瘤与正常组织相匹配,发现3种主要组织类型与LMS非常相似(51种):(1)消化性平滑肌(食管肌/胃食管交界、结肠、膀胱);(2)血管平滑肌(胫/冠状动脉、主动脉);(3)妇科/输卵管平滑肌。1C,d,补充图。5)。不出所料,妇科LMS最像正常的妇科组织。2a亚型(几乎完全是腹部)与消化平滑肌聚在一起,而1亚型(混合)和2b亚型(腹部/四肢)大多类似于血管平滑肌,与四肢一致,腹膜后LMS与血管相关。这些分析定义了LMS分子亚型背后的细胞谱系。

LMS亚型肌肉相关基因的基因组改变

在了解了lms的分子亚型与它们各自的平滑肌谱系的紧密联系之后,了解了某些肌肉标记基因在一些lms中的过度表达。11,12,我们接下来寻找与平滑肌分化和功能相关的基因的改变。我们在平滑肌标记基因中寻找突变(点突变、indels、结构变异或焦点拷贝数变化):LMOD 1, CALD 1, MYOCD, DMD, ACTG 2, DES, CFL 2,和SLMAP。最常见的改变是重复基因内缺失的dystrophin(DMD)基因8/51(16%)和局灶性肌钙蛋白(MYOCD)在20/51(39%)患者基因组中的扩增(附图)。6A-C)。事实上,DMD删除次数与ATRX删除和最经常发生的结构变异在LMS之后Rb1(补充数据)3)。有趣的是,DMD缺失主要发生在LMS亚型1中,在较小程度上出现在亚型3中,而MYOCD放大更常见于亚型2和3(补充图)。6d)。值得注意的是,MYOCD(17p12)经常伴随的放大TP 53(17p13)联合节段损益模式中的损失(补充图)。6B),在五个案例中,MYOCD通过复杂的拷贝数模式进行扩增(补充图)。6C)。关于DMD改变,这是众所周知的,营养不良缺乏导致Duchenne和Becker肌肉营养不良;然而,其在癌症中的作用还没有得到明确的界定。最近的数据表明,肌营养不良蛋白可以作为抑癌因子,限制肌源性癌症的转移。19。此外,据报告,DMD在3/7原发LMS和8/13转移性LMS中,snp阵列检测到缺失,从而消除了编码dp 427m的dp 427m全长dystrophin转录本的表达。19。为了进一步研究这一点,我们寻找了dp427m转录本在基因组样本中的失表达情况。DMD7/8例(88%)未发现缺失,7例(88%)未见表达,7例(88%)表达较低(附图)。7A)。令人惊讶的是,无论分子亚型如何,大多数妇科LMS(21/28,75%)Dp427m转录本的表达减少或完全缺失,即使DMD缺失未检出,提示可能存在营养不良蛋白失活的替代机制。这似乎是妇科lms的一个独特特征,在软组织lms中没有发现。DMD缺失或正常子宫组织(附图)7b)。为了证实LMS中的肌营养不良蛋白亚型与Duchenne型肌营养不良症(DMD)患者相似,我们对6例DMD患者的肌肉活检进行了RNA测序,并观察到:DMD在Dstrophin缺失的LMS转录子中,确实有类似于肌肉营养不良患者的表达(补充图)。7A)。加在一起,我们发现DMD基因与全长缺失DMD表达与LMS亚型1和3相一致,与不良结局一致。

1亚型LMS与肌原脱分化和高免疫浸润有关。

考虑到肌营养不良蛋白(一种重要的肌肉蛋白)在亚型1中的缺失率,我们想知道1亚型是否构成了LMS的一种分化程度较低的总体形式,而LMS已知是预后不良的一个指标。20。与此相一致的是,大多数肌肉分化的标志,包括莱莫丁1(LMOD 1)(),caldesmon(CALD 1),以及MYOCD亚型1减少(图1)。1E,补充图。8)。然后,我们将LMS与来自TCGA的未分化多形性肉瘤(UPS)进行了比较,因为这两个实体在组织学上很难区分。21。大多数UPS肿瘤聚集在LMS亚型1-唯一有非LMS癌组的亚型(补充图)。9)。提示LMS亚型1可能代表一种具有侵略性的去分化型LMS。

对许多实体肿瘤来说,去分化为“干细胞”是免疫抑制。22,23然而,这与LMS及其分子亚型的关系尚不清楚。为了确定免疫微环境与LMS脱分化状态的关系,我们获得了79例TCGA LMS标本的白细胞比例和细胞类型。24并进行了硅免疫分析。与以前的工作一致25,26,27M2巨噬细胞是LMS最常见的免疫细胞。有趣的是,我们发现去分化亚型1型LMS含有较高的白细胞含量,特别是M2型巨噬细胞,高于亚型2或3(补充图)。10A,B,见方法)。值得注意的是,该子类型的已建立标记,ARL4C在1LMS亚型中,如预期的那样过度表达。11(补充图。10C)。白细胞比例较高的肿瘤对免疫检查点的抑制最敏感,最近在UPS和去分化脂肪肉瘤中证实了这一点。28。在LMS中,浸润成分反映了以M2巨噬细胞为主的低淋巴细胞分布,与免疫抑制的肿瘤微环境相一致。这可能使lms,特别是低分化亚型lms对巨噬细胞集中的免疫调节剂更有反应。29,30。然而,这些调查结果值得进一步调查。

基因组替代和独立标记识别LMS的治疗前暴露和治疗策略

接下来,我们进行了突变特征分析,以确定LMS亚型是否是由不同的诱变过程驱动的。我们首先使用一个已建立的签名提取工具SigProfiler更新了一种新的提取方法。7,31这与以前在LMS外显子上使用的“改装”方法不同。5。利用SigProfiler的LMS突变签名,我们对WGS检测到的突变的数量和种类进行了优化,包括基于单碱基替换(SBS)、双碱基替换(DBS)以及插入和删除(ID)的签名。由于WGS提供的数据点更多,以前相关的签名现在可以分开。其中一个特征是人力资源不足或‘BRCAness‘签字(SBS 3)。我们通过两种方法验证了我们区分SBS 3和其他“平面”签名的能力。首先,我们证明了我们的产量与ICGC/TCGA全基因组分析中的地面真相目录之间有很强的相关性(>99%Pearson系数)(补充图)。11,见方法)。其次,我们从突变剖面的重建中删除了SBS 3,并评估了余弦相似性的变化(补充图)。12,见方法)。因此,采用一种基于WGS数据点的新提取方法,可以很好地识别特定的突变源。

在这70组LMS肿瘤基因组中发现了27个已建立的签名,其中包括14个SBS、5个DBS和8个ID签名(图1)。2A,补充图。13)。在这些疾病中,有13例有已知或拟议的病因。四个序列伪影(SBS 45,SBS 46,SBS 49,SBS 52)被移除(见方法)。在宇宙中没有发现的两个ID签名和一个DBS也被识别并且原因不明(补充图)。14)。值得注意的是,在所有已知的放射治疗样本(9/9)中都检测到ID8,这一特征符合提示的病因学。这包括两例患者曾因先前的癌症接受过放射治疗,表明LMS是这些患者的继发性癌症。总之,突变标记强调了DNA修复缺陷在LMS中的重要性。我们发现SBS 8与核苷酸切除修复不足有关。32,以及sbs 3和id6,它们是基于缺陷的同源重组dna损伤修复的标志。31,33。39/61(63.9%)的LMS标本(13/65 SBS3,18/65 ID6,8/61)均检出SBS 3或ID6。因此,我们能够确认是否存在hr缺乏症替代信号,尽管其频率低于以前报道的频率。5,以及在LMS中是否存在相应的HR-indel签名。

图2:LMS的基因组突变特征和DNA损伤反应缺陷的功能评估。
figure2

a非负矩阵因式分解(NMF)提取和分解单取代(SBS),indel(ID)和双核苷酸签名(DBS)在热图.常见的替换签名包括SBS 1、SBS 5、SBS 8和SBS 40。在64%的样本中发现SBS 3和ID6(HR-缺乏症).SBS 2、SBS 13和DBS 11反映了局部的超突变事件,也称为“kataegis”。ID8是一种辐射特征,在接受放射治疗的患者中很常见。“其他”替代签名,在不到5%的样本中存在,可以在补充图中找到。13。颜色是指签名活动。b评价软组织(ST)LMS细胞系(STS 39、STS 54、STS 137、STS 210和STS 551)和妇科LMS细胞系(SKLMS-1、SK-UT-1和SK-UT-1B)对DNA损伤反应途径(PARPI)的敏感性。c具有代表性的欧共体箱形图50来自LMS(n=8)及UPS(n(5)PARP抑制剂、他拉唑巴布和奥拉帕瑞布处理的细胞株。方框代表第25和第75百分位数(框的底部和顶部)和中值(水平带)。晶须表示上下四分位数的变化。对于olaparib处理,只对7株LMS细胞和3株UPS细胞株进行生长抑制,其余1株LMS细胞和2株UPS细胞株与RPEΔP53对照细胞均未发生生长抑制。相反,所有的LMS细胞系都对talazoparib(中位数EC)有反应。50与UPS细胞系比较(中位数EC)506.26 M,p=0.072,单侧韦尔奇t-测试)。所有患者衍生细胞系(LMS和UPS)的详细信息可在补充数据中找到89. d交通灯报告(TLR)分析使用荧光系统(gfp和mCherry),在诱导双链断裂(Dsb)时,测定同源重组(HR)和非同源末端连接(Nhej)的效率。获得稳定的LMS-TLR(STS 39-TLR、STS 137-TLR和STS 210-TLR)和对照细胞系(RPEΔP53-TLR和RPEΔP53ΔBRCA 1-TLR),其中含有TLRⅠ-SCEI靶位点的一个拷贝。介绍了一种用BFP标记的I-SCEI来评价修复效率.HR修复DSB会产生不同的荧光信号(Gfp)。+),与NHEJ(MCherry)相比+)。LMS细胞株与RPE、Δ、p53、Δ、BRCA 1对照细胞系相比,显示HR缺乏。相反,GFP+在HR熟练的RPE、Δ、p53细胞株中检测细胞。e条形图显示了GFP到mCherry信号在每个LMS细胞系和对照组中的定量。完整HR(GFP)+)RPEΔp5 3细胞株和RPEΔp5 3ΔBRCA 1对照细胞的表达水平分别为6倍和6倍。通过三个独立的实验,从8个细胞系中提取数据,误差条表示标准差。源数据作为源数据文件提供。

LMS中DNA损伤修复与同源重组缺陷(HRD)的功能验证

为了验证在LMS原发肿瘤和转移中发现的SBS 3、ID6和DNA修复和损伤途径失调水平的增加是否代表了靶向治疗的机会,我们对一组LMS细胞系(5个LMS原生系,3个ATCC)进行了功能测试,以评估其对DNA损伤和PARP抑制剂的敏感性(图)。2B,c,补充图。15)。这些细胞系反映了LMS原点的多样性,因为其来源于腹部、四肢和妇科(补充数据)。8)。首先,我们测试了其他DDRI抑制LMS细胞生长的效果。这些抑制剂主要针对在DNA损伤反应通路中起关键作用的关键激酶。所有LMS细胞对CHK 1抑制剂Prexasertib HCl(LY 2606368)均有反应。类似地,7/8的LMS细胞株对WEE 1抑制剂Adavosertib(AZD 1775)有反应,而只有5/8的LMS细胞株对ATR抑制剂Ceralasertib(AZD 6738)有部分或完全的应答。2B)。为了确定PARPI在LMS中的有效性,我们比较了LMS细胞系对原始UPS细胞系(n=5,见补充数据9)和控制:(1)CRISPRTP 53缺失(rpeΔp53,HR完整)细胞,(2)aTP 53BRCA 1缺失(rpeΔp53Δbrca 1,HR缺陷)34(3)HS 789.Sk.在三个独立的实验中,用24点浓度的他拉唑巴利(0.013~10μM)处理LMS细胞。所有的LMS细胞株对PARP诱捕器(Talazoparib)都有高度的反应,且EC中位数。500.055.37μM(0.0 4~0.8μM),其中抑制作用最强的是妇科LMS细胞(0.055μM对0.5 1μM)。2B,c)。相反,鉴于我们严格的阈值标准,大多数LMS细胞系对olaparib的反应不那么灵敏(EC)。50 < 1 μM is considered responsive). Taken together, it is evident that there are many promising therapeutic avenues for LMS patients that largely rely on LMS cells’ inability to repair DNA efficiently.

为了直接研究hr在lms细胞中是否有缺陷,我们使用核酸酶诱导的基因组工程报告系统(Tlr)来监测hr和非同源端连接(Nhej)对dna损伤的反应。35,36。总之,如果双链断裂dna修复是通过一种HR依赖的机制在本实验中,一个gfp开放阅读框被恢复。相反,如果NHEJ是可操作的DSB修复机制,则移码将mCherry编码序列放置在帧内.在LMS细胞中,mCherry信号对dna损伤的反应明显增强,类似于rpeΔp53ΔBRCA 1 HR缺陷对照(图1)。2D,e)。鉴于LMS细胞对PARP诱捕器(Talazoparib)以及WEE 1和CHEK 1抑制剂的敏感性接近普遍性,这些DDR是治疗LMS患者的有前途的药物。

基因组突变突出原发性和转移性LMS的早期进化差异

接下来,我们询问LMS肿瘤的亚型是否固定或复发时是否能改变。在5个原发远处转移复发的肿瘤对中,所有复发患者的基因表达程序都与相应的原发肿瘤相似。一般来说,来自同一患者的所有肿瘤(无论发生在不同的地点或时间点)都保持其转录亚型(见附图)。4A)。这表明LMS亚型在肿瘤演化早期就已建立,并在此后得以保留--即使是由多年分离的不同器官产生的肿瘤也是如此。

除了保持其明确的分子亚型外,来自同一病人的多个样本在反复发生的驱动因素中也有早期的错义突变(例如(TP 53)(补充图。16)。我们利用了许多LMS进行全基因组复制(WGD)的优势,从而为我们提供了一个可以与之比较的共同的时间里程碑。在31/70(44%)LMS全基因组序列中检测到WGD。利用这些WGD案例,Jolly和Van Loo的原则37和突变时间38一种用于对体细胞突变进行克隆和亚克隆拷贝数状态计时的工具(见方法),我们发现只有37%的替换发生在WGD之前,而其余的是晚期事件(补充图)。17)。同样地,我们发现在WGD之前可能存在驱动缺失,包括杂合性丢失(LOH)、复制中性LOH、复制增益LOH事件和纯合子缺失。这些早期臂水平或全染色体缺失涉及众所周知的抑癌基因,如Rb1 (93%), BRCA 2 (87%), Cdh 1 (67%), FANCA (60%), TP 53 (87%), BRCA 1(42%)PTEN(71%)(附图)18A,B,补充数据4)。因此,除了体细胞TP 53替换,这很可能是基因组的第一次改变(补充图)。17A、C)、抑癌染色体丢失是平滑肌肉瘤发生的早期和开始事件,在DNA扩增之前(补充图)。18D).

LMS肿瘤中的亚克隆在建立其亚型和获得典型突变后开始发散。这一点在考虑体细胞结构重排时尤为明显,这是一种被外显子或靶向测序所忽略的突变类型。而>60%的克隆替换和INDEL突变发生在原发和转移瘤对之间,但只有20%的结构重排是常见的,说明这些事件大多发生在分化后(图1)。3A、补充图。19A)。原发性或转移性肿瘤所特有的克隆突变的高频率表明它们是平行进化的。这进一步得到区域突变热点(也称为kataegis)的存在的支持。33,在原发或转移性肿瘤中均有明显表现(图1)。3B)。第一次被描述为乳腺癌33,这种聚类替换模式尚未在LMS(补充数据)中报告5)。此外,一个肿瘤(Ab17)在原发灶和转移性复发之间也显示出单独的嗜铬细胞现象(补充图)。19b,C)。这些数据表明,在获得了关键的驱动因素后,LMS肿瘤会以WGD、kataegis和/或嗜铬细胞癌的形式经历晚期的突变。这些事件分别发生在原发和转移对之间,表明转移后原发和复发的基因继续多样化。

图3:LMS肿瘤的克隆进化和系统发育分析。
figure3

a患者Ab17有原发(Dx)和两例转移性复发(MR1和MR2)。n=3个样本)。结构变异(SV)重叠(中、上)和肿瘤细胞比例(CCF)的单核苷酸变异(SNVS)(中,底部)表明,有许多SVS和克隆变异独立出现在原发肿瘤和转移性复发。在最右侧可见Ab17肿瘤的系统发育重建。创建者克隆人有一种致病性TP 53替换、全基因组复制(WGD)以及杂合性丢失(LOH)事件TP 53Rb1。每个圆圈的颜色代表一个不同的克隆群体。每个样本显示克隆轨迹和最终组成。分支长度与树组变异分配成正比。b患者Ab17在诊断和首次转移复发时的降雨图显示了这两个时间点之间不同染色体上的差异kataegis事件。有针对性的测序数据被用来证实每一个标本的kataegis事件是独特的。c描述了患者AB 12的临床过程,不涉及事先治疗,只涉及手术。诊断时原发标本(Dx)位于下腔静脉。肿瘤被分割,穿孔活检在三个物理上遥远的多区域(MURE)位置(n=3个样本)。该肿瘤的系统发育重建显示在原理图的右边和一张切除的照片上。创建者克隆人有一种致病性TP 53替换,以及包括以下内容的LOH事件TP 53, Rb1,和PTEN。较大的圆圈代表主要的克隆,而较小的圆圈代表亚克隆。每个圆圈的颜色代表一个不同的克隆群体。每个样本显示克隆轨迹和最终组成。分枝长度与树组变异分配成正比,除了8,10和6,7个克隆,其中DPClust突变分配用于分层样本。

原发肿瘤的转移性LMS分支在诊断前几十年

然后,我们检查了LMS突变的绝对时间,无论是在多个区域的肿瘤中,还是在成对原发复发的肿瘤对之间。对3例患者的3例肿瘤(2例原发灶和1例转移性复发)进行了多区域测序,并对来自同一患者的其他肿瘤进行了大量测序(图5)。3C和4)。我们用一种建立的方法(树组学)重建了每个病人癌症的系统发育。39),基于共享突变早、私有突变晚的原则。我们使用我们的目标深度测序面板验证了共享的或私有的突变,目的是对超过75%的点突变、所有非同义的indels以及在已知癌症基因中具有断点的结构变异进行测序(附图)。20)。此外,我们还证实了我们的系统发育,并确定了LMS肿瘤中的亚克隆群体,方法是使用Dirichlet过程模拟变异体的细胞组分,如前面所述。40,41(见方法,补充图。2123)。在所有病人中,TP 53CHR 10的突变和染色体丢失PTEN), 13 (Rb1)和17(TP 53)是系统发育树共同主干的一部分,从而支持我们大量的、单一的肿瘤测序数据,即这些是基因组中最早的事件。我们还注意到Wnt/β-catenin信号通路的改变,这是我们系统发育的主干的一部分(图)。3A还有无花果。4)。值得注意的是,我们发现在两个多区域病例中,转移性复发早于原发肿瘤分支(见图)。4)。这一发现也得到了(大量)原发转移对的支持。在患者Ab6中,第一次转移复发(MR1)似乎在原发(Dx)和第二次转移复发(MR2)分离之前就分支化了。这些数据支持分支进化模型,其中克隆与一个共同的祖先分离并并行进化,从而形成多个克隆系。42.

图4:LMS肿瘤的平行演化。
figure4

报告2例LMS患者的临床病程(每例>3例)。在系统发生方面,较大的圆圈代表主要的克隆,而较小的圆圈代表亚克隆。每个克隆的颜色表示一个不同的克隆群体。每个样本显示克隆轨迹和最终组成。分支长度与树组变异分配成正比。(a患者Ab6采用射频消融(RFA)和化疗(化疗)治疗。他们在三个不同的时间点(T1,T2和T3)有三个肿瘤。诊断时原发肿瘤(Dx)位于小肠,第一次转移复发(MR1)位于肝脏。第二次转移复发(MR2)多灶性,见于股外侧(大腿肌)。MR2被分割,并从两个病灶(区域/Re 1-5)的五个不同区域进行活检。在大体积(Dx,MR1)和多区(MR2)测序后,在右侧可以看到系统发育重建。早期替换TP 53, Rb1CREBBP,以及第10号染色体的LOH事件(PTEN), 13 (Rb1),第17条(TP 53)在这个病人的肿瘤的创建者克隆中观察到。11号染色体Kataegis事件斯潘缺失在Dx和MR2中常见,而MR1不常见。基因组加倍和X染色体Kataegis只发生在MR2中。转移性多灶性结节非常相似。采用钟状突变,Dx和MR1在这些患者的诊断前大约有30年的发散,而Dx和MR2在诊断前大约有25年的发散。(b患者AB11接受放射治疗(RT),并在两个不同的时间点(T1和T2)出现两个肿瘤。Dx位于右肾后侧和下腔静脉。该肿瘤被分成两面,并从四个区域进行了活检。肝转移复发(MR1-3)。以下是大量(T2:MR1-3)和多区域(T1:DX,Regions/Re1-4)测序,系统发育重建在右侧。与Ab6非常相似的是,染色体10、13和17的早期丢失被观察到。也见得早AXIN 1TET 2点突变ATRX删除,以及Rb1易位。2号染色体kataegis事件是Dx特有的,而chr 6色蓟马事件是MR1-3特有的.染色体12 kataegis事件仅发生在2/3的肝转移瘤中。使用钟状突变,Dx和MR1-3发散约15年前诊断该病人.

为了确定原发肿瘤和转移瘤的差异,我们建立了LMS及其亚型的突变率(表示为每年每千兆位的替换;见方法和Anderson等)。9)。信号1突变(SBS 1)与年龄成正比,因此可以近似于受精卵后细胞分裂过程中所经历的有丝分裂的数目。43(补充图。24)。用SBS 1作为分子秒表,我们确定原发和复发的LMS癌症可以被估计为在诊断前10到30年之间已经分化--提供了许多年来积累我们观察到的私有突变(图一)。3A)。多个转移的分歧也发生在患者的遥远过去,在一个类似的时期(10-30年前诊断)。这就引出了一个问题:相邻的肿瘤灶或相邻的肿瘤区域--只有几厘米--在多长时间前彼此分离?正如预期的那样,空间距离增加的区域在基因上也更加不同。这一点在病人Ab6中尤为明显,我们从患者Ab6中分离出两个肿瘤灶的5个区域(3个区域来自病灶1,2个区域来自Focus 2),以及他们的原发肿瘤和第一次转移(图1)。4A)。从最早到最新的分化:~30年前诊断为腹部大面积LMS,Ab6‘s原发肿瘤和首次转移复发(MR1)发散;5年后(大约在最初诊断前25年),转移复发2(MR2)的祖先发散。MR2在患者股外侧区建立后,在诊断前6~7年再次发散,导致两个相互独立的病灶相距约1.5cm,在每一个平行的进化焦点内,进一步的遗传多样性导致肿瘤区域彼此分离<1cm,在初步诊断后2~4年内出现分化。对患者AB 11的类似分析证实了LMS的早期起源及其致命复发的早期差异(图一)。4B)。因此,多区域和配对原发转移复发测序建立了LMS癌症的早期和平行的基因组进化。

讨论

通过对原发、转移性和多位点取样肿瘤的全基因组和rna测序的广泛观察,我们确定了分子亚型的基因组基础,发现了临床相关的突变特征,并概述了该疾病的进化轨迹。

这项研究的首要主题是,LMS癌症的侵略性的种子是很早就播下的。肿瘤的起源组织类型,无论是消化、血管和/或妇科平滑肌,再加上其脱分化程度,是LMS分子亚型和患者最终存活的主要决定因素之一。总的来说,我们描述的三种亚型与前面描述的转录子群具有相似之处。11,13,尽管需要进行元分析来评估不同NGS平台的效果。因此,从LMS的多种努力和正在进行的协作倡议中出现了一个框架,它将对LMS亚型产生一致的分子定义,包括名称的解析、临床信息和有助于病人分层和/或预测的生物标记物。

在本研究中,我们描述了两种生存能力较差的LMS亚型,即1亚型(去分化型)和3型(主要是妇科),这两种亚型也是由躯体营养不良蛋白缺失和高免疫浸润的流行情况所决定的。与此相一致的是,在非肌源性癌症中也发现了dystrophin缺失,其频率高于或类似于其他著名的抑癌基因,且与整体生存率显著降低有关。44从而凸显了营养不良蛋白作为一种新兴的肿瘤抑制因子的作用。重要的是,这些亚型可能有助于鉴别肿瘤的预后和相同的解剖部位。实施LMS分子分型,包括将肿瘤与正常平滑肌组织相匹配,可用于诊断时显示原发组织。具体来说,我们队列中的一个LMS肿瘤是从一个肢体部位切除的,聚集在1亚型组和正常的妇科组织中,表明它实际上是子宫转移,与患者的临床病史直接相关。确定这个“极端”肿瘤的起源的能力可能为这个病人提供不同的,更有效的治疗方案。这种方法还可以帮助解决以前的病理不确定且无法记录LMS的主要部位时的差异。例如,这是诊断子宫肌瘤的一个持续的难题。45.

由原发组织类型和去分化所定义的LMS的分子亚型,然后决定获得的次级突变的总体负担(跨所有变异类别)--其中去分化最严重的肿瘤和妇科LMS的负担最高。一旦临床诊断出癌症,我们的数据表明,许多病人已经有另一个肿瘤并行生长。再一次,人们看到lms的种子建立得更早??在lms中,致死性转移性疾病可在临床诊断前30年出现,与其他成人癌症一致。38。原发复发发散的确切时间需要在包含所有分子亚型和解剖位点的较大的LMS队列中验证。

随着它的分子定义背景的建立,额外的遗传事件被层叠在LMS肿瘤基因组之上。早期突变TP 53似乎在LMS中几乎是通用的。Lms创始人克隆的特征还包括手臂水平或全染色体LOH事件,其中最常见的是Rb1TP 53基因。其他特定病人的改变也会提前出现,包括ATRX缺失和Wnt/β-catenin改变。从那时起,中晚期事件占了LMS突变的大多数,导致了肿瘤特有的核型不稳定--包括巨大的全基因组复制、kataegis和色性吸虫症。这些事件产生广泛的遗传多样性,表现为单个原发或复发的LMS肿瘤中存在多个亚克隆和克隆群体。

无论分子亚型如何,LMS迫切需要更有效的治疗,尤其是晚期疾病患者。我们证明和验证了简单的替换结合indel标记反映了LMS的HR-缺陷,可以以PARP诱捕器和DNA损伤反应抑制疗法的形式进行治疗。总之,64%的lms中存在HR缺陷信号,低于以前外显子报道的结果。5。此外,我们证明LMS细胞对他拉唑巴利治疗有高度的反应,与其他肉瘤和HR熟练的细胞系相比。在这里,我们使用了更严格的敏感性阈值以前的报告,从而进一步完善了LMS细胞对PARPI的敏感性。5。此外,LMS细胞对DNA损伤剂CHK 1和WEE 1有反应。本研究建议应考虑对LMS患者进行全面的HR谱分析,将突变标记作为治疗的生物标志物。

总之,LMS,任何原发性恶性平滑肌肿瘤的所有标签,至少包括三个不同的实体。我们报告说,DNA损伤反应抑制剂的用途是有希望的,值得进一步探索。最后,LMS的分子进化和时间安排为这些患者的早期干预和风险分层提供了广阔的窗口。


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