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TEM 8标记三阴性乳腺癌新血管生成肿瘤细胞

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发表时间:2021-07-27 10:31作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

增强的新生血管生成,特别是血管生成模拟(VM),有助于三阴性乳腺癌(TNBC)的发展。乳腺肿瘤起始细胞(BTICs)参与了VM的形成,但具体的VM形成的BTIC群体及其调控机制尚不明确。我们发现肿瘤内皮标记物8(TEM 8)在TNBC中大量表达,可作为VM形成的BTIC的标记物。机械地说,TEM 8增加活性RHOC水平,并诱导ROCK 1介导的Smad 5磷酸化,这是促进乳腺癌细胞的干细胞和VM能力所必需的级联。雌激素受体ERα反式激活E3连接酶ASB 10泛素化降解TEM 8,其在TNBC中的缺失导致TEM 8的高稳态水平。在本研究中,我们将TEM 8作为TNBC中VM形成BTIC的功能标记物,为同时针对BTIC自我更新和新生的TNBC开发有效的治疗方法提供了一个靶点。

导言

乳腺癌是女性最常见的癌症。大约10-20%的BC患者雌激素受体(ER)、孕酮受体和HER 2受体阴性。这种bc被定义为三重阴性乳腺癌(Tnbc),它对常用的激素治疗药物或针对her 2蛋白的药物没有反应。1,2。有效治疗TNBC的选择有限。

恶性实体肿瘤的快速生长需要有效的血管网络来提供足够的氧气和营养。目前,临床抗血管生成的途径主要是抗VEGF/VEGFR途径治疗。3。然而,临床前试验表明,抗血管生成疗法仅是中度有效的,除了与其多向性活动相关的细胞毒副作用外,并不能显著延长无进展生存期或初级环境下的整体生存时间。3,4,5。部分原因是肿瘤血管系统比预期复杂。除血管内皮生长因子通路外,交替的新生血管生成途径通过促进血管生成样网络(Vm)的形成而在肿瘤的进展中发挥重要作用,这种网络通常对传统的抗血管生成药物具有抗药性。6。具有VM能力的BC细胞对原发肿瘤生长和远处转移有促进作用。7。标准化疗后残留的肿瘤细胞常在TNBC内容易形成VM通道,导致肿瘤治疗后复发。8。目前,肿瘤起始细胞(Tics)的存在不仅被认为是治疗失败的原因,也是肿瘤复发和转移的基础。9。抽动系统的可塑性也是VM的原因之一。10,11。乳腺肿瘤起始细胞(BTIC)具有高度异质性。12,13。ALDH+BTIC比ALDH具有更大的VM容量。-体外细胞14。尽管形成VM的抽搐对于BC的发展、进展和复发至关重要,但具体的VM形成的BTIC群体和潜在的调节机制仍未明确。

肿瘤内皮标记物8(Tem 8)是一种高度保守的整合素样糖蛋白,最初被认为是一种肿瘤内皮标记物,其在人类恶性肿瘤组织血管中的主要表达。15,16。TEM家族成员中,TEM 8在肿瘤血管中优先表达,在正常血管中未检测到。击倒TEM 8基因不影响小鼠的正常发育和生理血管生成,但对多种肿瘤类型的病理血管生成和异种移植瘤生长均有明显的影响。17,18。这凸显了TEM 8作为抗肿瘤血管生成靶点的潜力。虽然TEM 8在乳腺肿瘤细胞中的丢失抑制了小鼠异种移植瘤的生长和转移19,20对于TEM 8在乳腺肿瘤相关的新生血管发生中的作用,尤其是VM的作用,知之甚少。在这里,我们报告了TEM 8介导的调节VM形成的BTIC的分子基础及其对TNBC中新生血管生成和肿瘤发生的贡献。此外,我们还提出了一种调控TEM 8蛋白平衡的机制。

结果

TEM 8促进TNBC细胞血管生成的模拟

新血管发生在TNBC的发展中起着关键的作用,但在公元前还没有得到广泛的研究。在此,我们通过分析来自TNBC患者和相应的癌旁(癌旁)组织的7个肿瘤组织的基因图谱,确定了与BC新生血管发生相关的基因,这些组织与两个血管生成基因簇重叠。两个基因共同被上调。1A,补充图。1A,b)。我们把注意力集中在基因上TEM 8,主要在肿瘤内皮细胞中表达。15.

图1:TEM 8促进TNBC细胞的血管生成模拟。
figure1

aTNBC肿瘤(肿瘤与癌旁>2倍)和两个血管生成基因簇中上调基因的重叠分析。bBC、癌旁及肿瘤组织中TEM 8表达的免疫组织化学分析。有代表性的图像(左)和图H评分(右,平均±SEM)。黑箭头显示TEM 8高表达细胞。刻度棒,20μm。ce临床BC组织肿瘤相关新生卫星分析。有代表性的图片显示在(c)。MVD的量化(d)和VMD(e)在不同的亚型中。该图显示了50个独立生物样品的平均±扫描电镜。刻度棒,20μm。f将所有肿瘤样本分成(c)根据TEM 8的表达式b),MVD和VMD被量化。该图显示了50个独立生物样品的平均±扫描电镜。TEM 8低层,低表达的TEM 8肿瘤(H得分<150);TEM 8,高表达的TEM 8肿瘤(H得分≥150)。gTEM 8的肿瘤相关新基因分析和TEM 8低层PDX 11细胞源性肿瘤(每组5只NOD/SCID小鼠,10只)5细胞/地点)。MVD和VMD定量(平均±SEM)。hCD 31图像+内皮血管与CD 31-TEM 8+TNBC患者肿瘤组织中的非内皮血管。红箭头,CD 31+血管.白色箭头,CD 31-TEM 8+船只。刻度棒,75μm。iTEM 8-过表达SUM 149和MDA-MB-231细胞体外试管形成分析。该图显示了三个独立的生物实验的平均值±扫描电镜。标尺,100μm。jEphA 2表达、葡聚糖渗漏、NG2的图像及比较+高表达mda-mb-231(mda-mb-231-temm 8)或对照组(mda-mb-231-ctrl)细胞源性肿瘤(每组5只裸鼠,每组10只)的周细胞密度和非内皮血管密度6细胞/地点)。数据为平均值±扫描电镜。标尺,100μm。kMda-mB-231-tem 8细胞源性肿瘤的肿瘤相关新卵子分析(每组3只裸鼠,10只)6细胞/地点)。MVD和VMD定量(平均±SEM)。刻度棒,20μm。lTEM 8基因敲除MDA-MB-231的肿瘤相关新基因分析(MDA-MB-231)-shTEM 8)细胞源性肿瘤(每组5只裸鼠,10只)6细胞/地点)。MVD和VMD定量(平均±SEM)。缩放条,20μm.源数据作为源数据文件提供.

由于商品化的TEM 8抗体的效力有限,我们研制了抗TEM 8胞外区的多克隆抗体RB 9075,以探讨其在BC中的作用。该抗体适用于Westernblotting(附图)。2A-d),流式细胞术(附图)。2E),免疫组织化学(IHC,附图)。2G)和免疫荧光(补充图。2H)。RB 9075未能识别人类CMG 2,这是一种与TEM 8高度相似的蛋白质(补充图)。2D,f),证实了其对TEM 8的特异性。对81例BC患者肿瘤组织和18例癌旁组织进行了TEM 8的IHC染色。结果表明,TEM 8在癌旁组织中表达上调,而在癌旁组织中阳性细胞较少。1B)。TEM 8在TNBC中的表达高于在腔内和HER 2中的表达。+亚型(附图)1C)。我们进一步探讨了TEM 8水平与临床特征的关系。TEM 8的表达与ER状态呈负相关(P < 0.001), PR status (P < 0.001), and tumor histological grade (P < 0.05) (Supplementary Table 1)。对BC细胞株的分析表明TEM 8在TNBC(附图)中高表达。2A)。TEM 8高表达的TNBC患者无复发生存能力差(附图)。1D)。以上结果表明,TEM 8在BC细胞,尤其是TNBC细胞中表达上调,可能在调节BC恶性进程中起重要作用。

TEM 8在肿瘤相关内皮细胞和肿瘤进展中起着重要作用。18。然而,人们对其在BC细胞,尤其是TNBC细胞中的新生血管生成功能知之甚少。为了评估TEM 8的作用,我们首先分析了TEM 8与乳腺肿瘤相关新生血管密度的相关性。用CD 31和周期酸-希夫(PAS)染色法鉴别血管内皮细胞(CD 31)。+)来自肿瘤细胞衍生的VM(CD 31)。-帕斯+)7。结果显示,肿瘤血管密度,尤其是VM密度(VMD),管腔BC最低,TNBC最高(图1)。1C-E肿瘤大小与VMD无明显相关性。1E)。TEM 8BCS比TEM 8具有更高的微血管密度(MVD)和VMD。低层BCS在BC患者肿瘤和TNBC患者来源的异种移植(PDX)肿瘤(图)。1F,g)。异链菌素B4对血管的染色能监测CD 31之间的转换+内皮血管与CD 31-TEM 8+TNBC患者肿瘤中的非内皮血管(图)。)。TNBC肿瘤细胞产生的血管表达较高水平的TEM 8(如图所示)。1B、黑箭头)。MDA-MB-231MDA-MB-231细胞具有较强的肺转移能力,其TEM 8表达也较高。3A)。与在BC样品中得到的结果一致,TEM 8MDA-MB-231细胞经荧光活化细胞分选(FACS)分离,并经qRT-PCR(补充图)证实.3B,c),在体外表现出较强的VM能力(附图)。1F)和增强肿瘤的体内生长能力(补充图。3D,e表明TEM 8与乳腺肿瘤新生血管发生,尤其是肿瘤细胞VM能力呈正相关。

为验证TEM 8在调节肿瘤细胞VM中的作用,建立了稳定的TEM 8高表达和TEM 8基因敲除TNBC细胞株(附图)。2B,c)。TEM 8的过表达促进了乳腺肿瘤的生长和转移(附图)。3F-h),而TEM 8基因敲除则有相反的效果(补充图1)。3i-k),如先前报告所述20。体外试管形成实验结果一致显示,TEM 8高表达细胞中毛细血管样结构明显增加(图1)。1I)。TEM 8和VM标记物EphA 2和VE-cadherin在TNBC患者和细胞系中均呈显著正相关(附图)。1g,h)。异种移植实验证实了TEM 8过表达对EphA 2表达、右旋糖酐渗漏、周细胞密度和肿瘤血管密度的影响。1J,k),而TEM 8基因敲除可降低肿瘤血管密度(如图所示)。1L)。结果表明,TEM 8对乳腺肿瘤细胞的VM有促进作用。

高表达TEM 8的BTIC增强了VM的形成能力。

肿瘤细胞的vm形成能力与干细胞样特性密切相关。21。根据我们的结果,TEM 8在ALDH中优先表达。+BTIC和TEM 8的表达与5个ALDH家族成员(ALD-H1A1/1A2/1A3/1b1/2)呈正相关(附图)。4A-C),它们是BC中的干细胞标记物,与TNBC的ALDH酶活性有关。13,22,23,我们检测了TEM 8在ALDH中的表达。+BTIC。结果表明,TEM 8 mRNA和蛋白在ALDH中均表达上调。+BTIC(图1.2A,b)。TEM 8击倒明显降低了ALDH。+BTIC种群(图1.2C)和干细胞因子的表达(附图)。4D在TEM 8-高表达细胞(图5)中,表达量显著增加。二维空间, S4E)。在异种移植瘤中观察到类似的结果(附图)。4F,g)。其次,我们评估了不同表达水平的TEM 8的TNBC细胞的离体自我更新能力,发现TEM 8基因敲除细胞对哺乳动物层的形成效率有明显的抑制作用。2E,f)和TEM 8低层细胞(图1.2I),但在TEM 8-高表达细胞中显著增加(图1)。2G,h)和TEM 8细胞(图1.2I)。提示TNBC细胞体外自我更新能力与TEM 8表达呈正相关。

图2:高表达TEM 8的BTIC增强了VM形成能力.
figure2

a, bMRNA(a)和蛋白质(b)TEM 8在FACS分类ALDH中的表达+和ALDH细胞。该图显示了三个独立的生物实验的平均值±扫描电镜。c, dALDEFLUOR法检测TEM 8基因敲除细胞的ALDH活性c)和TEM 8-过表达细胞(d)。该图显示了三个独立的生物实验的平均值±扫描电镜。e, f由初级大气层形成决定的自我更新能力(e, n=6个生物独立实验)和次级哺乳动物层形成(f, n=4个SUM 159和n=5表示MDA-MB-231)在TEM 8-敲除细胞中。图为平均±扫描电镜。标尺,200μm。g, h由初级大气层形成决定的自我更新能力(g, n=6个生物独立实验)和次级哺乳动物层形成(h, n=4项独立的生物学实验(TEM 8-高表达细胞)。图为平均±扫描电镜。标尺,200μm。i由FACS分类的mda-mb-231的乳球层形成所决定的自我更新能力细胞。该图显示了三个独立的生物实验的平均值±扫描电镜。标尺,200μm。jTEM 8和TEM 8低层Nod/SCID小鼠乳腺脂肪垫经有限稀释法接种TNBC PDX 11细胞。根据每组阳性肿瘤部位计算TIC频率。kFACS分离的MAD-MB-231体外试管形成分析TEM 8表达水平和ALDH活性不同的细胞。该图显示了三个独立的生物实验的平均值±扫描电镜。标尺,100μm。lp细胞组从TNBC PDX 15中分离,经有限稀释法植入NOD/SCID小鼠乳腺脂肪垫。肿瘤生长曲线(10000个/点)l)和肿瘤图像(m)显示。根据每组阳性肿瘤部位计算TiC频率(n)。用ALDEFLUOR法测定肿瘤细胞ALDH活性,并绘制棒状图(平均±SEM)。o)。肿瘤血管生成模拟染色,显示VMD的条状图(平均±SEM)。p)。源数据作为源数据文件提供。

为了进一步检查肿瘤的起始能力,TEM 8。和TEM 8低层从TNBC PDX中分离出细胞,以有限稀释法将其植入非肥胖糖尿病(NOD)/严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠第4乳腺脂肪垫中。TIC的频率和以前一样确定。24。TEM 8细胞形成的肿瘤(1/8305 TIC频率)比TEM 8更有效。低层细胞(1/69592 TIC频率)(如图所示)。2J),肿瘤生长能力明显增强(附图)。4H)和ALDH的富集+BTIC(附图)4I).

根据TEM 8和ALDH的水平将BC细胞分为四组,有趣的是,只有TEM 8。ALDH+BTIC具有显著的VM容量(图1)。2K)。因此,我们推测TEM 8的高表达是VM形成的指标之一。为了验证这一假设,TEM 8低层ALDH、TEM 8低层ALDH+、TEM 8ALDH,以及TEM 8ALDH+肿瘤细胞从另一株TNBC PDX中分离出来,以有限稀释法移植到NOD/SCID小鼠体内。TEM 8ALDH+细胞表现出最强的肿瘤生长能力(图)。2L,m)和最高的TIC频率(如图所示)。2N)。ALDH+BTIC种群在TEM 8中进一步丰富。ALDH+细胞源性肿瘤(图)。)。肿瘤血管染色显示两者均为TEM 8。ALDH组与TEM 8低层ALDH+组肿瘤Vm密度增加。然而,肿瘤VM密度明显高于TEM 8。ALDH+组(图1.2p)。在TEM 8中也观察到了类似的结果。ALDH+MDA-MB-231异种移植实验(附图)。4J-n)。这些结果表明,TEM 8ALDH+TNBC细胞在同时具有较强的肿瘤发生和新生血管发生能力的BTIC中富集。

TEM 8通过招募GNAS提高活跃的RHOC水平

为确定TEM 8对VM的促进作用是否通过配体结合介导,将细胞内结构域截断或胞外结构域缺失(均为保留的跨膜区)稳定转染到MDA-MB-231细胞中。结果表明,胞内结构域的缺失逆转了VM的增加。5A)和哺乳动物层的形成(补充图。5B)由全长TEM 8蛋白诱导。另一方面,胞外结构域的缺失不影响TEM 8的茎样性质和VM形成能力(附图8)。5C,d表明TEM 8的促进VM功能与细胞内结构域有关。

鉴于TEM 8的促进VM功能依赖于其胞内结构域,通过共沉淀(co-IP)/质谱分析(见图)探讨了其机制。3A,b)。先前报道的TEM 8相互作用蛋白未在TNBC细胞中检测到(补充表)。2)。因此,我们重点研究了一种名为RAS同系物家族成员C(RHOC)的小GTPase,它调节癌症的干细胞。25,26,27用银染法检测出20 kDa的条带。TEM 8与RHOC之间的直接相互作用通过共同IP实验得到证实。3C),特别是在体外协同IP试验(图1)。三维空间)。由于Rho蛋白的活性依赖于活性GTP结合状态和不活跃的GDP结合状态之间的转换来传递信号,所以我们证明TEM 8结合增加了活性GTP结合RHOC的水平。TEM 8胞内结构域的缺失始终不能增加活性RHOC(图1)。3E细胞外结构域的缺失对活性RHOC没有影响。5E),进一步支持我们上述结论。TEM 8对VM增加的影响(图1)。3F)和哺乳动物层的形成(图。第三代)被RHOC基因敲除逆转,支持RHOC在介导TEM 8恶性功能中的关键作用。

图3:TEM 8通过招募GNAS提高了活跃的RHOC水平。
figure3

aMDA-MB-231-TEM8细胞共ip后银染的典型图像。红色箭头,带90 kd;蓝箭头带20 kd。b质谱分析表明,共IP样品(TEM 8-过表达和ctrl)可能与TEM 8相互作用。c共ip法分析TEM 8与RHOC在MDA-MB-231细胞中的相互作用.d体外协同IP法分析TEM 8与RHOC的相互作用。e将全长TEM 8蛋白(FL)和胞内结构域缺失截短(ΔICD)稳定转染MDA-MB-231细胞。活性RHOC用RhoGTPase活性测定,定量为总RHOC。f, g将RHOC/置乱的shRNA转染MDA-MB-231-TEM8细胞。管状(f)和哺乳动物层形成能力(g)测定。该图显示了三个独立的生物实验的平均值±扫描电镜。h表达GNAS在正常乳腺癌和乳腺癌中基于TCGA数据库。图为平均±扫描电镜。i, jGNAS/置乱的shRNA(i)或过度表达(j)转染293 T-TEM8细胞。然后测定活性RHOC并将其定量为总RHOC。k免疫荧光染色分析TEM 8、GNAS和RHOC在SUM 159细胞中的分布。标尺,10μm。l体外协同IP法分析TEM 8与GNAS的相互作用。m体外协同IP分析RHOC与GNAS的相互作用.n将全长GNAS蛋白(FL)和GTP结合位点(aa 357~374)-缺失截短(ΔGTP)转染2 93 T细胞。用共IP法分析GNAS与RHOC的相互作用.o将ARHGAP 21和GNAS转染293 T细胞。然后测定活性RHOC并将其定量为总RHOC。p共转染293个T细胞,共转染全长RHOC蛋白(FL)和间隙结合位点(a34-39)缺失截短(ΔGAP)。用协IP法分析GNAS与RHOC的相互作用.源数据作为源数据文件提供。

TEM 8蛋白结构域分析表明,TEM 8不能直接激活GTPase。然而,我们注意到潜在的TEM 8相互作用蛋白鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(S)亚基α亚基α亚型短链(GNAS)在TNBC中也有高表达。3H)并能显著影响RHOC活性。GNAS基因敲除可逆转TEM 8诱导的活性RHOC增加(图1)。3I和补充图。6B),而GNAS过表达则进一步增强了RHOC的活化。3J和补充图。6d)。TEM 8、RHOC和GNAS在TNBC细胞中共定位。3K)。TEM 8与GNAS的直接相互作用在体外协同IP系统中得到证实。3L),以及RHOC与GNAS之间的直接相互作用。三米)。TEM 8的存在增强了RHOC与GNAS(附图)之间的相互作用。6E)。此外,我们发现GNAS通过其GTP结合位点与活跃的RHOC结合,并增加了活性RHOC的水平。3n和补充图。6f)。Rhogap家族蛋白arhgap 21催化活性gtp-rhoc转化为非活性gdp-rhoc。28。我们发现GNAS过表达可以逆转ARHGAP 21引起的RHOC失活。3O)。此外,当RHOC的ARHGAP 21结合位点被删除时,GNAS无法与RHOC蛋白相互作用。3P和补充图。6g)。这些结果表明,GNAS通过其GTP结合位点与RHOC结合位点结合,从而阻止RHOC与ARHGAP 21的典型相互作用,从而导致RHOC信号的激活。

RHOC/ROCK 1/Smad 5信号通路介导TEM 8诱导的VM

Rho蛋白与rho相关蛋白激酶(Rok 1)相互作用并激活。29。尽管ROCK 1协调了多个细胞功能,但它在bc,特别是btic中的作用还没有得到详细的探讨。30。因此,我们研究ROCK 1是否参与TEM 8诱导的TNBC进展。首先,我们证实了RHOC与ROCK 1之间的相互作用(图1)。4A)。ROCK 1特异性抑制剂(ROCK1i)Y-27632或shRNA转染对ROCK 1的抑制作用逆转了TEM 8对肿瘤细胞VM的影响。4B,c),提示ROCK 1参与了TEM 8的功能。

图4:RHOC/ROCK 1/Smad 5信号通路介导TEM 8诱导的VM。
figure4

a共ip分析了RHOC与ROCK 1在MDA-MB-231细胞中的相互作用.b, cROCK 1抑制剂Y-27632在1μM浓度下对ROCK 1的抑制作用24 h(b)或转染ROCK 1/置乱的shRNA(c)转化为MDA-MB-231细胞。在此基础上,确定了Vasculogenimicry的形成。该图显示了三个独立的生物实验的平均值±扫描电镜。dWESTERNBLOTTING法检测MDA-MB-231-TEM8细胞中SMAD蛋白的表达。e, f转染RHOC/杂合shRNA的MDA-MB-231-TEM8细胞中Smad 5蛋白的表达e)或用Y-27632在1μM浓度下处理24 h(f)采用Westernblotting分析。g体外磷酸化实验分析了ROCK 1激酶结构域与Smad 5蛋白的激酶-底物相互作用。h, i将Smad 5/杂乱的shRNA转染MDA-MB-231-TEM8细胞。Vasculogenimicry(h)和哺乳动物层(i)形成。该图显示了三个独立的生物实验的平均值±扫描电镜。jl在乳腺脂肪垫内注射mda-mb-231-tem 8细胞(每组3只裸鼠,10只)。6细胞/地点)。肿瘤生长曲线显示:j)。用ALDEFLUOR法测定肿瘤细胞ALDH活性,并绘制棒状图(平均±SEM)。k)。肿瘤血管模拟染色,条状图(平均±扫描电镜)。l)。源数据作为源数据文件提供。

为了鉴定TEM 8诱导的ROCK 1的主要下游效应,在TEM 8过表达细胞中使用磷酸激酶阵列来识别多个下游信号的改变,并用Westernblotting证实了这一结果。TEM 8的过表达并不导致Wnt通路的激活(补充图)。7A-c),而它导致了Smad 5通路的激活(如图所示)。4D,补充图。7D,e)。虽然研究表明Rho/Rock通路是激活MCF10CA1h细胞Smad 2/3所必需的。31在TEM 8-高表达的TNBC细胞株中,除Smad 5外,未观察到SMAD蛋白的激活。我们推测TEM 8激活的RHOC/ROCK 1通路可能激活Smad 5,这与肿瘤细胞的干细胞和肿瘤血管生成有关。32,33,34。为了验证这一作用,TEM 8过表达细胞用RHOC shRNA或ROCK1i处理。两个RHOC击倒(图。4E)和ROCK1i(图1。4F)阻断Smad 5的激活。为了证实ROCK 1对激活Smad 5的作用,用纯化的ROCK 1进行了体外磷酸化实验。激酶蛋白质和Smad 5蛋白。结果表明,Smad 5在Ser463/465上被ROCK 1直接磷酸化。激酶(无花果)4G)。提示TEM 8诱导的Smad 5激活是由RHOC/ROCK 1通路直接介导的。

为探讨Smad 5对TEM 8细胞功能的影响,将Smad 5基因敲除在TEM 8高表达细胞中。体外实验结果表明,Smad 5基因敲除可逆转TEM 8诱导的VM。4H)和哺乳动物层的形成(图。4I)。体内异种移植实验也显示,Smad 5基因敲除抑制了TEM 8促进肿瘤的生长。4J),以及BTIC的富集(图1.4K),以及肿瘤VM密度的增加(如图所示)。4L)。这些结果表明,TEM 8激活的Smad 5在促进BTIC的富集和肿瘤VM的形成中起着重要的作用。

ROCK1i抑制TEM 8对VM和肿瘤发生的影响

其次,我们评价了用ROCK 1抑制剂Y-27632阻断TEM 8/RHOC/ROCK 1/Smad 5通路的疗效。将TIM 8-高表达MDA-MB-231细胞植入免疫缺陷小鼠乳腺脂肪垫中,经Y-27632处理.结果表明,Y-27632对TEM 8促进体内肿瘤生长有明显抑制作用(如图8所示)。5A和b),以及BTIC的浓缩。5C)和肿瘤VM密度(如图所示)。5D)。考虑到化疗可能引发TIC富集和肿瘤血管异常,导致耐药。35,36TEM 8阻断剂联合化疗可作为TNBC的治疗策略。因此,我们利用高表达TEM 8的TNBC PDX来评价Y-27632联合多西他赛治疗的疗效。Y-27632单独治疗可抑制异种移植瘤的生长,增强多西紫杉醇治疗的抑制作用。5E)。Y-27632联合多西紫杉醇不仅显示肿瘤VM密度显著降低(图1).5F),但诱发继发性肿瘤的能力也显著下降(图一)。5G)。这些结果表明,ROCK 1的抑制能明显抑制TEM 8表达的TNBC在体内的肿瘤发生和新生血管生成,ROCK 1抑制与化疗联合应用可获得较好的治疗效果。

图5:ROCK1i抑制TEM 8对VM和肿瘤发生的影响。
figure5

adY-27632(10 mg/kg,每周腹腔注射)对裸鼠肿瘤生长的影响(每组3只,每只小鼠2个部位,2×10)。6细胞/地点)。肿瘤生长曲线(a)和肿瘤的典型图像(b)显示。治疗时间点用黑色箭头表示。用ALDEFLUOR法测定肿瘤细胞ALDH活性,并绘制棒状图(平均±SEM)。c)。肿瘤血管模拟染色,条状图(平均±扫描电镜)。d). e, fY-27632(10 mg/kg,每3天一次)联合多西紫杉醇(10 mg/kg,每3天)对NOD/SCID小鼠(每组6只,每只小鼠2只,10只)肿瘤生长的影响5细胞/地点)。肿瘤生长曲线显示:e)。治疗时间点用黑色箭头表示。肿瘤血管模拟染色,条状图(平均±扫描电镜)。f). g肿瘤细胞(H2kd))从Y-27632和(或)多西紫杉醇处理的PDX 15肿瘤中分离到Nod/SCID小鼠乳腺脂肪垫有限稀释法(每组3只,每只小鼠2处,100或1000个细胞/位点)。干细胞频率和p根据阳性肿瘤部位计算值。源数据作为源数据文件提供。

ERα反式激活ASB 10对TEM 8的泛素化作用

虽然TEM 8蛋白在TNBC中的表达显著高于其他BC亚型,但TEM 8 mRNA的表达在TNBC中并不高于其他BC亚型。6A)。此外,TEM 8的高表达预测只有ER阴性患者的临床结果较差(如图所示)。6B)。推测TEM 8在BC亚型中的mRNA和蛋白表达差异可能源于翻译后修饰。蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)对BC细胞的作用导致TEM 8蛋白的快速降解(附图)。8A)。此外,在蛋白酶体抑制剂MG 132处理的BC细胞中,TEM 8明显积累。8B)。泛素化实验结果表明TEM 8在BC细胞中具有泛素化作用(附图)。8C),暗示TEM 8蛋白受泛素-蛋白酶体系统的调控。

图6:ERα反式激活的ASB 10使TEM 8泛素化。
figure6

a对…的表达方式的分析TEM 8基于TCGA数据库的BC的不同亚型。数据为平均值±扫描电镜。b基于TEM 8表达的ER-pos/neg和PR-pos/neg BC患者(GSE 22133)的整体生存分析。基于TEM 8表达的ER-pos/neg BC患者无复发生存分析。在TEM 8表达中位分组。c酵母双杂交系统筛选E3连接酶可能与TEM 8相互作用。df将ASB 10/杂乱的shRNA或过表达(HA标记)稳定转染MDA-MB-231-TEM8细胞。TEM 8蛋白降解(d)和泛素化(e, f)采用Westernblotting法测定。g, h将ASB 10/杂乱的shRNA稳定转染MDA-MB-231-TEM8细胞。细胞入侵(g)和血管生成模拟形成(h)然后进行分析。该图显示了三个独立的生物实验的平均值±扫描电镜。i临床BC组织ASB 10蛋白表达的免疫组化分析(英文)n=67)。具有代表性的图像与圆点情节H评分(平均±SEM)。标尺,100μm。j临床BC组织ER、α和ASB 10的双重免疫荧光染色(BC 106)。标尺,50μm。k, lMRNA(k)和蛋白质(lASB 10在293 T-ERα细胞中的表达。该图显示了三个独立的生物实验的平均值±扫描电镜。m芯片-qPCR分析了2 93 T细胞中ERα与ASB 10启动子区的结合能力。该图显示了三个独立的生物实验的平均值±扫描电镜。n双荧光素酶报告法分析ERα在293 T细胞中与ASB 10启动子区的结合能力。该图显示了三个独立的生物实验的平均值±扫描电镜。源数据作为源数据文件提供。

为了阐明TEM 8稳定性的调控机制,采用酵母双杂交系统筛选E3连接酶。鉴定出6种潜在的E3连接酶。6C)。将已鉴定的E3连接酶的shRNAs转染MDA-MB-231-TEM8细胞,结果表明,Kankyrin重复序列和SOCS盒蛋白10(ASB 10)基因敲除对TEM 8的降解有明显的抑制作用(图10)。6d),而ASB 10过度表达则显著加速了这一过程(补充图)。8E)。泛素化实验结果表明,ASB 10基因敲除降低了TEM 8的泛素化水平。6E),而ASB 10的过度表达则增加了它的表达(如图所示)。6f)。此外,ASB 10基因敲除增强了TEM 8对细胞侵袭的作用。6g)和VM的形成(图1.六小时)。总的来说,这些数据支持ASB 10在TEM 8蛋白稳定性和细胞功能中的负调节作用。

对BC患者组织中ASB 10表达的评估表明,ASB 10在乳腺腔内肿瘤组织中表达最高,在HER 2中最低或缺失。+或TNBC乳腺肿瘤组织。6I,补充图。8F,g)。ASB 10在BC细胞中的表达与IHC结果一致(附图)。8H)。TCGA分析显示,ASB 10 mRNA在腔内BCS中表达较高,但差异无统计学意义,这可能是由于样本数据不足(附图)所致。8I)。ASB 10与激素受体共染色的结果表明,大多数ASB 10与激素受体共染色。+细胞位于ERα内+肿瘤细胞区6J, S8j,k),提示ASB 10与ERα呈正相关。

在ASB 10启动子区有两个预测的ERα结合位点(附图)。8L),推测ERα可能通过转录调控ASB 10的表达。为了支持这一假说,我们首先对ERα过表达肿瘤细胞中的ASB 10的表达进行了检测,结果表明ERα过表达在肿瘤细胞中均显著上调ASB 10的表达(如图1所示)。6K)和蛋白质水平(如图所示)。6L)。芯片-qPCR检测证实了ERα与ASB 10启动子序列的结合。6米)。然后将启动子区序列插入荧光素酶报告载体,进行双荧光素酶报告试验。ERα共转染可显著增强荧光强度。6N缺失结合位点的ERα转染可降低荧光强度(补充图)。8m)。此外,ASB 10在ERα中被击倒。+McF-7细胞显著上调TEM 8蛋白(附图)。8N)。这些结果表明ERα与ASB 10启动子区结合,激活了ASB 10的转录,为TNBC中TEM 8蛋白高水平和TEM 8相关VM丰富现象提供了合理的解释。

讨论

TEM 8在胚胎发育过程中与血管生长相关,在多种肿瘤类型的血管中增加。15,18,37。TEM 8在乳腺肿瘤中广泛表达,TEM 8在癌旁基质中高表达。38,39。在这里,我们发现TEM 8在TNBC细胞中过表达,但在间质细胞中没有表达,尤其是TEM 8在一部分BTIC中高表达,这可能使它们具有更强的致瘤特性和VM能力。

以前的研究表明TEM 8与肿瘤血管生成有关。20。在此,我们对TEM 8在肿瘤相关的新血管生成中的作用提供了更深入的理解。我们发现高表达TEM 8的乳腺肿瘤有较高的肿瘤微血管密度和更高的VM密度,提示TEM 8在TNBC中调节VM的作用。VM在肿瘤恶性中起着至关重要的作用,反映了侵袭性肿瘤细胞的可塑性。7,40。在包括bc在内的多种肿瘤类型中,tics的可塑性与vm容量有关。6。在先前的一项研究中,tem 8与bc干细胞表型相关。19。我们的研究确定了TEM 8在BTIC中的作用,因为只有高表达TEM 8的BTIC才能增强VM的容量。这些发现提示TNBC中的BTIC在TEM 8表达的基础上进一步分层,高表达TIM 8的VM形成的BTIC可能是TNBC治疗的有效靶点。

有几种蛋白可以与TEM 8结合和调节,如胶原α3(VI)的C5结构域(COL6A3)、LDL受体相关蛋白LRP 6和尿激酶型纤溶酶原激活物(Upa)。41,42,43。我们发现UPA或COL6A3的刺激对TNBC细胞的TEM 8下游RHOC/Smad 5通路没有明显的激活作用(附图)。5F和g)。TEM 8对VM的促进作用可能不受已知配体的强烈影响。我们的结果显示,TEM 8通过招募GNAS增强了RHOC信号。Rho GTPase活性形式和非活性形式之间的平衡一般由鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)和GTPase激活蛋白(GAP)以及Rho GDP解离抑制剂(RhoGDI)调控。TEM 8和GNAS均未直接激活RHOC,提示RHOC存在非典型激活途径,GNAS与RHOC的GAP结合位点结合,从而阻止RHOC与RhoGAP、ARHGAP 21的相互作用,从而导致RHOC信号的激活增加。类似的非典型rho gtp酶激活途径以前也有报道过。44.

RHOC/ROCK通路调控肿瘤血管生成45。在此,我们发现Smad 5是ROCK 1激酶的直接靶点。RHOC/ROCK 1/Smad 5轴对TEM 8诱导的TNBC VM能力起作用。ROCK 1抑制剂Y-27632对此通路的抑制作用抑制了BTIC的富集和VM的形成,对肿瘤的生长有明显的抑制作用。与我们的观察一致,其他rho激酶抑制剂如法舒地尔也被证明会干扰vm的形成。46。综上所述,本结果提示靶向ROCK 1是治疗TNBC新生血管生成药物的一种选择。ROCK 1抑制剂联合化疗可提高疗效。

以前的研究已经描述了TEM 8蛋白的修饰。TEM 8被棕榈化,以防止与Cbl的结合,而Cbl又在PA结合过程中调控TEM 8的泛素化,从而控制HeLa细胞炭疽毒素的内吞作用。47。在这里,我们确定ASB 10是负责TEM 8泛素化的蛋白。对ASB 10在肿瘤中的作用知之甚少。我们报道了ASB 10作为E3连接酶在BC中调节TEM 8蛋白稳定性的作用,发现ASB 10被ERα激活,这至少部分解释了ASB 10和TEM 8在不同BC亚型中的相反表达模式。

总之,我们的研究表明,TEM 8在TNBC中标记了一群新生成的BTIC,它们在VM形成中起着至关重要的作用,为TNBC提供了一种潜在的治疗策略。我们阐明了ERα-反式激活的ASB 10调节TEM 8蛋白稳定性的潜在机制。因此,以TEM 8蛋白降解为靶点的PROTAC技术可能成为TNBC肿瘤血管和药物双重靶点的治疗方法。提示TEM 8及其下游效应是抑制TNBC肿瘤发生和新生血管发生的有效靶点。


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