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PDE3A-SLFN 12复合物的结构揭示了激活SLFN 12 RNase的要求

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发表时间:2021-07-22 15:30作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

二磷酸二酯酶PDE3A与SLFN 12蛋白形成复合物后,DNMDP及相关化合物即天鹅绒蛋白(Velcrin)在癌细胞中产生细胞毒性反应,表达这两种蛋白的水平升高。丝蛋白诱导复合物形成的机制,以及PDE3A-SLFN 12复合物是如何引起癌细胞死亡的,尚不完全清楚。在此,我们发现PDE3A和SLFN 12通过与DNMDP结合而形成一种稳定的异质四聚体。SLFN 12的C端α螺旋与PDE3A活性位点附近残基之间的相互作用是复杂形成的必要条件,并通过SLFN 12与DNMDP的相互作用进一步稳定。此外,我们证明SLFN 12是一个RNase,PDE3A结合增加SLFN 12 RNase活性,SLFN 12 RNase活性是DNMDP反应所必需的。这一新的机械理解将促进天鹅绒蛋白化合物的发展成为新的癌症疗法。

导言

最近有报道说,一类小分子通过诱导两种细胞蛋白PDE3A和SLFN 12之间的复杂形成而导致选择性的癌细胞杀伤。1,2,3。这些小分子以典型的PDE3A-slfn 12复合诱导剂dnmdp为例。1,尽管其他类别的PDE3A-SLFN 12复合诱导剂随后被描述为类似的,尽管较弱的活性。4,5,6,7。表达PDE3A和SLFN 12水平升高的癌细胞通常对DNMDP和其他PDE3A-SLFN 12复合诱导剂的杀伤敏感。

摘要PDE3A是一种特征良好的环核苷酸磷酸二酯酶(PDE),它能水解cAMP、cGMP和cump。8,9。DNMDP是一种PDE3A抑制剂,其催化结构域足以支持对DNMDP的反应。1,3。然而,DNMDP对癌细胞的杀伤活性与抑制PDE3A酶活性无关,因为其他有选择性的pd3抑制剂如trequinsin。10不要杀死癌细胞,从敏感细胞株中敲除PDE3A可以消除DNMDP的敏感性。1,3。相反,DNMDP对PDE3A有增益或功能改变的影响,包括诱导与SLFN 12复合形成。

与PDE3A不同的是,对于SLFN 12的正常生理功能,除了其在T细胞中的表达外,对于异位表达与分化和/或静止的关系知之甚少。11,12,13,14。大多数人类Schlafen基因,包括SLFN 5, SLFN 11, SLFN 13,和SLFN 14,明显长于SLFN 12编码一个C端螺旋酶结构域和一个核定位信号,SLFN 12以及相关的SLFN12L不编码15。6个人slfn基因有一个半保守的SWADL基序。16,以及一个可以作为rna结合域的发散的aaa ATPase结构域。17.

我们采用多种正交方法来确定DNMDP类分子如何诱导PDE3A-SLFN 12复合物的形成。我们首先解决了与DNMDP和Trequinsin等几种配体结合的PDE3A催化结构域的晶体结构。该结构被用来描述PDE3A分子内和分子间的变化,用氢-氘交换质谱(HDX-MS)研究了SLFN 12与PDE3A形成复合物时的分子内和分子间的变化。结合DNMDP的PDE3A-SLFN 12配合物的全冷电镜(Cryo-EM)结构揭示了配合物形成的分子细节和DNMDP在稳定配合物中的作用。PDE3A的深入突变扫描(DMS)鉴定了DNMDP反应所需的氨基酸,包括参与化合物结合、PDE3A同聚和SLFN 12结合的残基,证实了结构研究的结果。最后,我们展示了,像其他SLFN家庭成员一样18,19,20SLFN 12是一种RNase,这种RNase活性在PDE3A结合后增加,SLFN 12 RNase活性是DNMDP反应所必需的。

结果

DNMDP诱导PDE3A与SLFN 12复合物的形成

以前的研究表明,DNMDP能诱导PDE3A和SLFN 12在细胞内形成复合物。1。为了确定该复合物是否能用分离的蛋白质进行重组,我们表达并纯化了PDE3A的催化结构域(PDE3A)。),由64-1141个残基和全长SLFN 12组成,并分析了它们在DNMDP缺失和存在时相互作用的能力。我们将我们的分析局限于PDE3A的催化结构域,因为我们以前的实验表明PDE3A的N端部分包含多个膜缔合区。21,不需要DNMDP在细胞中的敏感性。3。重组PDE3A的分析通过对理论质量为57.3kDa的单体的分析,在洗脱体积内发现了单个物种,比预期的要早(图5.7.3 kDa)。1A)。PDE3A的溶液质量用多角度光散射(MALS)作为洗脱蛋白,确定其分子量为118 kDa,表明催化结构域以二聚体的形式存在。1)。PDE3A的二聚得到沉降平衡分析超离心(SE-aUC)数据的支持,符合单体-二聚体平衡。Kd40 NM(图1)。1B)。考虑到PDE3A在催化结构域上含有额外的N端区域,这是为促进齐聚而提出的。21,很可能Kd对于全长PDE3A蛋白的二聚,甚至比在这里观察到的要低。纯化的SLFN 12在低NaCl浓度下呈浓度依赖性聚集,并在500 mm NaCl中进行贮存和分析。SEC的分析显示SLFN 12的洗脱时间比理论质量为67.3kDa的蛋白质要晚得多,这表明SLFN 12与柱树脂之间存在非特异性的相互作用(图1)。1A)。用SEC-MALS法测定了SLFN 12的溶液质量,其质量为126.9 kDa,表明它在微量蛋白质浓度下也以二聚体的形式存在(附图)。1)。然而,SLFN 12的se-aUC分析表明,该二聚体的稳定性明显低于PDE3A。,用数据拟合单体二聚体。Kd870 NM(图1.1C).

图1:DNMDP在纯化的PDE3A和SLFN 12之间诱导复合物的形成。

a在150 mm NaCl中进行复杂地层的SEC分析。10 MPDE3A显示的跟踪(红色)、SLFN 12(绿色)和PDE3A+SLFN 12在不存在(蓝色)和100 MDNMDP(黑色)的情况下。SLFN 12的痕迹必须在500毫米NaCl中收集,因此显示为虚线。bPDE3A的Se-AUC分析cSLFN 12实线表示最适合于单体二聚体模型的Kd指示。d直链淀粉树脂下拉分析复杂形成。从直链淀粉树脂中洗脱蛋白质的SDS-PAGE凝胶6-MBP-SLFN 12单独孵育或与2 MPDE3A孵育±10 mDNMDP或trequinsin在150或500 mm NaCl中。e在500 mm NaCl条件下对复杂地层进行SEC分析。fDNMDP和Trequinsin对BLI复合物形成的影响。100 NM SLFN 12与固定化PDE3A的结合在500 mm NaCl和DMSO(蓝色)存在下,10 MDNMDP(黑色)或10 MTrequinsin(红色)。g用BLI定量分析DNMDP对复杂地层的影响。100 M DNMDP在500 mm NaCl下与SLFN 12结合(开圈)和存在(填充圆圈)。数据从四个独立的实验中分析,并表示为平均值±S.E.M。ABS吸光度,特里克Trequinin。

为探讨PDE3A与SLFN 12的相互作用,采用麦芽糖结合蛋白(MBP)与其N-端融合的SLFN 12进行了拉下实验。将MBP-SLFN 12固定在直链淀粉树脂上,与PDE3A孵育。在无DNMDP存在的情况下,NaCl浓度为150 mm(图1)。1D)。在这些条件下,PDE3A在不含化合物的情况下能与MBP-SLFN 12结合,且在DNMDP存在下,结合量略有增加。相比之下,trequinsin,一种有效的选择性PDE3A/B抑制剂(补充表)1)没有杀死癌细胞的活性1,抑制PDE3A与MBP-SLFN 12的结合。奇怪的是,当实验在500毫米氯化钠中重复时,PDE3A较少。在DNMDP存在的情况下,与MBP-SLFN 12相互作用,显着地增加了复杂的形成(图1)。1D).

用SEC进一步研究PDE3A与SLFN 12复合物的形成及DNMDP的作用。在生理盐浓度(150 MmNaCl)下,这两种蛋白质的协同洗脱时间比任何一种蛋白质都要早,预示着稳定的复合物形成(如图所示)。1A)。在此条件下,DNMDP的加入对复杂地层的形成影响很小。而在500 mm NaCl下,只有在DNMDP存在下,才能稳定地形成早期洗脱络合物。1E)。而PDE3A-SLFN 12在不含DNMDP的条件下,其色谱图与PDE3A和SLFN 12蛋白的部分解离相一致。当用SEC-mals测量时,PDE3A的质量。+SLFN 12配合物在150 mm NaCl下被确定为246.9 kDa,与PDE3A的二聚体一致。与SLFN 12的二聚体相互作用(补充图。1).

为了量化DNMDP对复合物形成的影响,我们固定化了生物素标记的PDE3A。在链霉亲和素生物传感器上,用生物层干涉法测量其与SLFN 12的相互作用(Bli;图1)。1F,g)。这些实验只能在500 mm NaCl中进行,因为SLFN 12在150 mm时与传感器非特异性结合。我们观察到SLFN 12与固定化PDE3A之间有明显的关联。DNMDP的加入提高了SLFN 12与PDE3A的结合率,降低了SLFN 12的解离率。非常缓慢的离解率表明,配合物是高度稳定的时间。如预期的那样,Trequinsin抑制结合。计算稳态Kd在500 mm NaCl条件下,DNMDP存在时的络合形成分别为320和65 nm。1g).

综合来看,这些数据表明,纯化的PDE3ASLFN 12足以形成一个稳定的复合物,由PDE3A的二聚体和SLFN 12的二聚体组成,DNMDP显着地稳定了复合物。在细胞中PDE3A-slfn 12复合物的形成需要辅伴侣芳香烃受体相互作用蛋白(Aip)。3。然而,体外复杂的形成显然不需要AIP。盐浓度对配合物形成的影响表明,静电相互作用在促进络合形成中起着重要作用。

DNMDP和trequinsin对PDE3A结构的影响有限。

DNMDP曾被证明是PDE3A PDE活性的抑制剂,这意味着DNMDP直接与PDE3A结合。1。事实上,融化的温度(Tm(PDE3A)在DNMDP存在的情况下,增加+3°C(补充图)。1),表明DNMDP与PDE3A的结构结合和稳定。。相反,TmSLFN 12与DNMDP(补充图)共同孵育。1)。这表明在没有PDE3A的情况下,SLFN 12不与DNMDP结合,尽管我们不能否认SLFN 12的结合不足以影响结构的稳定性,从而导致SLFN 12熔化温度的变化。

为了深入了解dnmdp是如何与slfn 12形成PDE3A复合物的,以及trequinsin如何抑制这种相互作用,我们解决了PDE3A催化结构域的高分辨率晶体结构。CAT-XTL)在DNMDP或Trequinsin不存在或存在的情况下(如图所示。2A和补充表2)。PDE3ACAT-XTL由残留物669-1095组成,残留物780-800和1029-1067之间有两个内环,取而代之的是较短的连接剂,以帮助结晶和提高晶体的衍射质量(图)。2A)。通过用cAMP浸泡apo晶体,我们还得到了与pdE3A结合的AMP的结构,证明了cAMP的晶体形态。CAT-XTL具有催化活性,与cAMP结晶的PDE4D2相似。22。PDE3A的催化结构域在不对称单元中以二聚体的形式结晶。2A)。其结构与PDE3B的催化结构非常相似。23,其序列同源性为69%,主链原子的均方根偏差(RMSD)为0.53。PDE3A晶体结构基本相同,在活性部位只有少量的蛋白质骨架运动,以适应AMP、DNMDP和trequinsin(补充图)的结合。1).

图2:DNMDP对PDE3A结构的影响有限但是hdx-MS揭示了PDE3A的区域。SLFN 12结合后溶剂暴露减少。
figure2

aPDE3A的晶体结构CAT-XTL绑定到DNMDP。每种单体都是深蓝色和浅蓝色。DNMDP显示在空间填充中,用绿色、红色和蓝色的碳、氧和氮原子来澄清。由链接器代替的两个环路区域由虚线表示。bdPDE3A催化中心CAT-XTL晶体结构。bPDE3ACAT-XTL-AMP;cPDE3ACAT-XTL-DNMDP;dPDE3ACAT-XTL-trequinin显示。侧链以甘草的形式显示,碳原子呈白色。AMP、DNMDP和trequinsin以类似的格式显示,除了用于可视化目的的颜色为绿色的碳。AMP的磷以橙色显示。这两种金属离子和配位水分子分别表示为灰球和红球。氢键和金属-配体相互作用显示为虚线黄线。ePDE3A分析和SLFN 12接口的HDX-MS。D-摄取差异用绿色和蓝色映射到PDE3A上。CAT-XTL300和3000 s的晶体结构。BRD 9500用青色球描绘。

在与AMP结合的结构中,AMP被延伸到催化中心,磷酸基团直接与一端的两种金属离子配位,嘌呤基与Q 1001在另一端形成氢键(如图所示)。2B)。腺嘌呤结构通过与I 968和I 968的疏水接触而进一步稳定。ππ用F 1004堆叠。在与DNMDP结合的结构中,DNMDP与埋在活动部位口袋深处的二氢吡嗪环形成扩展构象(图1)。2C)。这种取向是通过氢键与H 961和Q 1001以及沿DNMDP长度的一系列疏水相互作用来稳定的。F 972和L 910还对DNMDP的二乙胺基的每一个乙酯进行包装,它们位于活性位点口袋的入口处。Trequinsin与dnmdp结合在一个类似的位置,在二甲氧基端的芳香环大致可以叠加在dnmdp的苯基环上;然而,它不像DNMDP那样深入地嵌入活性部位,并且仅通过非极性相互作用来稳定(图1)。二维空间)。Trequinsin的三甲基苯基相对于分子的平面旋转了90°,并被装进了由S 1003的Cβ和催化中心入口的几条疏水侧链所形成的疏水口袋中。

从晶体结构上可以看出,DNMDP和Trequinsin通过立体限制cAMP的进入和防止关键的稳定接触而抑制PDE3A的催化活性。然而,它们并没有揭示DNMDP是如何促进SLFN 12绑定的,因为DNMDP不会导致PDE3A中任何明显的结构变化。我们假设SLFN 12与DNMDP的二乙胺基的接触是稳定的,而三甲基苯基的Trequinsin则抑制了SLFN 12与SLFN 12的相互作用。

HDX-MS鉴定了PDE3A的三个区域SLFN 12结合后溶剂暴露减少

为了进一步了解PDE3A-SLFN 12复合物的形成,我们利用HDX-MS鉴定了PDE3A与SLFN 12结合后影响的区域。Hdx-MS提供了一种很好的方法来探测蛋白质在溶液中的相互作用,方法是比较蛋白质骨架中的酰胺氢与伴侣之间的相对吸氘量。24。用PDE3A进行实验。绑定到DNMDP模拟BRD 95002在没有和存在SLFN 12的情况下,使用高盐浓度(500毫米)来确保SLFN 12种群结构上的均匀性。

PDE3A对氘摄取的分析在BRD 9500的存在下,发现了许多缓慢交换的区域,这些区域对应于晶体结构中观察到的蛋白质折叠良好的区域(附图)。2和补充数据1)。在蛋白质的N-端和C-端以及778-793和1028-1068之间的环区,最早观察到广泛的氘化,这表明了动态区域。

PDE3A的氘吸收谱然后将绑定到BRD 9500的数据与在SLFN 12存在的情况下收集的数据进行比较,重点放在显示氘交换增加或减少的区域。在SLFN 12存在的情况下,PDE3A的三个不同区域氘交换减少:第1区覆盖残基849-867,区域2覆盖残基902-940,区域3覆盖残基983-1001(图1)。2E,补充图。2,以及补充数据1)。氘交换的减少常常与该区域因与伴侣蛋白的相互作用而被溶剂屏蔽的现象联系在一起。这很可能是溶剂暴露区域2和3的情况。有趣的是,它们也位于或接近DNMDP结合位点,支持SLFN 12与该区域紧密结合的假设。区域1,包括PDE3A上的肽二聚界面,氘交换量下降幅度最大。这表明SLFN 12的结合能稳定PDE3A。更多的同质二聚体,可能是通过减少二聚体界面的结构波动,而不是在晶体结构中捕捉到的。在所使用的实验条件下,我们没有检测到PDE3A在与SLFN 12相互作用时发生的任何长距离变构变化,可能与区域2和3相互作用,尽管PDE3A二聚体界面中检测到的氘变化可以被认为是这样。

PDE3A-SLFN 12配合物结构的冷电镜溶液

为了直接解决DNMDP如何促进PDE3A-SLFN 12复合物形成的问题,我们使用Cryo-EM方法解决了PDE3A的结构问题。-DNMDP复合物绑定到全长SLFN 12(补充图.3和补充表3)。研究发现,该复合物具有双重对称性,在整个细化过程中得到了应用,并由两个灵活连接的体(补充电影)组成。1)。通过安装PDE3A,可以很容易地辨认出身体。CAT-XTL大鼠SLFN 13的二聚体晶体结构和N端结构域(Ntd)的两个单体,与SLFN 12的相关区域同源性为38%。20。在ReliOn中,由于两体的动态运动,需要对每种蛋白质二聚体分别采用多体细化的方法来细化蛋白质二聚体。25,获得SLFN 12和PDE3A地图的最终分辨率。分别为2.76和2.97(补充图)。34)。每种PDE3A单体的残留物669-1100除了779-799和1029-1068之间的循环区域外,还可以建模,这些区域可能采用多种构象。这些环区相当于晶体结构中被短链取代的环区。SLFN 12每个单体的残基1~560可以模拟,第一个346个残基由大鼠SLFN 13的结构引导,387-560个残基重新构建。地图上看不到346至386之间及561以上的区域,表明它们采用了多种构象。两个DNMDP分子的密度也很明显,一个在每个PDE3A单体的催化中心(附图)。4).

与生物物理研究一致,Cryo-EM结构显示了PDE3A的二聚体。-DNMDP与SLFN 12的二聚体相互作用(图1.3A)。PDE3A的结构本质上与PDE 3相同。CAT-XTL(RMSD的主链原子为0.38奥尔),每一个单体的C端螺旋只有另外两圈(补充图)。5)。残基779-799和1029-1068之间的环区密度不明显,表明它们具有多种构象,不参与接触SLFN 12。在HDX-MS研究中,在缺乏SLFN 12的情况下,这些区域在最早的时间点显示出较高的氘含量,表明它们是动态的(附图)。2)。在SLFN 12存在的情况下,氘的吸收没有变化,支持了这样的观察,即它们不受复杂形成的影响(补充图1)。2).

图3:PDE3A的低温电磁结构概述SLFN 12复合物。

aPDE3A的结构-SLFN 12-DNMDP异质四聚体。PDE3A(深蓝色和浅蓝色)和SLFN 12(绿色和洋红色)分别显示在表面和卡通形象。779-799和1029-1068之间的环区在Cryo-EM图中没有显示密度,用一个PDE3A单体(浅蓝色)上的虚线表示。SLFN 12的锌离子呈灰色球状。b详细介绍SLFN 12单体的结构。显示SLFN 12不同区域的示意图显示在顶部,二聚体的结构如下所示。一个单体在表面表示(白色)中显示,另一个在具有不同区域颜色编码的卡通表示中显示,以匹配示意图。指出了与稳定C端结构域内以及N端和C端结构域之间的接触有关的残基(F 548、A12和P 519)。BD桥接域cSLFN 12二聚体界面相互作用概述。每个接触点都用一个键余数来表示,它显示在每个面板的左上角。每种单体的骨架和所示残留物的标签都是绿色或品红,这取决于它们来自哪个单体。品红中的单体标签也有一个主要标记,以表明它们来自其他单体。

SLFN 12单体的结构可分为NTD和C端结构域(CTD),分别由残基1-345和387-560组成(图1)。3B)。SLFN12-NTD可进一步细分为N叶、C叶和两个桥接结构域(BDS;图1).3B和补充图。5)。SLFN12-NTD的总体结构与大鼠SLFN13-NTD非常相似,单个N叶和C叶的主链原子RMSD分别为0.55和0.75。SLFN12-CTD由一个位于387-541和PDE3A相互作用区(PIR)之间的核心结构域组成,在残基551和560之间(如图所示)。3B和补充图。5)。这两个区域之间的连接剂使PDE3A和SLFN 12二聚体之间出现了灵活性。通过F 548,连接体中的其他残基与CTD核心区域之间的疏水相互作用来稳定这个连接物(如图所示)。3B和补充图。5)。虽然SLFN12-NTD和-CTD是通过一种柔性连接剂连接起来的,但它们之间通过一系列疏水和盐桥相互作用而相对稳定(附图)。5)。两个SLFN 12单体在NTD的长度和CTD的一小部分之间相互作用(图1)。3B)。这些相互作用围绕着来自每个单体的四个残基:T71,F89,I 131和I 517。这四种氨基酸的侧链被插入到由来自相反单体的残基形成的疏水小囊中(如图所示)。3C).

SLFN 12的C端螺旋是复杂形成的主要原因。

PDE3A之间的大多数相互作用SLFN 12在每个SLFN 12单体的C端通过PIR序列551-AENLYQIIGI-560发生,延伸出SLFN 12的主体(图1)。34A)。该序列中的几乎所有氨基酸都通过疏水作用与PDE3A催化位点入口附近的残基直接相互作用。4B)。这包括DNMDP的二乙胺基的一个乙酯与SLFN 12的I 557之间的紧密堆积相互作用,这为DNMDP存在下PDE3A-SLFN 12配合物的稳定性增加提供了直接解释(图1)。4B)。值得注意的是,有几个PDE3A残基参与了与DNMDP和SLFN 12(补充表)的联系。4)。DNMDP的结合可能有助于稳定这些残基的位置,从而优化与SLFN 12的相互作用。根据Trequinsin在Cryo-EM结构中的位置与SLFN 12的L 554、I 557和I 558侧链发生立体碰撞,使PDE3A与SLFN 12的相互作用非常不稳定。4C)。在SLFN 12的C端区域之外,这两种蛋白质之间唯一的其他接触点是通过每个PDE3A单体的一个短环发生的,每个PDE3A单体包含两个酸性残基D 926和D 927,它们指向SLFN 12的高正电荷表面(图1)。4A,d)。D 927从PDE3A形成一个直接盐桥与K 150从SLFN 12从每个单体在这个界面(图)。4A)。这可能部分解释了为什么PDE3A和SLFN 12之间的结合在较高的盐浓度下是不稳定的。

图4:PDE3A分子间相互作用和SLFN 12。
figure4

aPDE3A分子间相互作用综述和SLFN 12。D 927周围的表面表示是透明的,以突出侧链。这些残基被标记在它们来自的蛋白质单体的颜色上。bSLFN 12 C端区与PDE3A之间的相互作用。每个面板的焦点SLFN 12残基显示在左上角。PDE3A侧链的主干和标签用蓝色表示,SLFN 12用绿色表示。cTrequinsin对PDE3A影响的建模-SLFN 12复合编队。Trequinsin以细棒格式显示,每个原子都有颜色以区别于DNMDP(蓝色),它是基于PDE3A的叠加来建模的。CAT-XTL-trequinsin结构在PDE3A上在冷冻-EM结构中。dSLFN 12表面电荷的分布最后给出了两种RNase催化残余物在每种单体上的位置。用APB计算了SLFN 12二聚体的表面电荷。47并在PyMOL中可视化。表面呈彩色,从蓝色(高正电)到白色(中性),再到红色(高负电荷)。

SLFN 12 PIR对PDE3A-SLFN 12复合物形成的重要性得到了缺失研究的支持。10-氨基酸C-末端截短在导入缺乏内源性SLFN 12表达的HeLa-RES细胞时不影响DNMDP反应,而30-氨基酸截短消除了PIR结构域,但表达水平相近,完全消除了DNMDP反应(图1)。5A-C)。这些结果表明SLFN 12 PIR对DNMDP的响应是必需的。

图5:SLFN 12 CTD的PIR螺旋结构是DNMDP诱导的肿瘤细胞杀伤所必需的。
figure5

aSLFN 12缺失突变体的示意图。b72小时DNMDP-反应活性测定SLFN 12截短突变体,删除在HeLa-res细胞中表达的PIR区域,缺乏内源性SLFN 12表达。将数据绘制为平均值,误差条表示四个副本的+/−标准差。c抗标记免疫印迹分析显示有标记的SLFN 12蛋白的表达水平,标记为箭头。

PDE3A的深突变扫描鉴定DNMDP耐药突变

为了进一步研究PDE3A、DNMDP和SLFN 12的结构关系,我们利用DMS鉴定了影响DNMDP敏感性的PDE3A残基。因为我们以前已经证明,PDE3A的单独催化结构域足以使表达SLFN 12的细胞产生DNMDP敏感性,但缺乏内源性PDE3A。3,我们的突变分析仅限于PDE3A催化结构域。我们设计了一个pde 3A等位基因文库,其中编码668-1141氨基酸的序列(包括催化结构域)被替换成一个密码子来替代所有其他可能的氨基酸或终止密码子(补充数据)。2)。该文库在PDE3A基因敲除的GB1胶质母细胞瘤细胞中表达。6)和评估在二甲基亚砜(DMSO)、100 NM DNMDP或100 NM Trequinsin存在下的存活情况。消除了由于PDE3A DMS库中的低表示而引起的高度可变位点(补充图)。6我们比较了100 NM DNMDP或DMSO处理细胞的存活结果。6A).

图6:PDE3A的深突变扫描鉴定DNMDP抗性突变。
figure6

a与DMSO处理相比,DNMDP处理后PDE3A突变等位基因的平均log2倍变化(LFC)。野生型(Wt)等位基因标记为沉默的单核苷酸多态性(SNPs)(紫色),而停止密码子(红色)导致功能完全丧失,直到最后59个氨基酸。用虚线表示增加存活率的一个标准差。与平均水平偏差大于一个标准差且不能破坏PDE3A蛋白折叠的抗性突变被着色,以指示定位于活性位点(橙色)、同聚结构域(绿色)或SLFN 12的假定结合位点(深蓝色)。b抗性突变定位到PDE3A活性位点(橙色)、PDE3A同二聚体界面(绿色)和推测的SLFN 12结合位点(深蓝色)。两个PDE3A单体的主链以浅蓝色和白色表示,突变被映射到白色单体上。DNMDP被表示为空间填充和彩色青色.c野生型或突变型PDE3A与DNMDP类似物在PDE3A基因敲除A 2058细胞中的异位表达。用一种PDE3A抗体进行Westernblotting观察,发现在颗粒(P通道)中发现的PDE3A蛋白(用箭头标记)。10μM型Trequinsin(T通道)的存在使PDE3A与树脂的结合相互竞争,从而产生负的收缩作用。dPDE3A基因敲除HeLa细胞异位表达的野生型或突变型PDE3A与标记野生型SLFN 12共免疫共沉淀。标记为箭头的SLFN 12蛋白与PDE3A共沉淀,用抗标记蛋白Westernblotting检测。ePDE3A基因突变体在PDE3A基因敲除A 2058细胞中的深突变扫描结果证实。72小时细胞滴度测定。绿色荧光蛋白。fPDE3A中的二聚体界面CAT-XTL结构。残留物的标签是彩色的、浅色的和深蓝色的,这取决于它们来自哪种单体。

使GB1细胞存活的大多数突变被定位为残基,有助于蛋白质折叠的稳定性。在DNMDP存在的情况下,使GB1细胞存活的功能缺失突变主要可分为两类:(一)聚集在催化位点周围或在催化位点内的突变;(Ii)PDE3A同聚体结构域周围的突变(图)。6B)。这些突变允许GB1在DNMDP存在的情况下与日志一起存活。2折叠变化(Lfc)>0,类似于引入停止密码子所支持的。我们以前曾报道过PDE3A活性位点的突变可以消除DNMDP的结合和细胞毒性反应。3。DMS和HDX的结果还表明PDE3A的二聚界面在PDE3A-SLFN 12复合物的形成中起着关键作用。为支持这些结果,以N867R为例的PDE3A同聚结构域的突变并不能阻止化合物结合(如图所示)。6C)但确实抑制PDE3A-SLFN 12复合物的形成和DNMDP反应。6d-f)。有趣的是,在PDE3A与HDX和Cryo-EM结合的PDE3A区域,F 914的几个替换也引起了对DNMDP的抗性。因此,我们单独评估了F 914的两个突变,发现f914a和f914d保留了结合树脂共轭化合物的能力。1尽管效率下降了(图一)。6C),但不再与SLFN 12配合,以响应DNMDP(图1)。6d)并未能支持DNMDP细胞毒性反应(图一)。6E)。Cryo-EM在PDE3A-SLFN 12界面上检测到的其他几个PDE3A残基的突变也导致了对DNMDP(补充表)的抗药性。4和补充数据2).

SLFN 12具有rnase活性,这是dnmdp诱导的细胞杀伤所必需的。

最近有报道称SLFN 13含有一个N端rnase结构域。20,与SLFN 12序列同源性为35%的区域(附图)。7)。我们推测SLFN 12也是一种RNase,这种活性可能参与DNMDP诱导的细胞杀伤。为了验证我们的假说,我们突变了SLFN 12、E 200和E 205的两个残基,与SLFN 13活性位点的残基同源。57),并分析了这些突变对DNMDP诱导的复合物形成和细胞杀伤的影响。SLFN 12突变体经DNMDP处理后,均与HeLa细胞内源性PDE3A相互作用。7A),表明突变不影响复杂的形成。然而,野生型SLFN 12的异位表达在缺乏内源性SLFN 12表达的HeLa-RES细胞中具有DNMDP敏感性,而突变型SLFN 12的异位表达则没有,这表明对DNMDP的反应需要E 200/E 205-依赖性SLFN 12的内在酶活性。7b).

图7:SLFN 12 RNase活性是DNMDP敏感性所必需的。

a在HeLa细胞中体外表达V5标记野生型或突变型SLFN 12,用DNMDP处理8h,免疫沉淀内源性PDE3A,V5免疫印迹检测共沉淀SLFN 12。bSLFN 12 cDNA对HeLa-RES细胞RNase催化残基突变的DNMDP敏感性缺乏内源性SLFN 12的表达。将数据绘制为平均值,误差条表示四个副本的+/−标准差。c直接测定SLFN 12 RNase活性。将野生型(WT)和活性位点突变体(E200A,E205A)SLFN 12与2g人rRNA在37°C下孵育40 min,共培养2M野生型(WT)或活性位点突变体(E200A,E205A)。野生型SLFN 12经65°C加热20 min变性(WT,Den).在甲醛琼脂糖凝胶上分析了裂解的rRNAs。dPDE3A-SLFN 12复合物诱导SLFN 12 RNase活性。0.25M PDE3A和SLFN 12蛋白分别与DMSO、12.5 M DNMDP、12.5 M Trequinsin或12.5 M雌二醇在室温下孵育30 min,然后稀释1:10,再用rRNA孵育。用变性琼脂糖凝胶对酶切后的rRNAs进行分析。完整的28 SrRNA的相对量用ImageJ软件量化,如图底部所示。为了检测PDE3A和SLFN 12之间的复合物形成,用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺(EDC)和预孵育的重组蛋白进行交联。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。加入SDS负载缓冲液后,反应停止。在SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质,用银染法检测.e分离的SLFN 12 NTD的RNase活性。SLFN 12氨基酸1-347的实验研究d.

为了确定SLFN 12是否是一种RNase,我们在含有40 mm Tris-HCl,pH 8.0,20 mm KCl,4 mm MgCl的缓冲液中,将人rRNA与重组人SLFN 12孵育。22 mm二硫苏糖醇(DTT)。在这种蛋白质浓度下,SLFN 12的大部分蛋白将以二聚体形式存在。在此条件下,野生型SLFN 12,而非热变性SLFN 12能降解rRNA。7C)。这种RNase活性在很大程度上受到E 200或E 205突变的抑制。我们用0.25M SLFN 12重复了这个实验,在这个浓度下,SLFN 12被预测为主要是单聚体(图1)。7D),发现SLFN 12本身不影响底物rRNA的完整性。加入PDE3A导致rRNA完整性显著下降,并进一步添加DNMDP或雌二醇。6,而不是trequinin,极大地促进了rRNA的降解。根据SLFN 12的C端螺旋与PDE3A结合的要求,分离的SLFN 12 NTD与DNMDP结合的PDE3A共孵育后,SLFN 12 RNase活性未见激活。7E)。这些结果共同支持了SLFN 12编码RNase的假设,SLFN 12 RNase活性受DNMDP诱导的PDE3A复合物形成的刺激,SLFN 12 RNase活性是DNMDP诱导的癌细胞死亡所必需的。

讨论

我们对DNMDP诱导的PDE3A-SLFN 12复合物进行了全面的结构功能分析,对复合物的形成、DNMDP在稳定复合物中的作用以及SLFN 12在细胞对DNMDP的反应中的作用提供了重要的见解。DNMDP与PDE3A的活性位点结合,形成了SLFN 12高亲和力相互作用的表面。由于与DNMDP结合的PDE3A形成了SLFN 12的粘附表面,我们建议将这类化合物命名为“velcrins”。目前已知的天鹅绒蛋白包括DNMDP、Zardaverine、BRD 9500、雌二醇、阿纳格雷、纳克勒芬和几种孕酮受体激动剂。1,2,4,5,6,7,26。我们建议,天鹅绒蛋白促进SLFN 12二聚体的二聚,将两个SLFN 12单体引入到一个本构型PDE3A二聚体中,而第二种SLFN 12单体很可能协同结合。我们推测SLFN 12的二聚可能刺激SLFN 12 RNase的活性,类似于2‘-5’-连接的寡腺苷酸酯对RNASEL的激活。27。SLFN 12的二聚可能进一步稳定PDE3A-SLFN 12配合物,因为HDX数据表明当SLFN 12存在时,PDE3A同聚界面的氘吸收减少。

PDE3A的Cryo-EM结构-SLFN 12复合物显示,这两种蛋白质之间的大部分接触是由每个单体中SLFN 12的C端由10个氨基酸组成的单个α-螺旋形成的。这个C端螺旋的残基与PDE3A有多重接触,包括PDE3A F 914,这是DMS确定的一种氨基酸,对配合物的形成和天鹅绒蛋白的反应是必不可少的。没有其他人类SLFN家族成员分享在SLFN 12区域发现的主要序列,这也许解释了为什么没有发现其他SLFN与PDE3A发生复合物,无论是否经蛋白处理。DNMDP为SLFN 12中的残留物提供了更多的接触,从而稳定了复合物。然而,在PDE3A结合trequinsin的情况下,与SLFN 12 C末端区域的残基发生直接的空间位阻冲突阻止了复合物的形成。生物物理和结构研究也表明静电相互作用对PDE3A-SLFN 12配合物的稳定性非常重要。

SLFN 11, SLFN 13,和SLFN 14所有编码RNase活动18,19,20并且已经被证明在限制病毒感染中起着一定的作用。20,28,29。我们推测SLFN 12可能具有类似的生理功能,可以被蛋白蛋白利用来杀死表达PDE3A和SLFN 12水平的癌细胞。维可林已被证明与抗病毒、细胞死亡的干扰素协同作用。4,抗病毒天然免疫反应的另一组分rnase L能够介导病毒感染细胞的杀伤。30,31,32,开创了RNase激活后细胞毒性反应的先例。在这里,我们证明SLFN 12也是一种RNase,这种RNase活性是通过与蛋白结合的PDE3A孵育而增强的,SLFN 12 RNase的活性对于天鹅绒素诱导的肿瘤细胞的杀伤是必不可少的。

与利用肿瘤细胞基因组改变所产生的依赖关系的传统靶向治疗不同,鹿茸蛋白通过PDE3A-SLFN 12复合物形成的一种新的功能增益机制诱导癌细胞死亡。对PDE3A酶活性的抑制与PDE3A-SLFN 12复合物的形成无关。1也可能不需要26。PDE3A-SLFN 12复合物的形成是天鹅绒反应的关键事件,本文报道的结构提供了这种相互作用的分子细节。进一步了解天鹅绒素诱导的PDE3A-SLFN 12复合物在肿瘤细胞杀伤中的作用机制的进一步研究,将支持对蛋白作为潜在的肿瘤治疗方法的评价。


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