应激激素受体激活导致细胞休眠
为了研究GR活化的表型和基因型后果，五种非小细胞肺癌模型(附图)。1A)根据类固醇激素受体的表达谱进行筛选。15,16。免疫印迹分析证实GR的表达。1A)，在五个细胞系中显示出相似的表达水平。GC处理(每个实验的具体处理信息可在补充表中找到)。1在A 549中，H 2122和H 1944导致细胞增殖率显著降低，用SIR-DNA进行的活细胞追踪实验观察到了这一点(见图)。1B)。相反，GC治疗对H 1975和H 460细胞的生长没有影响。1B)。碘化丙酸丙啶染色及流式细胞仪分析显示，S期细胞减少，G0/G1期细胞周期增加，细胞增殖率下降。1B)。GCs处理不能诱导细胞凋亡，用Western blot分析显示PARP不存在(补充图)。1C).
图1：糖皮质激素受体诱导肺癌模型细胞休眠。a具有代表性的Westernblot显示GR的表达，以肌动蛋白为负载对照(n=2)。b用载体(Veh)或糖皮质激素(GC)处理细胞的实时增殖数据计算加倍时间(以小时为单位)。棒材描述独立倍增时间计算的平均值±扫描电镜(A 549)n=18，H 2122n=18，H 1944n=18，H 1975n=24，H 460n=18)。P数值由双边Mann-Whitney检验确定。c所有GC诱导的跨A 549，H 2122和H 1944的脱磷酸化事件，相对于未处理的条件(n=3)。P值是由双面决定的。t测试一下。d对A 549(蓝色)、H 2122(红色)和H 1944(绿色)细胞进行的脱磷事件的基因集富集分析(GSEA)n=3)。e在A 549(蓝)、H 2122(红色)和H 1944(绿色)细胞系上进行全蛋白质组质谱实验的E2F靶基因集(M 5925)GSEA富集谱n=3)。标称P用GSEA软件进行测定。fFRIDMAN衰老基因集(M 9143)对A 549(蓝色)、H 2122(红色)和H 1944(绿色)细胞系进行全蛋白质组质谱实验。n=3)。标称P用GSEA软件进行测定。g衰老相关β-半乳糖苷酶(X-gal)染色细胞未处理(Veh)或糖皮质激素处理(GC)的典型图像(n=3)。标尺，10μm。h衰老相关β-半乳糖苷酶实验中至少200个细胞的定量，以阴性细胞(灰色)和阳性细胞(蓝色)为代表。n=3)。iA 549，H 2122和H 1944，不含Veh或糖皮质激素(GC)时，每dna含量正常耗氧率(OCR)。棒材描述独立实验的平均值±扫描电镜(A 549)n=3，H 2122n=3，H 1944n=2)。P值是由双边的Mann-Whitney确定的。U测试一下。jA 549、H 2122和H 1944细胞外酸化率(ECAR)正常，不含Veh或糖皮质激素(GC)。棒材描述独立实验的平均值±扫描电镜(A 549)n=3，H 2122n=3，H 1944n=2)。P值是由双边的Mann-Whitney确定的。U测试一下。源数据作为源数据文件提供。
与GC处理后观察到的生长停止相一致，观察到了较高程度的蛋白质去磷酸化(如图所示)。1C)，其中大部分参与了转录和细胞周期的直接调控，如基因集分析所证明的(如图所示)。1D)。这伴随着E2F靶标(Hallmark基因集；M 5925)在整个蛋白质组水平上的强烈而明显的下调(图一)。1E)。相反，GC处理没有阻止H 1975和H 460细胞生长的磷蛋白组没有明显改变(补充图)。1D).
由于缺乏切割的PARP提示生长停止不涉及凋亡(补充图)。1C)，我们检查了GC治疗是否导致衰老。首先，我们观察到了一个显著的(FDR)q价值:A 549=0.007;H 2122=0.019;H 1944=0.05)衰老基因集(Fridman衰老标志，M 9143)在全蛋白质组水平上的富集评分(图1)。1F)在GC处理过的细胞中，与车辆处理的条件相比较。与此一致，我们在A 549，H 2122和H 1944的GC刺激下检测到衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性染色，但没有检测到H 1975和H 460的阳性染色。1g，h)。然而，细胞周期的退出并没有伴随p53蛋白表达水平的变化(补充图)。1C)或激活p53通路，如基因集富集分析，RNA测序和完整的蛋白质组数据集(补充图。1E)。配体退出后，生长抑制消失，细胞重新开始增殖(附图)。1F)。此外，总代谢活动/能力下降，如氧消耗率显著下降(反映线粒体呼吸；图1)。1I和S1g)，细胞外酸化率(反映糖酵解输出；图1。1J).
此外，我们还根据GR活性来研究肺腺癌肿瘤细胞周期和衰老的基因特征。Z与GR激活相关的253个基因的评分；25%的分裂)。为了支持我们的实验发现，基于肿瘤基因组图谱(TCGA)的分析表明，与低GR活性的肿瘤相比，具有高GR活性的人肺癌具有更高的衰老相关基因表达水平，而细胞周期相关基因的表达较低(补充图)。1H，I)。重要的是，对1529例肺癌患者的资料进行了Kaplan-Meier生存分析，其中大多数患者在手术前后没有接受(Neo)辅助治疗。17,18,19,20,21,22。根据转录源GR活性将患者分为三组，Kaplan-Meier分析表明，高GR活性的患者在总的生存基础上有更好的预后(补充图)。1J，l)和无复发生存(补充图。1K，m)中、低水平GR活性患者的概率。
结合在一起，我们得出结论，GCs诱导向休眠的可逆细胞状态转变。重要的是，应激激素受体激活所诱导的生长停滞扩展到其他非淋巴实体癌类型，这也是在原发性患者衍生和预先建立的间皮瘤模型中观察到的；一种来源于中胚层细胞的癌症类型(补充图1)。2).
糖皮质激素诱导的细胞休眠具有抗癌耐受性和激活IGF-1R存活信号的特点。
为了进一步描述GC诱导的细胞休眠和支持存活的分子通路，我们在H 1944细胞中进行了药物筛选(从不同的子库中筛选出2277个化合物)。细胞在GCs存在或不存在的情况下培养2天，然后在屏幕的不同臂上分裂(附图)。3A)-(1)车辆臂；(2)GC预处理的ARM，在整个屏幕上加入GC处理，并在屏幕上继续进行；(3)GC-共处理臂，GCs与库化合物同时加入。对所有武器，以1μM和5μM两种不同浓度使用，6天后用CellTiter-Blue法评估细胞活力(补充图1)。3A)，并将GC臂与车辆臂进行比较。
首先，GCs降低了GC治疗前和共治疗臂对多种药物的敏感性(图1).2A和补充数据1)。使用基于第一个屏幕的药物阵列，我们发现GCS显著降低了这些药物在另一种肺癌模型H 2122细胞中的有效性(如图所示)。2B)。用CSgator内的化合物集富集分析方法对化合物进行连续解释的综合分析工具23我们发现GC处理后效果下降的化合物主要是苏氨酸蛋白酶、激酶、鸟苷酸环化酶和结构蛋白抑制剂。2C)。重要的是，我们表明，其中包括各种药物，包括酒石酸长春瑞滨，达布非尼，曲美替尼和多西他赛(补充图)。3B)。第二，GR的活化也增加了对9种抑制剂的敏感性。更具体地说，所有已鉴定的化合物都具有显著的药物反应增强作用(P<0.05和差异<−0.3)关于GR-治疗被归类为IGF通路抑制剂(图1)。2A和补充图。3C)。我们已经成功地验证了这三个细胞系(A 549，H 2122和H 1944)的这些发现，使用从不同供应商获得的浓度和药物库存的对数范围(补充图)。三维空间)。对于h2122中gc/iGF-1R抑制剂组合的适度反应，可能是由于该细胞系在没有gcs的情况下对iGF-1R信号的依赖，正如在癌症依赖图门户上提供的数据所表明的那样。24(补充图。3E)。结合诱导的胰岛素样生长因子-1R抑制剂的易感性，对这三种细胞系的荧光分析显示胰岛素信号蛋白磷酸化状态(包括胰岛素样生长因子-1R蛋白)及相关的下游通路发生了显著变化。25,26，确认其活性在GR激活时的暗示性增加(图1)。二维空间).
图2：细胞休眠表型伴随着通过生长因子信号激活的药物耐受性和活力维持。a散点图显示车辆和糖皮质激素治疗前或共处理的筛分臂与筛选药物的1μM和5μM的生存能力差异。具有显著差异活力的化合物用绿色(P(A<0.05)。调整后P值(P由双面决定的t多次检验校正(本杰明米-霍奇伯格法)。b在5μM浓度下，H 1944细胞株车辆臂活力降低(<0.7)的化合物使H 2122细胞的活力恢复正常。P数值是由双面韦尔奇(Welch‘s)决定的。t测试一下。c用CSgator软件计算药物的复方集富集分析数据，降低GC治疗的疗效。生成相同大小的随机控件来计算背景富集(n=20)。P用CSgator软件测定FDR调整值.d磷蛋白组学研究糖皮质激素处理细胞(A 549、H 2122和H 1944)信号变化的PhosphoPath通路分析n=3)。P数值由PhosphoPath软件确定。eNOD-SCID-γ小鼠经载体(Veh)或糖皮质激素(GC)治疗后获得的异种移植癌标本免疫组化染色的典型图像(n=4)。一次抗体不作为染色对照。标尺，100μm。fNOD-SCID-γ小鼠H1944细胞移植瘤生长正常(Veh=蓝色)、林西替尼(LIN=绿色)、糖皮质激素(GC=红色)或联合(GC+LIN=紫色)。箭头指示何时开始治疗。平均值±扫描电镜图(Dexa+LIN)n=4，德克萨n=6，Vehn=5，林n=6只动物)。P采用混合模型方差分析(Tukey‘s多重比较检验)法测定.
用GCs治疗异种移植动物对移植H 1944肿瘤的转录体有明显的影响(附图)。3F)。GR的激活增加了靶基因的基因表达，包括GILZ 1, FKBP 5和PER 1(补充图。第三代)。有趣的是，我们观察到转移相关基因MYCN, ID4和VCAM 1GC治疗明显下调(补充图)。第三代)。此外，我们还证实了我们在体外实验中的发现，表明GR的激活导致GR活性信号和Fridman衰老信号的显著丰富，以及与E2F信号相关的基因的显著下调(附图)。3H)。与此相一致的是，对荷H 1944异种移植瘤的动物进行GCs治疗后，Ki 67免疫染色和视网膜母细胞瘤(Rb)磷酸化降低(如图所示)。2E总经常预算水平无变化(补充图1)。3I)，未诱导p21的表达和凋亡(附图)。3I)，从没有切割的Caspase-3信号中可以看出。重要的是，GR的激活促进了异种移植瘤IGF-1R的磷酸化(如图所示)。2E)。与此相一致，在H1944细胞NOD-SCID-γ异种移植模型中，检测了GC诱导的IGF-1R抑制剂的脆弱性。与药物治疗的小鼠相比，GCS治疗可导致肿瘤稳定生长停止(如图所示)。2F)。在这些小鼠的治疗计划中加入IGF-1R抑制剂linisitinb会导致肿瘤体积急剧减少。2F)。我们在NOD-SCID-γ小鼠A 549细胞移植模型中成功地验证了这些发现(补充图)。4A，b)。在A 549异种移植动物中，我们证明了两种不同的IGF-1R抑制剂(linsitinib和GSK 1838705A)与GCs联合使用对肿瘤的大小有显著的影响。4A，b).
为了研究GR是否直接参与了iGF-1R信号的调控，我们在A 549细胞中探索了gc处理时程rna序列数据集。27。胰岛素信号基因集(M 18155)Foxo 1, IRS 2和PYGB(糖原磷酸化酶；不是典型IGF-1R信号的一部分)28)经GCS(附图)稳定上调。4C)。我们重点观察了直接参与IGF-1R通路的两个基因的GR调控。Foxo 129和IRS 230。为此，我们利用GR芯片测序和hi-c来自A 549细胞的时程数据。27。GR染色质结合在相应的拓扑关联域(TADS)内的几个增强子位点(补充图)。4D，e)包含Foxo 1和IRS 2基因位点观察(附图)。4F，g，左)。除了GR与这些增强子的结合外，还诱导了一个包含两个GR结合位点的单个增强子-启动子环。Foxo 1基因观察(附图)。4F，右)。至于IRS 2，检测到一个由6个增强子-启动子环组成的复杂网络，包含9个GR结合位点(附图)。4G，右)。
这些数据表明GCs激活GR对抗癌药物具有广泛的耐受性，GC诱导的休眠细胞的存活是通过IGF-1R信号通路的参与而维持的。
细胞周期抑制因子p57是糖皮质激素诱导细胞休眠所必需的
为了确定GC诱导的细胞休眠的驱动因素，我们对A 549、H 2122和H 1944细胞株分别用载体或GCs处理8h进行了RNA序列测定，比较了GC诱导的细胞转录调控，结果显示有很高的相似性(如图1所示)。3A)。GR激活差异表达基因的重点分析(−2≤log2≥2和PAdj≤0.01)显示这三个细胞系共有65个基因(图1)。3B)；只有一个是细胞周期调节剂；CDKN1C(编码为p57)。此外，该基因在H 2795间皮瘤细胞株中被发现上调，后者被GCs所阻断，但在两种耐GC的间皮瘤模型中没有表达(补充图1)。5A).
图3：GC诱导的生长停止需要p57的表达.aGC诱导的三种细胞株(A 549，H 2122和H 1944)RNA序列测定的比较糖皮质激素抑制生长的细胞株(A 549，H 2122和H 1944)n=2)。调整后P值(PAdj)用DESeq 2(Wald试验)测定。P使用Benjamin amini和Hochberg方法校正多次测试的值)。bGC处理与细胞周期基因组(Hsa04110)差异表达的基因相交。c有代表性的免疫荧光图像显示p57(红色)的表达和定位，以DAPI为核染色(蓝色)(n=3)。标尺，10μm。d免疫印迹法检测GCs(左)对H 2122细胞p57-IP的影响。瀑布图描述了GCs处理的H 2122细胞p57-IP在IgG控制下的富集情况(右)。被认为与p57相互作用的蛋白质比IgG(虚线)和显着性(−log)高1.5个lfq。(P价值)>1.3；红色)(n=4)。P值是由双面决定的。t测试一下。e正常化CDKN1C糖皮质激素在A 549细胞(ENCSR897XFT)中的mRNA表达水平。描述了独立生物复制体的平均值±扫描电镜。n=4；对于时间点5、6、7和8，n=3)。f细胞周期基因mRNA表达水平正常(Hsa04110)；n在A 549细胞(ENCSR897XFT)糖皮质激素作用的整个时间过程(ENCSR897XFT)中=125个基因。基于每个时间点至少三个生物复制，绘制了细胞周期基因表达的方框图。中间标记表示中间值，框的底部和顶部边缘分别表示第25和75百分位数。最大晶须长度被指定为四分位数范围的1.5倍，离群点被描述为空圆。g有代表性的免疫荧光图像显示GR(绿色)、p57(红色)在p57-WT和p57-KO细胞中的表达和定位。DAPI用作核染色(蓝色)(n=3)。标尺，10μm。h在车辆(Veh)和糖皮质激素(GC)处理下的60h实时成像实验中进行有丝分裂的细胞百分比。图为独立生物复制的平均值±sd(A 549)。n=4，H 2122n=3，H 1944n=3)。P数值是由双面韦尔奇(Welch‘s)决定的。t测试一下。i–kGr活性标志、e2f靶标(M 5925)和细胞周期(Hsa 04110)基因标记gsea富集谱用于p57-wt和p57-ko h 2122细胞的全转录组实验，gc处理(Gc)与未处理(Veh)比较(n=2)。标称P用GSEA软件进行测定。
免疫荧光法和免疫印迹法检测p57的表达。Gc依赖性诱导p57及其核定位完全在休眠状态(A 549，H 2122和H 1944)，而在GC-反应迟钝的H 1975和H 460模型中未检测到。3C和S5b)。此外，与其良好的细胞周期抑制功能相一致。31内源性蛋白质的快速免疫沉淀32在H 2122细胞中，p57与各种CDK(CDK 1、2、4和6)以及其他细胞周期相关蛋白(如CCNB 1)相互作用，这在以前未见报道为p57相互作用蛋白(图1)。三维空间和补充数据2)。重要的是，CDKN1CMRNA(图1.3E细胞周期基因(包括CCND 3和CCNE 2)在GC处理4h后出现转录下调。3F)。这些结果表明p57可能参与了GR激活后休眠的启动。
为了解决GR诱导的细胞周期退出是否需要p57的问题，我们执行了crispr-Cas9介导的中断CDKN1C基因在A 549、H 2122和H 1944细胞株中的表达。GC处理后GR核易位不受影响，诱导p57多克隆表达。CDKN1C击倒P57-KO)人口大幅度减少。第三代和补充图。5C)。为观察GCs是否仍能诱导p57-KO细胞休眠，对带GCs和不含GCs的SIR-DNA染色细胞进行了活细胞成像，并量化了治疗前60h的有丝分裂细胞数。与我们的假设一致，CDKN1C基因足以减少GCs诱导的细胞休眠。3H)。另外，在H2122p57-WT和p57-KO中，用VIC或GCs对衰老相关的β-半乳糖苷酶进行染色。P57基因敲除细胞衰老相关染色明显减弱(附图)。5D)，证实了p57在休眠诱导中的关键作用。进一步检测GR介导的CDKN1C我们研究了p57-WT和p57-KO H 2122细胞的转录差异。在没有GCs的情况下，p57-WT和p57-KOH 2122细胞的mRNA表达差异无统计学意义(补充图)。5E，f)。而CRISPR-Cas9介导的p57断裂并没有改变活性GR相关基因的转录调控(图1)。3I和补充图。5G)，它减少了细胞周期相关基因的下调(补充图)。5G-I)。结合这一点，E2F靶点的基因集富集分析的变化(图1)。3J)和细胞周期相关基因。3K)在p57-KO模型中未观察到GCs诱导的典型现象，证实了p57上调是生长停滞表型所必需的假说。
综上所述，我们的数据表明，直接GR介导的单个基因的上调(CDKN1C)在人肺癌细胞模型中启动生长抑制。
糖皮质激素受体调节CDKN1C通过以前没有特征的远端增强子来表达
对.的管制CDKN1CBy促进剂一直在争论中，控制其在人类细胞中表达的确切促进剂仍是未知的。33,34。要解决以下问题CDKN1C上调直接依赖于GC介导的GR活化，而不是配体的非靶点效应(如矿物皮质激素受体的激活)，我们构建了GR基因敲除(GR-KO)H 2122细胞株。在H2122 gr-WT细胞中，GC处理可观察到GR的核定位和p57的同时表达，而在多克隆的GR-KO细胞群中未检测到GR或p57的信号(补充图)。6A).
因此，我们寻求建立对CDKN1C利用基因芯片测序技术对基因进行了研究，并对其机制进行了详细的阐述。我们观察到GR在三个不同的位置(增强子1、2和3)上的染色质结合，它们位于拓扑缔合区(Tad)区域，包含了大量的KCNQ 1整个CDKN1C基因，由hi-C和芯片测序分析确定的ctcf位点组成。4A)。有趣的是，芯片测序确定的GR染色质结合没有在CDKN1C启动子，对比先前基于EMSA的电泳迁移率分析(EMSA)。35。这一差异可能是由于EMSA实验中缺乏染色质背景所致。活性增强因子36组蛋白乙酰转移酶p 300和H3K27Ac染色质标记在增强子1中最为明显(图1)。4B)。此外，在增强剂1和增强子1中观察到对增强子-启动子接触至关重要的coherin(smc 3/rad 21)的招募。CDKN1C启动子(如图所示)4B)。Tad内定位、GR绑定、p 300招募、强H3K27Ac信号和coherin定位都表明增强器1(以下简称Ceres)(CDKN1C ENhancerRe被S)是GR调节的主要调控元件。CDKN1C基因表达，而增强子2和3可能作为辅助促进剂。
图4：GR结合增强剂KCNQ 1基因调控CDKN1C通过染色质循环。a(上图)A 549细胞株Hi-C接触图，分辨率为40 kbCDKN1C基因(chr 11：2421230~3141230)。CTCF芯片数据(U01HG00790)用于TAD锚点。a(左下角)GR芯片测序数据显示增强子1、2和3的峰值(chr 11：2799339-2801363；chr 11：2846111-2848121；chr 11：2880971-2882981)，以及CDKN1C所有细胞系的启动子(chr 11：2900697~2910745)，未处理(Veh)或未处理(GC)。a(右下角)mRNA表达CDKN1C无论有没有糖皮质激素(n=2)。bP 300(ENCSR571KWZ)、H3K27Ac(ENCSR375BQN)、SMC 3(ENCSR376GQA)和Rad21(ENCSR501UJL)在增强器1、2、3和CDKN1CA 549细胞，未处理(Veh)或糖皮质激素(GC)。c CDKN1C启动子视点4C信号穿过周围区域(11号染色体)，在车辆(Veh；蓝色)或糖皮质激素(GC；红色)治疗下(n=2)。P值是由威科克森人决定的。t测试一下。d增强子1启动子视点4C信号穿过周围区域(11号染色体)，车辆(Veh=蓝色)或糖皮质激素(GC=红色)治疗(n=2)。P值是由威科克森人决定的。t测试一下。e相对于(家务事基因的几何平均值)CDKN1C载体(−)和GC(+)处理的Δ的mRNA表达水平CDKN1C、ΔCeres、ΔE2、ΔE3和ΔABCB 1P细胞株。平均值±SD。每个基因有两对引导RNA(Δ除外)CDKN1C在生物复制中使用1对n=2)。P数值是由双面韦尔奇(Welch‘s)决定的。t测试一下。fGC处理Δ的相对活力CDKN1C、ΔCeres、ΔE2、ΔE3和ΔABCB 1P细胞株。平均值±SD。每个基因组位置有两个引导RNA对(Δ除外)CDKN1C生物四倍体中使用1对n=4)。P值是由双边的Mann-Whitney确定的。U测试一下。
来确定这些特殊的促进剂和CDKN1C基因座在三维基因组空间中彼此接近，我们进行了4c-seq实验。37。无偏相互作用分析CDKN1C启动子提示，gc处理增强了与KCNQ 1基因(a和b)(图1.4C)。区域a和b分别与CERES和促进剂2/3的位置相吻合。明确显示来自该地区的信号a是由…的近距离驱动的。CDKN1C启动子和CERES，我们从Ceres的角度进行了倒数4C-seq实验。在A 549，H 2122和H 1944中，我们观察到这种增强剂和CDKN1CGCS启动子(图1.4D)。相反，在两种肺癌的GC-无反应模型H 1975和H 460细胞中没有这种增强作用(补充图)。6B).
探讨个体促进剂在GR诱导中的作用CDKN1C基因上调后，我们进行了CRISPR-Cas9实验，从基因组中去除单个增强子元素。利用两对引导RNA，我们切除了CERES，E2或E3增强子。另外，我们切除了CDKN1C基因和ABCB 1启动子分别作为阳性对照和阴性对照。切除CDKN1C基因和Ceres增强子在一个多克隆细胞群体中，我们观察到明显减少CDKN1C提升，(图)4E)和从生长停滞中拯救(图1.4F)与阴性对照条件相比较。在E2和E3缺失实验中没有观察到这一点。CDKN1C(无花果)4E)和生长停滞的程度(如图所示)。4F)与对照组比较。这些实验表明，谷神星增强剂是增强细胞活力所必需的。CDKN1C由GR，从而过渡到休眠状态。
我们共同发现了一种GR驱动的增强剂。CDKN1C基因通过长距离染色质相互作用，从而控制细胞休眠进入。
Swi/snf复合体是一个熟练的GR转录机制的组成部分，控制着CDKN1C
更深入地了解GR的调控机制。CDKN1C比较GR能诱导A 549、H 2122和H 1944细胞休眠的细胞系与不能诱导休眠的细胞株(H 1975和H 460)。在所有使用的细胞株中，GR能够很容易地在GCs的反应下易位到细胞核(如图所示)。5A)并有效地结合了基因组中的数千个位点(如图所示)。5B)，分别通过免疫荧光和芯片测序实验证明。与此形成对照的是，GR驱动的基因表达在GC生长停滞的细胞系(A 549、H 2122和H 1944)中发生了变化，而在GC无反应的细胞系H 1975和H 460中，这种变化则明显减弱(见图)。5C)。由于在转录调节过程中，共同调节因子的补充是必不可少的，我们随后通过执行rime来研究GR转录复合物的分子组成。32。在休眠诱导的细胞系中，GR能够成功地向其复合物中吸收大量的蛋白质，包括NCOA 1和NRIP 1(无花果)5D和补充数据3)，以前报道过它对GR驱动的转录调控至关重要。38。尽管有结合染色质的能力(图)。5BGR不能稳定地在H 1975和H 460中招募共同调节因子(图1)。5D和表S4)。为了解开活性染色质结合GR复合物的组成，我们对GR-Active(A 549/H 2122/H 1944)和GR-非活性(H 1975/H 450)细胞系(补充数据)进行了统计比较。4)。而GR本身是在可比较的水平上检测到的(图中所示)。5E路径富集分析(基因本体论基因集)显示，一个活性GR相互作用体由四个主要部分组成，其中包括核转录因子复合体(名词性转录因子复合物)。P值=0.018)，SWI/SNF复合体(标称)P值<0.001)，介体复合体(标称)P值=0.056)，以及rna聚合酶II复合物(名义值)P价值=0.001)(如图所示。5F).
图5：Swi/snf复合微调的表达CDKN1C.
a有代表性的免疫荧光图像显示GR(绿色)的表达和定位，用糖皮质激素(GC)或对照(Veh)处理，用DAPI作核染色(蓝色)。n=3)。标尺，10μm。b芯片测序信号在整个基因组中检测到的所有位点的中点附近的热图(TOP)，以及所有称为过载控制(底部)的GR芯片-seq实验的平均信号，用于未处理(Veh)和糖皮质激素(GC)处理的细胞。cRNA测序中GC处理差异基因表达变化的散点图。基因显著(P≤0.0 1)GCS的上调或下调用红色表示(n=2)。调整后P值用DESeq 2(Wald试验)确定。P使用Benjamin amini和Hochberg方法校正多次测试的值)。d在GR-Rime实验中描述IgG控制富集的散点图。被认为是由GR招募的蛋白质是2.5LFQ富集于IgG(虚线)和显着性(−日志)。P价值)>2；红色)(n=3)。P值是由双面决定的。t测试一下。e火山图描绘了三种活跃细胞系和两株不活跃细胞株在GR-Rime实验中差异富集的相互作用。n=3)。P值是由双面决定的。t测试一下。fRNA聚合酶II转录因子复合物的GSEA富集谱(M 17103；蓝色)。核转录因子复合物(M 17532；紫色)、SWI/SNF复合物(M 17713；红色)和中介复合物(M 17759；Green)基于A 549/H 2122/H 1944和H 1975/H 460比较数据集(n=3)。标称P用GSEA软件进行测定。g描述GR活动的方框图(z在SWI/SNF WT中253个基因的评分(英文)n=786)和突变体(n91)人肺腺癌肿瘤。中间标记表示中间值，框的底部和顶部边缘分别表示第25和75百分位数。凹槽显示在中位数附近的置信区间。最大晶须长度被指定为四分位数范围的1.5倍，离群点被描述为填充圆。P用Wilcoxon秩和检验确定值，并进行连续性校正。h(左)相对于shControl的mRNA表达水平SMARCD3, ARID 2, SMARCD 2, SMARCC 2, SMARCB 1, SMARCA 2, SMARCE 1和ARID1A，在带有针对各自基因的shRNA的细胞系中。用±SEM描述平均值。≥2基因在生物复制中的表达(英文)n=2)。h(中)正常化(相对于未处理的情况)CDKN1CGC处理的shSMARCD3，shARID 2，shSMARCD 2，shSMARCC 2，shSMARCB 1，shSMARCA 2，shSMARCE 1和shARID1A H 2122细胞的mRNA表达水平。用±SEM描述平均值。≥2基因在生物复制中的表达(英文)n=2)。h(右)用shSMARCD3、shARID 2、shSMARCD 2、shSMARCC 2、shSMARCB 1、shSMARCA 2、shSMARCE 1和shARID1A H 2122细胞在免疫荧光实验中定量表达p57的蛋白表达指数(阳性细胞数*平均信号强度)。用±SEM描述平均值。≥2基因在生物复制中的表达(英文)n≥10,000细胞定量。
SWI/snf染色质重塑复合物特别令人感兴趣，因为其成员的转录下调与人急性淋巴细胞白血病中的gc耐药性有关。39,40。首先，我们询问SWI/SNF复合物的成员是否携带有害突变的人肺癌中GR活性是否受到影响。为此，我们使用了GR活性评分(上述解释)和来自TCGA的肺腺癌数据集(91/877个肿瘤含有SWI/SNF突变；SMARCB 1 18.09%; SMARCC 2 9.52%, SMARCD 2 6.66%, SMARCD3 1.90%, ARID1A 29.52%, ARID 2 31.42%, SMARCE12.85%。携带SWI/SNF突变的肿瘤GR活性评分明显降低(图一)。5G)，表明这些因素可能影响GR的活性。利用gc生长抑制的宫颈癌细胞系模型(Hela)的公开数据CDKN1C经GC治疗后(附图)7A-c我们观察到GR和多个SWI/SNF成员与CERES增强子的结合(补充图)。7D)，表明这一机制在其他癌症类型中是活跃的。为了验证SWI/SNF复合物与GR活性之间是否存在因果关系，我们对H 2122细胞株中的每个SWI/SNF复合体成员进行了短发夹(ShRNA)介导的基因敲除(每个靶至少两个shRNAs)。对所有8个SWI/SNF组分进行了有效的基因敲除，用RT-qPCR进行了验证(图1)。5H，左)。在此基础上，我们用gcs对基因敲除模型进行了处理，并进行了rt-qPCR分析。CDKN1C以及家政参考基因。有趣的是，当击倒ARID1A, SMARCE 1, SMARCA 2和SMARCB 1对GR介导的CDKN1C表达，丧失SMARCC 2和SMARCD 2进一步促进GR诱导的上调CDKN1C(无花果)5H(中)击倒ARID 2和SMARCD3对.没有影响CDKN1C升华(图)5H(中)为了在蛋白水平上证实这些发现，我们在GC处理的条件下对p57进行了免疫荧光染色，并定量了表达该蛋白的细胞的百分比和每敲10,000多个细胞的信号强度。考虑到这两个指标，我们证实在转录水平上观察到的影响也是在蛋白质水平上看到的(如图所示)。5H进一步强化了GR基因调控和休眠诱导是由SWI/SNF复合功能和组成直接控制的结论。
在此基础上，我们发现SWI/SNF重组复合物是GR转录机制的重要组成部分，是调节p57所必需的，而p57是细胞进入休眠状态所必需的。
人癌标本中Ceres的可及性与GR依赖性有关。CDKN1C表达与活性
研究GR驱动的临床有效性CDKN1C在本研究中，我们研究了TCGA队列的转录和染色质可及性(转座酶-可达染色质(ATAC)测序)数据集。6A)。我们观察到，具有较高染色质可达性的CERES具有较高的表达量。CDKN1C，伴随着与癌细胞增殖有关的基因的低表达(MKI 67和PCNA)和侵略性(FOXM 1)(图1.6B)。相反，染色质可及性较低的CERES样品的表达量较低。CDKN1C的高表达MKI 67, PCNA和FOXM 1(无花果)6B)。CERES与染色质可及性的关系CDKN1C基因附近发现的306种增强子的表达水平显著高于相关水平。CDKN1C与其水平无关(图1)。6C)。此外，CERES的可及性与邻近的四个基因中的任何一个基因的表达无关。CDKN1C轨迹(图)6d)。此外，CERES可及性与CDKN1C表达水平依赖于GR mRNA水平，随着肿瘤组织中GR表达水平的降低，表达呈逐步增加的趋势(如图1所示)。6E)。306个周边促进剂的可及性与CDKN1C水平(图1.6E).
图6：CDKN1CMRNA的表达与临床标本的染色质可及性和GR水平有关。a应用tcga对人原发性非淋巴实体癌组织进行全转录组和染色质可及性分析。n=404)。b(上图)在Ceres增强器上显示染色质可达性信号的典型样本。b(下)表示CDKN1C, MKI 67, PCNA，和FOXM 1根据CERES可访问性进行排序。生存事件(活动=白色，死亡=绿色)，SWI/SNF突变状态(WT=白色，突变=绿色)，癌症类型显示在下面。c描述相关值计数的直方图CDKN1C表达水平和306上下游增强子在其基因组附近。红线显示CERES可访问性与CDKN1C表情。d直方图显示四个近端基因与周围306个上下游增强子的可达性相关。CDKN1C。红线显示这些基因与CERES易用性相关。e显示Spearman对CERES(红色)或306(蓝色)周围促进剂可及性的相关性的线图CDKN1CMRNA水平NR3C1MRNA水平(绿色)。
这些数据支持我们的体外发现，表明GR介导的调控与CDKN1C人类非淋巴实体癌临床标本中的CERES。
