Tp 63通过srEBF 1调节脂肪酸代谢途径 为了探讨TP 63调控的体内信号通路，我们首先使用SCC患者标本进行了GSEA。我们以一种公正的方式，通过分析tcga队列中的rna-seq数据(包括ESCC)，确定了在tp 63高表达的SCC样本中富集的信号通路。 n =81)，HNSC( n 436)和LUSC(n=501)样品。宫颈鳞癌与人乳头瘤病毒(HPV) + HNSC样本被排除在外，因为HPV + 肿瘤与人乳头瘤病毒有不同的基因表达程序。 - SCCS 25 ,34 。根据该TF的表达，将每个SCC患者的肿瘤标本分为TP 63-高(前30%)或TP 63-低(30%)。首先确定了TP 63高、TP 63低两组间差异表达的基因.值得注意的是，与TP 63表达呈正相关或负相关的基因在这三种SCCs之间高度重叠(如图所示)。 1A 和补充数据 1 )。例如，在ESCC中发现的72.8%(182/250)正相关基因与LUSC( P < 1E-06) or HNSC (P < 1E-06) cohorts. This high degree of overlap supports the notion that TP63 shares biological functions among different types of SCC by directly regulating gene transcription30 ,31 ,33 ,35 ,36 。这些差异表达的基因随后被用于进行带有Hallmark基因集的GSEA。同样，在TP 63高样本中显着丰富的信号通路在三种主要类型的SCCs之间基本上是重叠的(如图所示)。 1B )，提示TP 63对不同类型SCC基因表达程序的调控作用是一致的。
图1：TP 63通过SREBF 1调节SCCs脂肪酸代谢途径. a 三种SCC基因与TP 63正相关或负相关的Venn图 2 FC>2， q -数值<0.05)。 b 左侧面板，金星图显着丰富的标志路径在TP 63-高SCC样本。右侧面板，9条重叠富集路径GSEA结果的热图。 c 显示NES的条形图(标准化浓缩分数，上)和 P- 来自TCGA 23种癌症的TP 63高样本脂肪酸代谢途径的GSEA结果值(较低)。 d 两个独立的ESCC样本(TCGA和GSE 53624)脂肪酸代谢途径的个体GSEA图。e TE5细胞TP 63沉默后RNA-Seq数据中脂肪酸代谢途径的GSEA图。归一化浓缩分数。 P- 面板中的值 C-E 经多次比较调整。 f TP 63单独敲除后脂质滴染色的共聚焦图像，或联合SREBF 1在TE5和KYSE 150细胞中的高表达。标尺，50μm。底部面板，基于共焦图像的脂滴染色定量分析，平均±扫描电镜。 n 5 除KYSE 150-shTP 63-1+OE SREBF 1( n =6)，作为显微视力的数目。* P < 0.05; **P < 0.01; P- 值是由双边决定的。 t -测试。 g 显示富集图案的热图( q 基因启动子区值<0.001)与TP 63呈正相关。 h TP 63在TE5、KYSE 150和KYSE 510细胞siRNA敲除后脂肪酸代谢调节因子的相对mRNA水平。平均±扫描电镜显示， n =3(生物复制)。* P < 0.05; P- 值是由双边决定的。 t -测试。
在9条共有的信号通路中，细胞周期相关(E2F靶点，G2M检查点，有丝分裂纺锤体)。 37 、MYC 38 ,39 ，和mTOR 40 信号通路预期丰富，与先前TP 63的研究结果一致。此外，还观察到雌激素反应晚期途径的富集。有趣的是，发现了两条与脂肪代谢相关的途径(脂肪酸代谢和胆固醇稳态)。 1B ，右面板)。接下来，我们对所有癌症类型进行了类似的GSEA检查，结果表明，除甲状腺癌外，只有SCC标本中脂肪酸代谢与TP 63呈显著正相关(图一)。 1C 胆固醇稳态没有显示出这种SCC特异性(补充图)。 1A )。如前所述，脂肪酸代谢失调是癌症的代谢标志.然而，对于脂肪酸代谢在SCC中的生物学意义，以及TP 63对脂肪酸代谢的调节作用，还没有进行深入的探讨。因此，我们接下来重点研究TP 63对SCCs脂肪酸代谢的调节作用。
为了验证这些基于TCGA的结果，使用其他独立的、大规模的SCC转录数据集(包括ESCC(GSE 53624)和LUSC(GSE 4573))执行了额外的GSEA。脂肪酸代谢再次富集在TP 63-高样本从任何一个ESCC(图)。 1D )或LUSC(附图)。 1B )队列。在三种SCC中，ESCC的富集程度最高，最低。 P- 价值(图1. 1C 因此，我们选择了这种癌症类型进行进一步的鉴定。值得注意的是，来自体外微扰实验的RNA-Seq数据的GSEA显示，TP 63基因敲除的ESCC细胞中脂肪酸代谢明显下调(如图所示)。 1E 和补充图。 1C )。此外，TP 63的耗竭持续降低了总脂滴水平，表明脂质储存减少(如图所示)。 1F ).
为了了解TP 63是如何调节脂肪酸代谢的，利用与TP 63正相关的基因启动子进行了TF结合基序富集分析。 1g )。E2F家族(E2F1和E2F4)的TFs与途径富集结果一致。SOX 5的排名也很高，可能是因为它识别了一个相同的序列基序SOX 2，这是scc中著名的tp 63合作伙伴。 30 ,33 ,41 。值得注意的是，SREBF 1是排名最高的TFs之一，这表明SREBF 1参与了与TP 63正相关的一大部分基因的调控。由于SREBF 1是脂肪酸代谢最重要的主调节因子之一，我们推测SREBF 1可能是TP 63与脂肪酸代谢途径之间的主要调节因子。支持这一假说，沉默TP 63下调SREBF 1在ESCC细胞中的表达。 氢 )。此外，SREBF 1的异位表达逆转了TP 63-耗竭引起的脂滴含量下降。 1F 相反，SREBF 1的沉默则消除了TP 63(补充图)过表达的影响。 2A SREBF 1在功能上介导TP 63对脂肪酸代谢的影响。TP 63基因敲除可抑制脂肪酸合成关键限速酶mRNA的表达.重要的是，SREBF 1的过度表达挽救了这些基因表达的下降(补充图)。 2B )。另一方面，SREBF 1的基因敲除在很大程度上逆转了TP 63过表达对酶mRNA水平的影响(补充图)。 2C )。为了探讨是否涉及额外的脂代谢调节因子，我们筛选了8种已知的脂代谢调节因子(SREBF 1、SREBF 2、LXRA、LXRB、PPARA、PPARG、PGC 1和HNF4a)。 11 ,42 ,43 ,44 ,45 ,46 。大多数TFs在ESCC细胞中几乎没有表达，而只有SREBF 1始终受到TP 63的调控。 氢 和补充图。 二维空间 )。此外，只有SREBF 1在肿瘤中相对于相应的正常组织有中度上调(Log)。 2 FC>0.5)跨越所有三种类型的SCC(附图)。 二维空间 ).
SREBF 1、tp 63和klf 5共同调控彼此的转录。 接下来我们研究了TP 63在SCC中对SREBF 1转录的调控机制，重点研究了ESCC模型，因为与hNSC和LUSC相比，ESCC不仅显示了SREBF 1的最高表达。 2E )，但肿瘤/正常比率也最高(即肿瘤中最大的增生；补充图)。 二维空间 )。有趣的是，在1157个超级增强剂中，发现了一种顶级的超级增强剂(排名第二)。 SREBF 1 TE5细胞的基因座(图1. 2A )。事实上，SREBF 1在8/8 ESCC细胞中具有超增强作用(TE5和KYSE 150细胞如图所示)。 2B )。为了确定这个超增强子区域是否确实调控srEBF 1的转录，对te5细胞进行了循环染色体构象捕获(4C)检测。 SREBF 1 启动子作为诱饵(图1. 2C )。重要的是，4C分析确定了复杂的、广泛的相互作用 SREBF 1 启动子和超增强子区域。 2C ，补充数据 2 )。此外，这些DNA-DNA接触被严格限制在超增强子区域，突出了染色质相互作用的特异性。值得注意的是，tp 63芯片-seq数据显示来自同一te5细胞的多个结合峰在两个 SREBF 1 超级增强子和启动子。 二维空间 )，提示TP 63有直接的转录调控作用。因为我们最近证明tp 63在SCC细胞中经常与sox 2和klf 5协同作用，共同调节数以百计的促进剂和超级促进剂。 33 我们推测TP 63可能还需要SOX 2或KLF 5共同调控SREBF 1的转录。KLF 5-(但不是SOX 2)结合峰在两个 SREBF 1 超增强子和启动子在TE5细胞中的作用(补充图提供了SOX 2芯片-Seq的阳性对照峰)。 3A )。同样，KLF 5(而不是SOX 2)在转录水平和蛋白质水平上都能抑制SREBF 1在ESCC细胞中的表达。 2E 和补充图。 3B )。此外，验证我们最近关于KLF 5和TP 63之间共同调控的发现，沉默这两种TFs中的一种降低了另一种的表达(如图所示)。 2E，f ).
图2：TP 63和KLF 5共同调控ESCC细胞SREBF 1。 a SREBF 1超增强子在8株ESCC细胞中的排名。 b 拐点图对TE5和KYSE 150细胞中所有典型的和超增强子进行了排序。 c 4C分析表明，在TE5细胞中，SREBF 1启动子上存在着长距离的相互作用。较深的红色表示较高的相互作用频率。 d IGV图显示SREBF 1基因位点指示因子的芯片-Seq谱。蓝色阴影突出选定的本构增强子(E1，E2和E3)，启动子和一个负对照(对照)区域。4C-正区被描述为红条，超增强子(SE)区域被描述为IGV图上的蓝色条。Rpm(每百万映射读取)峰值的值在轨道的左侧。 E， f Qrt-PCR和westernblotting检测 e KLF5或 f TP 63在ESCC细胞中的表达平均±扫描电镜显示， n =3(生物复制)。* P < 0.05; **P < 0.01; P- 值是由双边决定的。 t -测试。全长SREBF 1显示。
为了进一步研究SREBF 1超级增强子的活性，我们将4c、h3k27ac和tp 63/klf 5芯片-seq数据交叉在一起。 30 ,33 。鉴定出3个具有4C接触和H3K27Ac、TP 63和KLF 5峰的增强子成分。随后，这三个增强子元素 SREBF 1 启动子区域被分别克隆到荧光素酶报告载体中：三种组分增强子在TE5细胞中均具有较强的活性(图5)。3A，b )。正如预期的那样，SREBF 1的启动子也有很强的报告活性(如图所示)。 3A，b )。此外，TP 63或KLF 5的沉默降低了三个促进剂和启动子的报告活性。 3A，b )。为了研究TP 63对其靶向增强子的直接调控作用，我们选择了增强子E3，并对TP 63正则结合基序进行了定点突变。的确，TP 63的过度表达显著提高了野生型增强子的报告活性，但对突变型增强子无明显影响(补充图)。 4A-C )。为了进一步验证这种超增强子对SREBF 1的直接转录调节作用，我们使用了一个crispr干扰(Crispri)系统，其中一个单一的引导RNA(Sgrna)将dca 9/krab(核酸酶不活跃的dca 9融合到krüppel相关的盒抑制器)的复合物引导到krüppel相关的盒抑制剂(krüppel)，以抑制靶向cis调控元件。 47 3C )。为了排除非目标效应，我们为每个元件设计了两个独立的sgRNAs.重要的是，针对E1、E2、E3或启动子的sgRNAs都能持续有效地降低SREBF 1的表达。 三维空间 )，突出了这些组成性促进剂的显著调节活性。
图3：SREBF 1调控ESCC细胞TP 63和KLF 5。 a , b 荧光素酶报告法测定增强子活性 a TP 63或 b KLF 5基因敲除TE5细胞。平均±扫描电镜显示， n =3(生物复制)。* P < 0.05; **P < 0.01; P -价值是由双边决定的。 t -测试。 c 示意图显示SREBF 1的本构增强子或启动子受催化死dca 9与转录抑制区(Krab)融合的抑制作用。 d QRT-PCR检测dCas9/Krab载体(不含sgRNA)转染TE5细胞后SREBF 1、TP 63和KLF 5 mRNA水平，或与siRNAs联合转染TE5细胞E1、E2、E3和启动子后的mRNA水平。平均值显示， n =2(生物复制)。 e QRT-PCR和westernblotting分析SREBF 1在ESCC细胞中的敲除作用。平均±扫描电镜显示， n =3(生物复制)。** P < 0.01; P -价值是由双边决定的。 t -测试。 f IGV在TP 63或KLF 5基因位点上指示因子的芯片-Seq谱图。蓝阴影突出选定的TP 63(T1，T2和T3)的本构增强子和KLF 5(K1)的启动子被SREBF 1占据。4C阳性区域(以TP 63启动子为诱饵)被描述为红条，超增强子(SE)区域被描绘为蓝条。Rpm(每百万映射读取)峰值的值在轨道的左侧。 g 荧光素酶报告在TE5细胞SREBF 1基因敲除后进行检测。平均±扫描电镜显示， n =3(生物复制)。* P < 0.05; **P < 0.01; P -价值是由双边决定的。 t -测试。 h TCGAESCC中SREBF 1、TP 63和KLF 5的Pearson相关系数( n =81)和GSE 53624队列( n =118)。 i SREBF 1，TP 63和KLF 5的调节关系示意图。
令人惊讶的是，针对E1、E2、E3或启动子的sgRNA也显著降低了SREBF 1上游调控因子TP 63和KLF 5的表达水平(图1)。 三维空间 )。这种耐人寻味的效应表明SREBF 1也可能调控TP 63和KLF 5的转录，形成反馈共调节回路。事实上，SREBF 1的基因敲除显著降低了TP 63和KLF 5在不同ESCC细胞株的mRNA和蛋白水平上的表达(图一)。 3E )。接下来，我们将探讨SREBF 1如何控制TP 63和KLF 5的转录，并在TE5和KYSE 150细胞株中进行SREBF 1芯片-Seq的表达。 3F )。正如所料，SREBF 1结合峰在这两个ESCC细胞中有很强的重叠( P =10 −8 ，补充图。 4D )。序列基序分析证实SREBF 1基序是最富集的(补充图)。 4E )，以及典型的SREBF 1靶基因(补充图)。 4F )所有的SREBF 1峰均位于其启动子处。这些数据验证了SREBF 1芯片-Seq结果的质量。重要的是，在 TP 63 ，我们在TP 63超增强剂中鉴定了多个SREBF 1结合峰(图3)。 3F )。值得注意的是，我们最近的4c结果确认了srbf 1-占领超级增强子与tp 63启动子的直接联系。 33 。如属 KLF5 此外，我们还在KLF 5启动子和增强子上观察到SREBF 1的几个峰。接下来，我们选择了TP 63的几个候选增强子元件(T1、T2和T3)和KLF 5的启动子元件(K1)进行荧光素酶报告试验。T3和K1的报告活性较强，SREBF 1沉默后，T3和K1的活性降低(图1)。 第三代 )。我们进一步进行了定点突变，突变SREBF 1结合基序在T2和T3元素。我们发现SREBF 1的过表达持续提高了野生型T2/T3基因的报告活性，但未能影响突变体T2/T3(补充图)。 5A-d )，证实SREBF 1对这些促进剂的直接调节作用。此外，来自不同ESCC患者队列的RNA-Seq数据表明，这三种TFs的表达水平之间存在一定的相关性(图一)。 3H 和补充图。 5E )。这些结果表明SREBF 1、TP 63和KLF 5共同激活了彼此的转录，形成了一个共同调节的反馈回路。 3I ).
SREBF 1促进SCCs中脂肪酸、鞘脂和甘油磷脂的生物合成 建立了SREBF 1超增强子激活的分子基础，以及SREBF 1/TP 63/KLF 5在SCC细胞中的协同调节反馈环，进一步研究了SREBF 1对早期发现的脂肪酸代谢的功能影响。 1F )。SREBF 1在不同的细胞类型中激活新脂肪酸生物合成的限速酶(acly，fasn，ass 2和scd)。 12 ,15 ,48 ,49 ,50 。在SCC细胞中，我们证实了siRNAs沉默SREBF 1。 4A，b ，以及附图。 6a，b )这些酶的mRNA和蛋白表达均显著降低。其拮抗剂Fatostatin对SREBF 1活性的抑制作用 16 ,51 (这也是针对SREBF 2的)，也产生了同样的效果(图二)。 4C 和补充图。 6C )。此外，SREBF 1沉默后，脂滴含量降低。 6d，e )。考虑到脂质体具有巨大的结构复杂性，我们进一步全面地描述了SCC细胞中脂类物质的分布情况。具体来说，LC-MS/MS脂质组学是在SREBF 1-抑制作用(Fatostatin)对KYSE 510细胞的抑制作用存在或不存在的情况下进行的.为保证重复性，分别对对照和实验样品进行了三重分析，在各组间均表现出较高的相关性(Pearson相关系数：0.82~0.95，附图)。 6f )。结果，共鉴定出1561个脂质离子，属于35类脂类，表明这一系统方法具有较高的脂质体覆盖率(补充数据)。 3 )。SREBF 1-抑制导致69的下调和65种脂质离子的上调。 2 FC>2， q -数值<0.1，如图所示。 4D，e )。下调的脂质离子主要富集在两类脂质中：(1)鞘脂类(SL)，其中包括Cer酰胺(Cer)、鞘氨酸(SO)、葡萄糖基神经酰胺(CerG 1)、二葡萄糖基神经酰胺(CerG 2)、三葡萄糖神经酰胺(CerG 3)和甘油磷脂(GPL)家族，其中包括心磷脂(CL)、脂多糖(LPS)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)和赖氨酸-磷脂酰乙醇胺(LPE)。相反，在升高的脂质离子中没有发现明显的模式(图一)。 4D，e )。这些结果表明，SREBF 1除了调节脂肪酸合成外，还能调节脂质代谢。为了进一步了解SREBF 1抑制后脂质体的变化，我们整合了SREBF 1抑制后的rna-seq(补充表)。 1 )及其芯片-Seq，并鉴定了直接的SREBF 1靶向酶的脂质代谢过程。与脂肪酶组数据一致，SL合成酶SPTLC 1、SPTLC 2、ELOV 4、ELOV 6、ELOV 7和CERS 6是SREBF 1的直接下游靶点。 4F )。LIPIN 1是一种GPL合成酶，也由SREBF 1直接控制。 4F )。SREBF 1的基因敲除或抑制均下调了所有这些因子的表达。这些发现表明SREBF 1通过直接激活SCC细胞内许多主要酶的转录，促进脂肪酸、SL和GPL的生物合成。
图4：SREBF 1促进SCCs中脂肪酸、SL和GPL的生物合成。 a QRT-PCR检测ESCC细胞SREBF 1基因敲除后脂肪酸合成中枢酶的mRNA水平。平均±扫描电镜显示， n =3(生物复制)。* P < 0.05; **P < 0.01; P -价值是由双边决定的。 t -测试。 b , c WESTERNBLOTTING分析显示脂肪酸合成的中央酶的蛋白质水平 b 击倒SREBF 1或 c Fatostatin(0，3.25μM，6.5μM，13μM)作用于食管鳞癌细胞。在三个与生物学无关的复制体上进行了Westernblotting实验，并给出了具有代表性的结果。 d Fatostatin处理KYSE 510细胞后的LC-MS/MS脂肪组学火山图。每个点是一个脂质离子。 e 脂离子变化的散点图，按脂类分组。每个点是一个脂质离子。SL鞘脂，GPL甘油磷脂，GL甘油脂。 f 示意图显示SREBF 1通过整合RNA-Seq(SREBF 1基因敲除和置乱)和芯片-Seq在TE5细胞中调节脂质合成途径。脂肪酸、SL鞘脂、GPL甘油磷脂、MUFA单不饱和脂肪酸、PUFA多不饱和脂肪酸、3kSN 3-酮-鞘氨酸、SA鞘氨酸、丝氨酸棕榈酸转移酶、二氢DHCer二氢系神经酰胺、CER神经酰胺、CerG 1葡萄糖神经酰胺、G2基葡萄糖神经酰胺、CerG 3三葡萄糖神经酰胺、SM鞘磷脂、鞘氨酸、S1P鞘氨酸、G3P甘油3-磷酸、甘油酰磷脂酸、磷酸二酰甘油、甘油酰甘油酰甘油、甘油酰甘油、心磷脂酰胆碱。
SREBF 1对SCC细胞的生长和迁移至关重要。 我们下一步试图确定SREBF 1在SCC中的生物学意义，再次使用ESCC作为主要疾病模型。免疫组织化学(IHC)染色显示，SREBF 1蛋白在细胞核中的含量明显高于细胞质(见图)。 5A，b )。179例食管癌标本及57例癌旁非恶性食管组织中核SREBF 1蛋白在食管鳞癌组织中均有过表达。 5A ，右面板)。重要的是，SREBF 1的高表达与ESCC患者的整体生存状况密切相关。 5C )。回归分析显示SREBF 1是由临床肿瘤-淋巴结转移(TNM)参数(HR=2.24，95%CI=1.36~3.71)构成的多变量模型中的独立生存预测因子。 P =0.002)(补充表 2 )。鉴于SREBF 1/TP 63/KLF 5具有明显的协同调节反馈环，TP 63和KLF 5的蛋白也用同一组ESCC标本进行染色。一致地，TP 63和KLF 5的显著过度表达被证实(图5)。 5A，b ).
图5：SREBF 1对SCC细胞的生长和迁移至关重要。 a 食管鳞癌及癌旁非恶性食管组织中SREBF 1、TP 63和KLF 5蛋白的核和胞浆染色的IHC评分。方格表示中间线(中线)、25百分位数、75百分位数(方框)和第5百分位数和第95百分位数(须)。IHC染色标本57例(非恶性)，179例(ESCC)肿瘤。** P < 0.01; P- 值是由双边决定的。 t -两组IHC评分之间的测试。 b 典型的ESCC肿瘤标本SREBF 1、TP 63和KLF 5蛋白的IHC图像。原始放大倍数为×400，标度棒为50μm。 c SREBF 1蛋白表达对ESCC患者生存的Kaplan-Meier分析。对Kaplan-Meier曲线进行了对数秩检验， P- 值为双尾，显着性水平为0.05。 d 个体siRNAs和SREBF 1基因敲除SREBF 1的研究e 在集落形成实验中，Fatostatin对细胞增殖有抑制作用。结果表明，qRT-PCR检测有3个生物重复，菌落分析有2个生物重复. f 迁移试验和 g SREBF 1基因敲除后在ESCC细胞中的伤口愈合实验。平均±扫描电镜显示， n =3(生物复制)。* P < 0.05; **P < 0.01; P -价值是由双边决定的。 t -测试。 h SREBF 1在KYSE 150细胞中经shRNA稳定沉默。 i 小鼠异种移植对SREBF 1基因敲除的影响 j Fatostatin(30 mg/kg/d)腹腔注射治疗。平均±扫描电镜显示， n =8(一组肿瘤数目)。* P < 0.05; **P < 0.01; P- 值是由一个片面的值决定的。 t -测试。
进一步研究了SREBF 1对ESCC细胞增殖和迁移的生物学效应。独立siRNAs沉默内源性SREBF 1的表达，显著抑制集落生长。 5D )跨越不同的ESCC细胞。同样，Fatostatin对SREBF 1活性的抑制也显著抑制了集落形成。 5E )。此外，SREBF 1的敲除明显抑制了ESCC细胞在伤口愈合和跨孔迁移试验中的短期迁移能力。 5F-g )。在异种移植模型中，通过shRNA或其抑制剂Fatostatin靶向SREBF 1可有效抑制异种移植物在体内的生长。 5H-j ，补充图。 7a，b 用shRNA或Fatostatin靶向SREBF 1可以有效地降低Ki 67(补充图)的表达。 7C，d )。此外，我们还验证了(I)SREBF 1/TP63/KLF 5之间的共调节反馈环，以及(2)SREBF 1在脂肪酸代谢(例如ACLY、FASN和SCD)中的典型靶基因(如ACLY、FASN和SCD)。 7a，b (右面板)。这些数据共同表明SREBF 1是一个很强的SCC促进因子。
SREBF 1、TP 63和KLF 5协同调控SCC细胞转录体 SREBF 1作为一种强有力的SCC促进因子，其与TP 63/KLF 5的共调节反馈环的发现强烈提示SREBF 1在SCC中具有细胞类型特异性功能，并在脂代谢途径中具有典型作用。为了探讨这一假说，我们分析了SREBF 1在SCC(TE5和KYSE 150细胞株)、肝癌(HepG 2细胞株)和乳腺癌(MCF 7细胞株)三种细胞类型中的全基因组占用率。从ENCODE项目中检索HepG 2和MCF 7细胞的SREBF 1芯片-Seq数据，并使用相同的计算管道与我们来自ESCC细胞的内部数据一起进行再处理。值得注意的是，特定于细胞类型的SREBF 1结合峰的数量超过了共享(定义为两种细胞类型中的峰值)或无处不在的峰值(定义为所有三种细胞类型中的峰值)(如图所示)。 6A ，补充图。 8 )。具有普遍存在或细胞类型特异性峰的代表性基因如图所示. 6C 。为了确定可能的结合TFs，对每一组峰进行了序列基序富集分析(图1)。 6B )。考虑到启动子和远端区域之间不同的dna序列含量(例如，启动子通常是CG丰富的，而远端增强子区域则缺少cpG岛)。 52 )，在这两种基因组背景下分别进行了主题分析，重点关注了前15位最丰富的主题(补充数据) 4 )。正如预期的那样，无论是普遍存在的还是特定的峰值集，SREBF或NFY(已知的SREBF 1辅助因素)主题几乎总是排在第一位。值得注意的是，已知的细胞型特异性TF基序在细胞型特异性峰集中富集.尤其是TP 63和HNF4a基序在ESCC-和HepG 2-特异性峰中分别有显著和独特的富集(图1)。 6B )，与其明确定义的单元格类型特定函数一致。Klf 5也在ESCC和HepG 2的特异性峰中富集，这与其在鳞状细胞癌和胃肠道癌中的重要作用相一致。 53 ,54 ,55 。相反，我们并没有在无处不在的峰值中识别出这种细胞类型的TF基序.
图6：SREBF 1、TP 63和KLF 5协同调节SCC细胞转录组。 a SREBF 1峰区(峰值中心±3KB)的芯片-Seq信号热图，分为普遍存在的、共享的或细胞类型的特定峰值集，并根据每百万次映射读取(RPM)的读取量，按SREBF 1峰值的强度排序。线，峰；颜色标度的峰值强度显示在底部。 b 代表顶部共享或特定于细胞类型的TF主题(由*表示)在每个峰值集合中。注意，在ESCC和HepG 2启动子区域(由**表示)都发现了KLF5基序。 P -对数值进行了调整，以便进行多次比较。 c IGV在代表基因位点的H3K27Ac和SREBF 1芯片-Seq谱。 d 由SREBF 1/TP 63/KLF 5(±5 KB的峰心)所组成的ESCC特异性SREBF 1峰的热图按SREBF 1峰的强度排序。 e 类似于 d ，在ESCC特异性SREBF 1峰区显示指示芯片-Seq信号分布的线状图。 f 在TE5细胞SREBF 1、TP 63或KLF 5沉默后，GSEA绘制了相应转录本的变化图，这些转录本被分配给来自RNA-Seq的274个ESCC特异性峰。归一化浓缩分数。 P- 对数值进行了调整，以便进行多次比较。
以473个ESCC特异性SREBF 1结合峰为研究对象，由于TP 63和KLF 5基序强烈富集，我们进一步分析了在同一株TE5细胞中产生的SREBF 1、TP 63和KLF 5的芯片-Seq数据。经验证，SREBF 1/TP 63/KLF 5在57.8%(274/473)峰中有三次占据，SREBF 1/TP 63或SREBF 1/KLF 5的双占据率分别为14.0%(66/473)或14.8%(70/473)，而SREBF 1仅占较小部分(63/473，13.4%)。 6d，e )。这些峰的两侧是强烈的H3K27Ac信号，表明转录促进活性。Meta-基因分析表明，这三个TFs的结合峰高度一致(图1)。 6E )。为了了解SREBF 1/TP 63/KLF 5在这些ESCC特异性峰中的共结合对转录的影响，我们询问了TE5细胞中每个TF被击倒后的RNA-Seq数据。重要的是，GSEA显示，这274个被三人占据的ESCC特异性峰的相应转录本在这三个TFs中的任何一个沉默后，在下调的基因中都显着地富集(见图)。 6f )。综上所述，这些发现表明SREBF 1/TP 63/KLF 5在数百个ESCC特异性峰中具有显著的协同结合模式，这意味着三个TFs对基因表达的共同调控。
SREBF 1、TP 63和KLF 5协同激活ESCC细胞转录ErbB/mTOR信号通路 为了探讨普遍存在的SREBF 1结合峰和细胞型特异性SREBF 1结合峰的生物学功能，对KEGG通路进行了分析.在与无处不在的峰值集相关的基因中( n 7条信号通路显著丰富。如所料，脂肪代谢过程有四条途径，包括脂肪酸代谢、类固醇生物合成、脂肪酸生物合成和不饱和脂肪酸生物合成(图一)。 7A )。这些数据证实了SREBF 1在调节脂肪和脂肪酸合成方面的共同作用，而不管细胞类型如何。与之形成鲜明对比的是，在与ESCC特异性三峰相关的13条信号通路中，没有一条与脂质代谢有关。相反，这13条途径中大部分与癌症相关，包括ErbB信号通路、mTOR信号通路、胶质瘤、HIF-1信号通路、非小细胞肺癌、乳腺癌、肿瘤中胆碱代谢以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗(图一)。 7b )。由于ErbB和mTOR信号通路高度排列，因此选择这两种致癌级联进行进一步的研究。与SREBF 1/TP 63/KLF 5在这些ESCC特异性峰上的三次占用相一致(图1)。 6d SREBF 1/TP 63/KLF 5对这两条途径富集的13个基因进行了三次整合。 7C )。启动子处的三结合峰 WNT9A 基因显示为例，预期在HepG 2和MCF 7细胞中缺失。 7D )。重要的是，SREBF 1、TP 63和KLF 5的基因敲除使不同ESCC细胞株间mTOR信号通路的5个成分减少(图1)。 7C ，补充图。 9 )。同样，在ErbB信号通路中，SREBF 1、TP 63和KLF 5的沉默导致7个基因的减少(图1)。 7C ，补充图。 9 )。此外，SREBF 1基因敲除SCC细胞后，磷酸化mTOR、磷p70S6K和磷MEK 1/2水平明显降低，证实SREBF 1对ErbB/mTOR信号通路的调控作用(图一)。 7E )。这些结果表明SREBF 1/TP 63/KLF 5协同激活SCC细胞的ErbB/mTOR信号通路。 7F ).
图7：SREBF 1、TP 63和KLF 5协同转录激活ESCC细胞ERbB/mTOR信号通路。 a 显著丰富了相应转录本的KEGG通路，这些转录本被分配到无处不在的高峰或 b SREBF 1、TP 63和KLF 5所占据的274个ESCC特异性峰。在括号中显示了每个途径中丰富的基因数量/基因总数。 c 左面板显示ERbB/mTOR通路富集的基因，SREBF 1/TP 63/KLF 5基于芯片-Seq数据占据。黑人被占领了。右板：在三个细胞系中，SREBF 1、TP 63或KLF 5沉默后，所指示基因mRNA水平的折叠变化(击倒vs.扰码控制)。每组转染30 nM siRNA，48h后提取总RNA，用qRT-PCR法检测mRNA的表达。 d 不同细胞株WNT9A基因位点指示因子的IGV谱片-Seq谱。 e SREBF 1在ESCC细胞siRNA敲除后的Westernblotting分析。水垢的定量如下所示。 f SREBF 1在SCC细胞中的调节和功能的模型图。
