我们实验评估了p-HLA结合亲和力和候选肽的复杂稳定性，因为这两种性质提高了T细胞表位识别的性能。29。此外，p-HLA复合物的稳定性与免疫原性呈正相关。12。为了评估P-HLA结合亲和力，我们采用竞争肽结合试验，利用FITC标记的参考肽和纯化的可溶性HLA I类分子定量测定非标记mKRAS肽候选分子的结合能力。肽亲和力被报道为未标记肽的浓度，导致50%的FITC标记参考肽结合抑制(补充图)。2和补充表1)30。为了评价p-HLA复合物的稳定性，进行了解离试验，将p-HLA复合物的稳定性表示为HLA重链中β-2-微球蛋白解离的半衰期(补充表)。2)29。两项试验均以经验证的HLAⅠ类限制性T细胞表位作为阳性对照(补充表)。3)。在竞争性测试中确定的亲和力结合值报告为log。10[IC]50(Nm)]和IC50(Nm)，并根据补充表中详述的先前报告的比额表界定1和3。对于HLA-A*02：01表位，只有5-14V肽具有较强的Ⅰ类结合亲和力(Log)。10[IC]50]=3.469海里)(图1)。1C)。然而，所有的p-HLA-A*02：01 I类复合物的半衰期都很短(t1/2 < 1 h) compared to control peptides (t1/21.3-10.1 h，图1。1D)。对于HLA-A*03：01表位，多肽7-16R、8-16V和7-16V具有较强的结合亲和力(Log)。10[IC]50[≤3.589 NM](图1.1C)，并形成与阳性对照组相当稳定的P-HLA复合物(t1/2>1h)。9-聚体(8-16C-V)和10-聚(7-16C-V)肽与HLA-A*11：01有很强的亲和力。10[IC]50[≤3.121 NM](图1.1C)，与9-肽相比，10-肽形成了更稳定的p-HLA-A*11：01复合物。t1/26-12 h vs 0.9-9.2 h)(图1)。1D)。对于HLA-B*07：02表位，多肽10-19C，10-19D和10-19R与高亲和力结合(Log)。10[IC]50[≤3.460 NM](图1.1C)，但只有10-19C和10-19R具有与阳性对照肽相当的p-HLA复合物稳定性。t1/2>1h)(图1。1D)。预测和实验测定的p-HLA亲缘关系的比较表明，HLA-A*03：01和HLA-A*11：01限制的8-16C-V和7-16C-V肽具有很强的相关性(R2>0.9)。然而，HLA-A*02：01限制的5-14C-V肽均无相关性。R2=0.1033)或受HLA-B*07：02限制的10-19C-V肽(R2=0.6945)(附图。3和补充表1)。预测和实验确定的p-HLA稳定性的相似分析(补充表)2)所研究的P-HLA复合物之间没有相关性。所有mKRAS/HLA-A*11：01复合物的实验稳定性均高于预期。总之，我们实验鉴定了8个mKRAS G12表位，限制在HLA-A*03：01(n3)，HLA-A*11：01(n或HLA-B*07：02(n(2)表现出高亲和力，形成与阳性对照肽相当的高稳定性p-HLA复合物。
aFACS图显示p-HLA多定时器与TCRA3V-、TCRA11V-和TCRB7R-工程tcRαβ结合零初生CD8+活细胞/CD3门控T细胞+人口。用以下的p-HLA多倍体作为染色对照：gp17-25/a3，gp17-25/a11，NY60-72/b7(补充表)。3). b4小时51释放细胞毒性试验显示TCRA3V、TCRA11V和TCRB 7细胞对TMC表达(红色)、mKRAS肽脉冲(蓝色)或WT KRAS肽脉冲(黑色)单等位基因K 562靶细胞具有杀伤活性。对于每个数据点，三叉数的百分比比解是显示的.数据以平均值±SD表示。p < 0.05 or p < 0.01 for all E:T ratios ≥0.3:1 comparing TMC-expressing or mKRAS peptide-pulsed to WT KRAS peptide-pulsed K562 targets, respectively; one-way ANOVA followed by post-hoc pair-wise Student’s t-多次比较调整试验。c, d。4小时51释放细胞毒性试验显示TCRA3V和TCRA11V对含有WT KRAS(BxPC-3)或内源性KRAS G12V突变的癌细胞株具有杀伤活性。每种颜色都表示图图例中标识的不同的细胞系。对HLA配型的BxPC-3细胞株和不匹配的BxPC-3细胞株均无明显的细胞毒性.数据以平均值±sd表示(n=3个生物独立样本)。p < 0.05 for all E:T ratio ≥1:1 comparing HLA matched vs non-matched cell lines harboring endogenous KRAS G12V mutation; one-way ANOVA followed by post-hoc pair-wise Student’s t-多次比较调整试验。源数据作为源数据档案。
aCOL23-A3和CORL23-A11细胞表面表达8-16V/HLA和7-16V/HLA复合物的绝对定量。数据是两个独立实验的代表。b细胞阻抗测定TCRA3V裂解识别CORL23-A3vsTCRCtrl(TCRA11V)的肿瘤细胞死亡动力学。E：T比值为10：1、3：1和1：1的标准化细胞指数随时间的变化与单独培养的肿瘤细胞相比较。显示了暴露在Triton-X中以表示最大阻抗损失的电池的数据。数据以平均值±SD表示。p < 0.001 at 150 h for all E:T ratios for the TCRA3V group compared to media; one-way ANOVA followed by post-hoc pair-wise Student’s t-多次比较调整试验。数据是两个独立实验的代表。cTCRA11V溶解识别CORL23-A11与TCR Ctrl(TCRA3V)后的细胞阻抗数据。数据以平均值±SD表示。p < 0.0001 at 150 h for all E:T ratios for the TCRA11V group compared to media; one-way ANOVA followed by post-hoc pair-wise Student’s t-多次比较调整试验。数据是两个独立实验的代表。dCOL23-A3和CORL23-A11细胞在TCRA3V和TCRA11V识别上达到50%细胞死亡时间(KT 50)的比较动力学，E：t比分别为10：1、3：1和1：1。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; multiple t-测试分析。数据是两个独立实验的代表。e4小时51释放细胞毒性试验显示TCRA3V对NCI-H 441细胞(G12V)具有杀伤作用+/HLA-A*03：01+)与TCRCtrl(TCRA11V)细胞比较。数据以平均值±SD表示。p < 0.01 for all E:T ratio ≥ 1:1; one-tailed Student’s t-测试。数据是两个独立实验的代表。fTCRA3V裂解识别NCI-H441 vs TCR Ctrl(TCRA11V)后的细胞阻抗数据。数据以平均值±SD表示。p < 0.0001 at 130 h for all E:T ratios for the TCRA3V group compared to media; one-way ANOVA followed by post-hoc pair-wise Student’s t-多次比较调整试验。数据是两个独立实验的代表。源数据作为源数据档案。
将表达点击甲虫红(CBR)荧光素酶基因工程的CORL 23-A3和CORL 23-A11肿瘤细胞注入NOD/SCID/γcnull小鼠尾静脉注射，经生物发光成像证实为肺肿瘤的建立。肿瘤接种后4天，用TCRA3V或TCRA11V工程CD8处理小鼠。+T细胞作为对照组，荷瘤小鼠要么不接受治疗，要么接受tcrαβ治疗。零(TCR KO)CD8+T细胞TCRA3V或TCRA11V工程CD8处理小鼠+T完全根除了CORL23-A3(图3)。6A，c)或CORL23-A11(图1)。6B，d)肿瘤，相对于对照组(p < 0.01). The treatment effect was long-lasting with no evidence of tumor outgrowth by day 39 in mice treated with mKRAS-TCR therapy, while control mice experienced persistent tumor growth. Consequently, mice treated with mKRAS-TCR therapy experienced prolonged survival relative to control groups (p < 0.0002, Fig. 6E，f)。这些结果表明，高亲和力的mKRAS TCRs介导的T细胞转移促进了肿瘤的排斥反应，延长了肿瘤的存活时间。
采用尾静脉注射法将表达CBR荧光素酶的COL23-A3或CORL23-A11肿瘤移植到NSG小鼠体内。小鼠未予治疗(Mok)或tcrαβNULL(Tcrko)或mkras-tcr基因工程CD8治疗。+T细胞移植后4天。治疗前后用生物发光显像评估肿瘤负荷，并对治疗前后的总生存期进行监测。NSG荷瘤小鼠治疗前后的典型生物发光显像aTCRA3V T细胞和TCRA3V T细胞治疗CORL23-A3肺肿瘤b用TCRA11V细胞治疗肺肿瘤与对照组比较，有显着性差异(P<0.01)。总通量随时间的变化cCORL23-A3和dCORL23-A11荷瘤小鼠如(a)和(b)。彩色线条表示随时间推移的平均总通量值，各个数据点对应于处理组，如图图所示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; one-way ANOVA followed by Tukey’s HSD post-test comparing Mock and TCRA3V or TCRA11V treated mice. No statistical difference was observed between Mock and TCR KO treated mice. Kaplan–Meier analysis of overall survival of eCORL23-A3和fCOL23-A11荷瘤小鼠。彩色线条对应于处理组，如图中所示。p测值；对数秩试验比较Mock和TCRA3V或TCRA11V处理的小鼠。Mock组与TCRKO组间差异无统计学意义(P>0.05)。有代表性实验的小鼠数量如下：CORL23-A3队列-模拟(n=6)，TCR KO(n=6)，TCRA3V(n=10)。CORL23-A11队列-Mock(n=6)，TCR KO(n=6)，TCRA11V(n=12)。源数据作为源数据档案。
