T细胞和B细胞缺陷的保护
为了研究氧化还原调控在肿瘤定植中的作用，我们介绍了Ncf 1共享基因MHC b、q和r单倍型小鼠的突变C57BL基因组背景。于接种B16F10细胞后第10d计数肺肿瘤灶。我们发现Ncf 1突变小鼠(Ncf 1*/*)不受转移定植的影响，无论MHC单倍型如何(图1)。1A)，反对对同种异体介导的排斥反应进行氧化还原控制。
图1：Ncf 1突变可减少B16F10细胞的肺集落。小鼠静脉注射B16F10细胞后第10天取肺。a肿瘤集落数Ncf 1突变小鼠(Ncf 1*/*)和野生类型控件(Ncf 1+/+)B6N.Ncf1*/* (n=7)相对于B6N.Ncf1+/+ (n=5)，B6Q.Ncf1*/* (n=5)相对于B6Q.Ncf1+/+(n=6)B6R.Ncf1*/* (n=5)相对于B6R.Ncf1+/+ (n=5)。b野生型小鼠肿瘤集落数(Ncf 1+/+.锰−/−, nMN小鼠(Ncf 1*/*.锰+/+, n=7)，以及Ncf 1突变小鼠(Ncf 1*/*.锰−/−, n=7)。c有代表性的流式细胞仪图显示CD 45的门控。+CD11b+F4/80+细胞(巨噬细胞)，以及d以PMA和DMSO为对照，体外培养肺细胞(每组6只)，流式细胞仪DHR染色产生ROS。e小鼠肿瘤集落数Ncf 1*/*.TCRδ−/− (n=9)相对于Ncf 1*/*.TCRδ+/+ (n=6)，Ncf 1*/*.TCRβ−/− (n=4)相对于Ncf 1*/*.TCRβ+/+ (n=6)Ncf 1*/* (n=6)相对于Ncf 1*/*.μMT (n=4)，与野生型小鼠(n=6)。所有结果均为均值±扫描电镜。曼-惠特尼U测试*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001.
为了进一步研究活性氧缺乏症的细胞类型特异性作用，我们研究了巨噬细胞和单核细胞的作用。我们使用转基因MN小鼠(Ncf 1*/*.锰+/+NCF 1仅表达于CD 68阳性细胞，用荧光载体二氢可达明123(DHR)检测单个细胞在佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)刺激下的活性氧生成。结果表明，MN小鼠与Ncf 1突变小鼠相比，肺癌灶无明显变化。1B)，尽管巨噬细胞/单核细胞中ROS的产生已经恢复(见图)。1C，d)。此外，Ncf 1-T细胞受体(TCR)β缺失突变小鼠(Ncf 1*/*.TCRβ−/−)，TCR-Delta(Ncf 1*/*.TCRδ−/−)和B细胞(Ncf 1*/*.μMT)肿瘤集落的水平相当，类似于他们的小白蚁对照(图1)。1D)。这些观察并不排除影响，但排除了巨噬细胞/单核细胞、T和B细胞在支持肺定植方面的关键氧化还原调节作用。
中性粒细胞恢复对定植的易感性
在连续搜索关键单元的过程中，Ncf 1调节作用，我们研究中性粒细胞的作用。我们设计了一个条件敲入模型，该模型表示Ncf 1在MRP 8启动子调控下CRE基因在中性粒细胞中的作用Ncf 1-背景不足(Ncf 1TN3/*.姆尔普8CRE/+)。在之前的实验中，我们验证了ncf 1在从朴素中分离出来的骨髓中性粒细胞中的条件表达。Ncf 1TN3/*.姆尔普8CRE/+老鼠(图1.S1a)。我们观察了幼鼠血液中性粒细胞的氧化爆发。Ncf 1TN3/*.姆尔普8CRE/+(无花果)2A)，而血单核细胞的活性氧生成未恢复(图一)。S1b)。我们对敲入小鼠进行了肿瘤定植实验。在第10天肺部发现较多的肿瘤集落。Ncf 1TN3/*.姆尔普8CRE/+老鼠(图1.2B).
图2：功能性中性粒细胞限制性表达增加肿瘤集落。Ncf 1.a用DHR流式细胞术检测中性粒细胞产生ROS，以PMA和DMSO为对照体外培养血细胞。天真的老鼠被使用，包括野生型的老鼠(Ncf 1+/+, n=4)，Ncf 1突变小鼠(Ncf 1*/*, n转基因小鼠(Ncf 1TN3/*.姆尔普8CRE/+, n=5)，以及它们的小白蚁(Ncf 1TN3/*.姆尔普8+/+, n=4)。b每只小鼠肺部的肿瘤集落数在转基因小鼠中计数。Ncf 1突变的老鼠。c流式细胞术绘制肺细胞CD 45、CD11b、Ly6G和Ly6C的典型图。d流式细胞术检测肺中性粒细胞前IL-1β染色的平均荧光强度(MFI)和肺中性粒细胞中亲IL-1β的水平。在……里面b, c，和d，肺是从转基因小鼠(Ncf 1TN3/*.姆尔普8CRE/+, n=6)和Ncf 1突变小鼠(Ncf 1TN3/*.姆尔普8+/+, n7)静脉注射B16F10细胞后第10天进行分析。所有结果均为均值±扫描电镜。曼-惠特尼U测试*p < 0.05, **p < 0.01.
在此之前，我们和其他人已经发现ros在调节IL-1β表达中的作用。12,23。在本研究中，我们发现ROS-足够多的中性粒细胞在条件性敲入小鼠中表达一种增强的IL-1β(如图所示)。2C，d)。IL-1β在野生型小鼠肺中性粒细胞中的表达增强(Ncf 1+/+；图1.S1c)，以及CD 54被称为分子桥梁24肿瘤细胞和中性粒细胞之间的相互作用。S1d)。这些结果提示中性粒细胞通过激活IL-1β分泌而促进肺定植。
通过IL-1β信号的下游介质
我们接下来研究IL-1β在肿瘤定植模型中的作用.为此，我们在静脉注射B16F10细胞后第10天收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。流式细胞仪数据分析显示，bulf中IL-1β水平下降。Ncf 1突变小鼠(Ncf 1*/*；图1.3A)。此外，我们还观察了肿瘤坏死因子α、干扰素-γ、白细胞介素-4和白细胞介素-1α在相同的支气管肺泡灌洗液中的表达，但两者之间无显着性差异(P>0.05)。Ncf 1突变组和野生型对照。S1e).
图3：rmIL-1β的应用增加了大鼠的肺定植。Ncf 1突变的老鼠。收集野生型小鼠支气管肺泡灌洗液(BAL)和肺。Ncf 1+/+)和Ncf 1突变小鼠(Ncf 1*/*)静脉注射B16F10细胞后第10天。a流式细胞术检测BAL液中IL-1β的水平.b用rmIL-1β(rmIL-1)对野生型小鼠肺内肿瘤集落数进行计数。n=5)对PBS(n=11)，以及Ncf 1RmIL-1β注射突变小鼠(n=8)对PBS(n=11)。c用DHR流式细胞术检测肺中性粒细胞产生ROS，并以PMA和DMSO为对照，体外培养这些细胞。用rmIL-1β(rmIL-1)注射法采集野生型小鼠肺组织。n=5)对PBS(n和NCF 1缺乏的小鼠注射rmIL-1β(n=5)对PBS(n5)B16F10细胞注射后第10天。所有结果均为均值±扫描电镜。曼-惠特尼U测试*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001.
为了探讨一种可能的功能作用，我们在接种B16F10细胞前半小时用重组小鼠IL-1β(rmIL-1β)治疗小鼠。我们发现IL-1β治疗可以促进肺定植，而不依赖于Ncf 1多态(图1.3B)。注射rmIL-1β也不影响肺中性粒细胞的氧化断裂能力。3C)。有趣的是，我们观察到成熟的自然杀伤(NK)细胞(CD 45)的数量减少了。+CD3−NK1.1+)在肺中(如图所示)。S2A)，即CD 27−KLRG 1+NK细胞Ncf 1-依赖方式，在体内一次注射rmIL-1β后(如图所示)。S2B，c)。成熟的NK细胞在控制B16F10肺定植中起重要作用。25，研究了NK细胞注射NK1.1抗体对NK细胞的影响。26,27,28。如预期的那样，NK细胞的减少导致B16F10肿瘤细胞的肺定植增加(图1)。S2D)。但是，Ncf 1突变介导的保护是一致的，无论NK细胞消耗(图一)。S2D)。这些结果提示，IL-1β作为ROS的下游效应，促进了肿瘤的定植.NK细胞可能在IL-1β信号传导中起重要作用，但在调节Ncf 1效果。
中性粒细胞耗竭后强化定植
我们的数据表明中性粒细胞在ROS介导的肿瘤定植中起着至关重要的作用。为了减少中性粒细胞，我们注射抗Ly6G抗体(克隆1A8)在野生型小鼠，mn小鼠，和Ncf 1突变小鼠，并评估中性粒细胞浸润在第10天的B16F10暴露小鼠(图一)。4A)。肺中性粒细胞数(CD 45)+CD11b+GR1+Ly6C中)在所有菌株中均减少(图1)。4B，c，而单核细胞数量增加(CD 45)+CD11b+GR1中Ly6C嗨)在野生型小鼠中观察。S3A)。与以前的结果相反，中性粒细胞缺乏抗GR1抗体(克隆rb6-8c5)抑制肿瘤的生长。29,30，1A8抗体治疗对大鼠肺定植无影响。C57BL/6小鼠31，我们的数据显示，1A8抗体增强了Ncf 1野生型老鼠C57BL/6遗传背景。然而，重要的是，这一现象是依赖于ncf 1的，因为在这两种现象中都没有Ncf 1突变小鼠或MN小鼠。4D)。促进肿瘤集落增加的一个可能原因是野生型小鼠单核细胞上糖基化终末产物受体(RAGE)的表达。S3b)。RAGE是mrp 8在肿瘤细胞与髓系细胞相互作用中的一种受体。24,32。为了确定RAGE在氧化调节中的作用，我们用RAGE阻断剂FPS-ZM1治疗小鼠。33)。有趣的是，fps-zm1将野生型小鼠的肺定植减少到与Ncf 1突变小鼠S3c，d)。这些结果提示MRP8-RAGE信号可以激活单核细胞支持ROS-足够的中性粒细胞耗竭后的肿瘤定植。
图4：抗Ly6G抗体治疗增加了NCF1表达的中性粒细胞小鼠的肺定植。研究用野生型老鼠(Ncf 1+/+.锰−/−)，MN小鼠(Ncf 1*/*.锰+/+)，以及Ncf 1突变小鼠(Ncf 1*/*.锰-/−)。B16F10细胞于第0天注入小鼠体内，每只小鼠肺内肿瘤集落数于注射后第10天计数。a在注射B16F10细胞后第1、2、5、8天给予抗Ly6G抗体。本研究包括注射抗Ly6G抗体的野生型小鼠(克隆：1A8；n=7)与同型对照(克隆：2A3；nMN小鼠注射1A8(n=6)相对于2A3(n=6)Ncf 11A8注射突变小鼠n=6)相对于2A3(n=6)。b具有代表性的流式细胞仪绘制了肺细胞CD11b、Gr1和Ly6C的图谱。c每只小鼠肺内中性粒细胞计数。d用抗Ly6G抗体注射组与同型对照组比较，计算小鼠肺内肿瘤集落数。所有结果均为均值±扫描电镜。曼-惠特尼U测试*p < 0.05, **p < 0.01.
