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中性粒细胞源性活性氧促进肿瘤定植

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发表时间:2021-07-21 10:18作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

中性粒细胞胞浆因子1的单核苷酸多态性Ncf 1),导致活性氧(ROS)的产生受损,是导致自身免疫性疾病的一个遗传因素。研究一种可能的肿瘤保护作用Ncf 1我们采用B16F10黑色素瘤细胞的肺定植实验模型,以一种依赖于细胞类型的方式进行突变。我们观察到更少的肿瘤病灶Ncf 1突变小鼠,不考虑αβT、γδT、B细胞缺陷或功能缺陷Ncf 1CD 68阳性单核/巨噬细胞表达。人S100A8(MRP 8)启动子对肿瘤定植易感性的恢复Ncf 1表达成粒细胞。这种效应与肺中性粒细胞产生的ROS和白细胞介素1β(IL-1β)的增加有关。此外,抗Ly6G抗体引起的中性粒细胞耗竭增加了野生型肿瘤的定植,但在肿瘤中失败。Ncf 1突变的老鼠。总之,肿瘤的定植是由ROS激活的和IL-1β分泌的中性粒细胞所抵消的.

导言

免疫治疗已证明能有效降低转移性黑色素瘤的癌症死亡率。1尽管晚期黑色素瘤患者的5年生存率仍低于30%(参考文献)。2)。它强调了研究早期步骤在肿瘤定植的免疫反应中的作用的重要性。

最近的一项发现是在Ncf 1基因是自身免疫的遗传基础3,4,5。这个Ncf 1基因编码中性粒细胞胞浆因子1(NCF 1),早期表示为P47磷光),NADPH氧化酶2(NOX 2)复合物的胞质成分6。NOX 2复合物需要ncf 1来触发氧化爆发,即诱导产生活性氧(Ros)。7,并确定了Ncf 1突变导致活性氧生成减少。8,9。Ncf 1在中性粒细胞和CD 68阳性细胞中高表达。10。CD 68-表达细胞,主要是巨噬细胞,是自身免疫性疾病易感性的重要介质,表现出先天和适应性免疫反应的特性。的下游效应Ncf 1突变包括T细胞在自身免疫性关节炎中的调节10,11脑脊髓炎12,夸大Ⅰ型干扰素信号在狼疮自身免疫中的作用13,14诱导银屑病患者发生先天性白细胞介素17(IL-17)15,16,17,以及痛风患者形成中性粒细胞外陷阱的能力受损。18胆结石19.

诱导免疫反应Ncf 1另一方面,突变可以预防癌症。结果表明,产生ros的髓系细胞可抑制细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的反应。20。我们和其他人发现NCF 1和NOX 2功能受损对黑色素瘤的发展有保护作用。21,22。我们现在选择由atcc提供的共享黑色素瘤模型b16f10细胞来探讨细胞特异性的机制。Ncf 1肿瘤定植突变。

在这项研究中,我们转移了Ncf 1突变(Ncf 1*/*)转化为具有不同主要组织相容性复合体(MHC)单倍型的小鼠株。C57BL遗传背景。在小鼠黑色素瘤模型中,采用MHC同系物小鼠,我们观察到小鼠肺细胞集落数减少。Ncf 1突变的老鼠。我们排除了T细胞、B细胞和巨噬细胞的关键作用,但发现中性粒细胞是最重要的细胞。Ncf 1突变介导的保护。MRP 8-限制功能表达Ncf 1恢复中性粒细胞IL-1β的释放及对肿瘤定植的敏感性。因此,本研究提供了关于NOX 2衍生的ROS通过中性粒细胞和IL-1β-依赖性途径促进肿瘤定植的研究。

结果

T细胞和B细胞缺陷的保护

为了研究氧化还原调控在肿瘤定植中的作用,我们介绍了Ncf 1共享基因MHC b、q和r单倍型小鼠的突变C57BL基因组背景。于接种B16F10细胞后第10d计数肺肿瘤灶。我们发现Ncf 1突变小鼠(Ncf 1*/*)不受转移定植的影响,无论MHC单倍型如何(图1)。1A),反对对同种异体介导的排斥反应进行氧化还原控制。

图1:Ncf 1突变可减少B16F10细胞的肺集落。
figure1

小鼠静脉注射B16F10细胞后第10天取肺。a肿瘤集落数Ncf 1突变小鼠(Ncf 1*/*)和野生类型控件(Ncf 1+/+)B6N.Ncf1*/* (n=7)相对于B6N.Ncf1+/+ (n=5),B6Q.Ncf1*/* (n=5)相对于B6Q.Ncf1+/+(n=6)B6R.Ncf1*/* (n=5)相对于B6R.Ncf1+/+ (n=5)。b野生型小鼠肿瘤集落数(Ncf 1+/+.−/−, nMN小鼠(Ncf 1*/*.+/+, n=7),以及Ncf 1突变小鼠(Ncf 1*/*.−/−, n=7)。c有代表性的流式细胞仪图显示CD 45的门控。+CD11b+F4/80+细胞(巨噬细胞),以及d以PMA和DMSO为对照,体外培养肺细胞(每组6只),流式细胞仪DHR染色产生ROS。e小鼠肿瘤集落数Ncf 1*/*.TCRδ−/− (n=9)相对于Ncf 1*/*.TCRδ+/+ (n=6),Ncf 1*/*.TCRβ−/− (n=4)相对于Ncf 1*/*.TCRβ+/+ (n=6)Ncf 1*/* (n=6)相对于Ncf 1*/*.μMT (n=4),与野生型小鼠(n=6)。所有结果均为均值±扫描电镜。曼-惠特尼U测试*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001.

为了进一步研究活性氧缺乏症的细胞类型特异性作用,我们研究了巨噬细胞和单核细胞的作用。我们使用转基因MN小鼠(Ncf 1*/*.+/+NCF 1仅表达于CD 68阳性细胞,用荧光载体二氢可达明123(DHR)检测单个细胞在佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)刺激下的活性氧生成。结果表明,MN小鼠与Ncf 1突变小鼠相比,肺癌灶无明显变化。1B),尽管巨噬细胞/单核细胞中ROS的产生已经恢复(见图)。1C,d)。此外,Ncf 1-T细胞受体(TCR)β缺失突变小鼠(Ncf 1*/*.TCRβ−/−),TCR-Delta(Ncf 1*/*.TCRδ−/−)和B细胞(Ncf 1*/*.μMT)肿瘤集落的水平相当,类似于他们的小白蚁对照(图1)。1D)。这些观察并不排除影响,但排除了巨噬细胞/单核细胞、T和B细胞在支持肺定植方面的关键氧化还原调节作用。

中性粒细胞恢复对定植的易感性

在连续搜索关键单元的过程中,Ncf 1调节作用,我们研究中性粒细胞的作用。我们设计了一个条件敲入模型,该模型表示Ncf 1在MRP 8启动子调控下CRE基因在中性粒细胞中的作用Ncf 1-背景不足(Ncf 1TN3/*.姆尔普8CRE/+)。在之前的实验中,我们验证了ncf 1在从朴素中分离出来的骨髓中性粒细胞中的条件表达。Ncf 1TN3/*.姆尔普8CRE/+老鼠(图1.S1a)。我们观察了幼鼠血液中性粒细胞的氧化爆发。Ncf 1TN3/*.姆尔普8CRE/+(无花果)2A),而血单核细胞的活性氧生成未恢复(图一)。S1b)。我们对敲入小鼠进行了肿瘤定植实验。在第10天肺部发现较多的肿瘤集落。Ncf 1TN3/*.姆尔普8CRE/+老鼠(图1.2B).

图2:功能性中性粒细胞限制性表达增加肿瘤集落。Ncf 1.
figure2

a用DHR流式细胞术检测中性粒细胞产生ROS,以PMA和DMSO为对照体外培养血细胞。天真的老鼠被使用,包括野生型的老鼠(Ncf 1+/+, n=4),Ncf 1突变小鼠(Ncf 1*/*, n转基因小鼠(Ncf 1TN3/*.姆尔普8CRE/+, n=5),以及它们的小白蚁(Ncf 1TN3/*.姆尔普8+/+, n=4)。b每只小鼠肺部的肿瘤集落数在转基因小鼠中计数。Ncf 1突变的老鼠。c流式细胞术绘制肺细胞CD 45、CD11b、Ly6G和Ly6C的典型图。d流式细胞术检测肺中性粒细胞前IL-1β染色的平均荧光强度(MFI)和肺中性粒细胞中亲IL-1β的水平。在……里面b, c,和d,肺是从转基因小鼠(Ncf 1TN3/*.姆尔普8CRE/+, n=6)和Ncf 1突变小鼠(Ncf 1TN3/*.姆尔普8+/+, n7)静脉注射B16F10细胞后第10天进行分析。所有结果均为均值±扫描电镜。曼-惠特尼U测试*p < 0.05, **p < 0.01.

在此之前,我们和其他人已经发现ros在调节IL-1β表达中的作用。12,23。在本研究中,我们发现ROS-足够多的中性粒细胞在条件性敲入小鼠中表达一种增强的IL-1β(如图所示)。2C,d)。IL-1β在野生型小鼠肺中性粒细胞中的表达增强(Ncf 1+/+;图1.S1c),以及CD 54被称为分子桥梁24肿瘤细胞和中性粒细胞之间的相互作用。S1d)。这些结果提示中性粒细胞通过激活IL-1β分泌而促进肺定植。

通过IL-1β信号的下游介质

我们接下来研究IL-1β在肿瘤定植模型中的作用.为此,我们在静脉注射B16F10细胞后第10天收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。流式细胞仪数据分析显示,bulf中IL-1β水平下降。Ncf 1突变小鼠(Ncf 1*/*;图1.3A)。此外,我们还观察了肿瘤坏死因子α、干扰素-γ、白细胞介素-4和白细胞介素-1α在相同的支气管肺泡灌洗液中的表达,但两者之间无显着性差异(P>0.05)。Ncf 1突变组和野生型对照。S1e).

图3:rmIL-1β的应用增加了大鼠的肺定植。Ncf 1突变的老鼠。
figure3

收集野生型小鼠支气管肺泡灌洗液(BAL)和肺。Ncf 1+/+)和Ncf 1突变小鼠(Ncf 1*/*)静脉注射B16F10细胞后第10天。a流式细胞术检测BAL液中IL-1β的水平.b用rmIL-1β(rmIL-1)对野生型小鼠肺内肿瘤集落数进行计数。n=5)对PBS(n=11),以及Ncf 1RmIL-1β注射突变小鼠(n=8)对PBS(n=11)。c用DHR流式细胞术检测肺中性粒细胞产生ROS,并以PMA和DMSO为对照,体外培养这些细胞。用rmIL-1β(rmIL-1)注射法采集野生型小鼠肺组织。n=5)对PBS(n和NCF 1缺乏的小鼠注射rmIL-1β(n=5)对PBS(n5)B16F10细胞注射后第10天。所有结果均为均值±扫描电镜。曼-惠特尼U测试*p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.001.

为了探讨一种可能的功能作用,我们在接种B16F10细胞前半小时用重组小鼠IL-1β(rmIL-1β)治疗小鼠。我们发现IL-1β治疗可以促进肺定植,而不依赖于Ncf 1多态(图1.3B)。注射rmIL-1β也不影响肺中性粒细胞的氧化断裂能力。3C)。有趣的是,我们观察到成熟的自然杀伤(NK)细胞(CD 45)的数量减少了。+CD3NK1.1+)在肺中(如图所示)。S2A),即CD 27KLRG 1+NK细胞Ncf 1-依赖方式,在体内一次注射rmIL-1β后(如图所示)。S2B,c)。成熟的NK细胞在控制B16F10肺定植中起重要作用。25,研究了NK细胞注射NK1.1抗体对NK细胞的影响。26,27,28。如预期的那样,NK细胞的减少导致B16F10肿瘤细胞的肺定植增加(图1)。S2D)。但是,Ncf 1突变介导的保护是一致的,无论NK细胞消耗(图一)。S2D)。这些结果提示,IL-1β作为ROS的下游效应,促进了肿瘤的定植.NK细胞可能在IL-1β信号传导中起重要作用,但在调节Ncf 1效果。

中性粒细胞耗竭后强化定植

我们的数据表明中性粒细胞在ROS介导的肿瘤定植中起着至关重要的作用。为了减少中性粒细胞,我们注射抗Ly6G抗体(克隆1A8)在野生型小鼠,mn小鼠,和Ncf 1突变小鼠,并评估中性粒细胞浸润在第10天的B16F10暴露小鼠(图一)。4A)。肺中性粒细胞数(CD 45)+CD11b+GR1+Ly6C)在所有菌株中均减少(图1)。4B,c,而单核细胞数量增加(CD 45)+CD11b+GR1Ly6C)在野生型小鼠中观察。S3A)。与以前的结果相反,中性粒细胞缺乏抗GR1抗体(克隆rb6-8c5)抑制肿瘤的生长。29,30,1A8抗体治疗对大鼠肺定植无影响。C57BL/6小鼠31,我们的数据显示,1A8抗体增强了Ncf 1野生型老鼠C57BL/6遗传背景。然而,重要的是,这一现象是依赖于ncf 1的,因为在这两种现象中都没有Ncf 1突变小鼠或MN小鼠。4D)。促进肿瘤集落增加的一个可能原因是野生型小鼠单核细胞上糖基化终末产物受体(RAGE)的表达。S3b)。RAGE是mrp 8在肿瘤细胞与髓系细胞相互作用中的一种受体。24,32。为了确定RAGE在氧化调节中的作用,我们用RAGE阻断剂FPS-ZM1治疗小鼠。33)。有趣的是,fps-zm1将野生型小鼠的肺定植减少到与Ncf 1突变小鼠S3c,d)。这些结果提示MRP8-RAGE信号可以激活单核细胞支持ROS-足够的中性粒细胞耗竭后的肿瘤定植。

图4:抗Ly6G抗体治疗增加了NCF1表达的中性粒细胞小鼠的肺定植。
figure4

研究用野生型老鼠(Ncf 1+/+.−/−),MN小鼠(Ncf 1*/*.+/+),以及Ncf 1突变小鼠(Ncf 1*/*.-/−)。B16F10细胞于第0天注入小鼠体内,每只小鼠肺内肿瘤集落数于注射后第10天计数。a在注射B16F10细胞后第1、2、5、8天给予抗Ly6G抗体。本研究包括注射抗Ly6G抗体的野生型小鼠(克隆:1A8;n=7)与同型对照(克隆:2A3;nMN小鼠注射1A8(n=6)相对于2A3(n=6)Ncf 11A8注射突变小鼠n=6)相对于2A3(n=6)。b具有代表性的流式细胞仪绘制了肺细胞CD11b、Gr1和Ly6C的图谱。c每只小鼠肺内中性粒细胞计数。d用抗Ly6G抗体注射组与同型对照组比较,计算小鼠肺内肿瘤集落数。所有结果均为均值±扫描电镜。曼-惠特尼U测试*p < 0.05, **p < 0.01.

讨论

自然突变Ncf 1NOX 2复合物导致ROS产生受损的基因对B16黑色素瘤、肿瘤、肺部定植有保护作用。保护被函数的条件表达所逆转。Ncf 1中性粒细胞中的基因。结果表明,中性粒细胞来源的IL-1β能促进B16F10细胞的肺定植.

在转移性定植过程中,肿瘤细胞和浸润免疫细胞均可产生ROS,ROS的位置可能决定了ROS对肿瘤生长的氧化作用。最近的一项研究提供了证据表明,与单细胞相比,代谢的ros支持肿瘤细胞的成群转移过程。34。也可以在肿瘤细胞和中性粒细胞之间形成簇。有报道称中性粒细胞-肿瘤簇显示出扩大B16F10细胞转移潜能的能力。24,但没有讨论ROS的作用。正常情况下,NCF1-NOX2复合物被有效激活,主要作用于中性粒细胞中ROS的产生。在本研究中,我们首次用小鼠模型验证了一个功能的副本。Ncf 1MRP 8启动子驱动的中性粒细胞的基因表达足以提高肺转移灶的水平。

ROS可能影响注射肿瘤细胞与浸润中性粒细胞之间的直接相互作用。B16F10细胞缺乏ICAM-1的表达(参考文献)。35)和IL-1β36,但这两种蛋白质可以发挥促肿瘤作用。24,37,38。中性粒细胞ICAM-1在中性粒细胞-肿瘤细胞集落形成中的作用24。ICAM-1在循环中性粒细胞中不存在或在极低水平上表达,但可能是由某些触发器诱导的。39。在本研究中,我们发现肿瘤相关中性粒细胞在肺中表达ICAM-1和IL-1β.Ncf 1突变小鼠有少量ICAM-1阳性的中性粒细胞.重要的是,IL-1β在组织中性粒细胞中的表达水平通过功能性的条件性敲入而上调。Ncf 1基因。单次注射IL-1β可弥补活性氧缺乏对肿瘤定植的影响,使肿瘤集落增加到较高水平。近年来,有报道称宿主发育中的内皮细胞位点1的缺乏可能促进中性粒细胞在肺转移小生境中的积聚,中性粒细胞释放的ros介导了与b16f10细胞的直接相互作用。40.

中性粒细胞和肿瘤细胞之间的另一个直接相互作用可能涉及B16F10细胞上的RAGE受体,其中MRP 8是一个强有力的配体。41。髓系细胞,包括中性粒细胞、单核细胞和间质巨噬细胞样表型,可能同时表达ncf 1-nox 2复合物和mrp 8,这是指血液肿瘤细胞在肺壁上移植所需的转移前微环境的形成。42。因此,在免疫调节上很难区分中性粒细胞和单核/巨噬细胞。函数表达式Ncf 1CD 68阳性细胞中的基因可降低实验性自身免疫性关节炎模型T细胞的致病性10。在本研究中,我们发现Ncf 1突变不受肿瘤定植的保护,而不受CD 68表达细胞状态的影响。更重要的是,ROS-足够的中性粒细胞与1A8抗体的耗竭很可能触发依赖于ROS的RAGE在Ly6C单核细胞上的表达。

另外,NK细胞在肺定植保护中起着重要的作用。Aydin和他的同事研究了NK细胞在NOX 2-注射抗NK1.1抗体的小鼠模型,发现二盐酸组胺对NK细胞相关的抗转移作用。NOX 2野生型老鼠,但不是在NOX 2-敲除小鼠26,27。Li和他的同事研究了细胞因子G-CSF在肿瘤模型中的作用。SCID和NSG小鼠,提示中性粒细胞介导NK细胞在肺转移中的作用。28。众所周知,在NSG小鼠中,先天淋巴样细胞也存在缺陷。43。为了研究中性粒细胞的重要性,boivin和他的同事发现,在低剂量抗Ly6g治疗后,中性粒细胞甚至可以在血液和脾脏中膨胀。29。NK细胞在肺定植保护中起重要作用,但NK细胞是否参与NCF1-NOX2复合物的保护作用尚不清楚。应指出的是,小复方二盐酸组胺可能对NK细胞无特异性影响,敲除小鼠株与天然突变株也有遗传差异。举个例子,两者NOX 2-击倒老鼠和Ncf 1-据报道,基因敲除小鼠可免于实验性自身免疫性脑脊髓炎。44,但是Ncf 1突变小鼠表现为自身免疫性脑脊髓炎12,45。因此,我们进一步研究了NK细胞在Ncf 1抗NK1.1抗体突变小鼠26。然而,我们发现NK细胞的耗竭,通过抗NK1.1治疗,可以增强肿瘤的转移,而不依赖于Ncf 1突变。

总之,我们使用了自然突变的小鼠模型Ncf 1基因筛选NOX 2复合物缺乏症的细胞类型特异性效应,然后发现只有。Ncf 1中性粒细胞表达可恢复肿瘤定植的易感性。我们发现Ncf 1有能力的中性粒细胞表现出功能性ROS诱导和IL-1β信号传导的能力,可促进肺定植.就像Ncf 1由于氧化还原调节是一个重要的病理生理过程,这一观察不仅对了解肿瘤转移的基础,而且对提高肿瘤治疗水平都有重要意义。


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