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瞄准KRAS4A通过RBM 39/DCAF 15途径剪接抑制肿瘤干细胞

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发表时间：2021-07-21 10:02作者：武汉新启迪Xinqidibio

摘要

一般变异的人类克拉斯癌基因编码差异剪接产生的两种不同的KRAS4A和KRAS4B蛋白。我们在此证明，通过控制剪接来协调调节这两种异构体对于发展中国家来说是必不可少的。克拉斯突变型肿瘤。小调KRAS4A亚型在肿瘤干细胞中富集，在这种细胞中，它对缺氧有反应，而主要的是。KRAS4B是由ER应激引起的。KRAS4A剪接由DCAF 15/RBM 39途径和删除KRAS4A或药物抑制作用RBM 39使用Indisulam会导致肿瘤干细胞的抑制。我们的数据确定了现有的针对这些药物的临床药物。KRAS4A剪接，并建议未成年人的水平KRAS4A人类肿瘤中的异构体可以作为对某些现有癌症治疗方法敏感的生物标志物。

导言

这个克拉斯基因是人类癌症中最常见的突变基因，尤其是在胰腺癌、结肠癌和肺癌中，几十年来一直是肿瘤药物发现的主要焦点。然而，尽管这些巨大的努力，肿瘤携带克拉斯突变仍然是最难治疗的，主要是由于肿瘤细胞的可塑性和/或获得新的突变而产生耐药性。最近描述了在肺腺癌中发现的一种特定突变型KRAS G12C蛋白的主要研究进展。1，但是直接针对克拉斯这将适用于大多数或全部克拉斯目前缺乏突变型癌症。以形成更全面的生物学观。克拉斯发出信号并确定新的方法来抑制克拉斯在癌症中，我们采用小鼠和人类遗传分析相结合的方法来研究这两种已知蛋白质的功能和细胞类型特异性的表达。克拉斯在正常组织和肿瘤发展过程中。

克拉斯最后一个外显子经过交替剪接产生两个异构体，kras4A和kras4b，除了翻译后修饰和细胞内贩运所需的羧基端的22/23氨基酸外，它们是相同的。2。小鼠生殖细胞缺失克拉斯基因导致胚胎死亡3，但仅具体删除Kras4A，通过删除第4A外显子实现4或敲入.Kras4BCDNA(Kras4B基老鼠，从今以后Kras4A−/−)5，对生活能力没有影响，这表明主要的发育功能是克拉斯通过Kras4B等价物。以前已经证明过，老鼠只缺少Kras4A异构体对化学诱导的肺癌具有抗药性。6,7尽管事实是Kras4A仅在正常细胞和肿瘤细胞的亚群体中表达。这些数据导致了以下建议：Kras4A在肿瘤的发展中起着至关重要的作用，可能是通过对少数干细胞群体的影响来实现的。6。随后对来自tcga的人类癌症数据的分析也表明了一个更重要的作用。KRAS4A在人类癌症中比以前被重视，因为一些肿瘤表达出这种“小”的“小”异构体的水平出乎意料的高。8.

在这里，我们设计了一种遗传方法来研究Kras4A和Kras4B老鼠模型和人类癌症。这一分析表明，每一种异构体对于正常小鼠的发育都是可有可无的，但这两种剪接异构体的表达却是相同的。克拉斯启动和生长所需的等位基因克拉斯突变型癌症。通过剪接中断DCAF 15/RBM 39路径表示一种新的目标路径。克拉斯通路。自KRAS4A特别是在具有干细胞特性的细胞亚群中，我们的数据提出了一种模型，在该模型中，癌症干细胞-祖细胞转移的协调可以通过调节克拉斯MRNA拼接，识别克拉斯突变型肿瘤。

结果

协调表达Kras4A和Kras4B是小鼠肺肿瘤发生所必需的。

为了比较Kras4A和Kras4B在肺肿瘤发生中，我们采用了先前发表的策略。5插入Kras4ACDNA进入克拉斯位点，从而产生一个完全缺乏表达的等位基因Kras4B (Kras4B−/−小鼠)(附图。1A-C). Kras4B−/−纯合子小鼠按正常孟德尔比例出生，但不育。Kras4A和Kras4B亚型在正常小鼠组织中的表达符合预期的模式(附图)。1)，从E13.5胚胎中分离出的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)具有较强的EGF诱导的MAPK和Akt激活，说明Kras4A和Kras4B在缺乏替代异构体的细胞中均能被EGF激活(补充图)。2)。这两个基因敲除菌株都经过了6代的杂交。FVB/N背景和注射氨基甲酸酯。治疗后未发现肿瘤Kras4A−/−动物，与先前公布的结果一致6,7。然而，这个实验表明Kras4B−/−纯合子小鼠对肺癌的发展也具有高度的抗药性(图一)。1A-D)。在18人中Kras4B−/−氨基甲酸乙酯治疗纯合子动物，8只分别发展出一个或两个非常小的肿瘤(图1)。1A，B)的顺序克拉斯密码子12、13和61没有突变。因此，消除的效果Kras4B，类似于损失Kras4A，即对化学诱导的肺癌产生抗药性。克拉斯突变。抗性并不是由于基因结构的改变或引入的cdna结构中缺少内含子所致，因为小鼠携带类似的cdna编码。HRAS而不是克拉斯亚型肺癌的发生中，cdna结构中携带了适当的致癌物特异性突变。6.

图1：*Kras4A*和*Kras4B*对于致癌物诱发的肺癌的发展是必不可少的。

任一种肿瘤Kras4A+/−或Kras4B+/−杂合子小鼠全功能野生型等位基因突变(补充表)1)，表示这两个异构体的协调表达来自于同一种异构体。克拉斯等位基因可能是肿瘤发生所必需的。为了验证这种可能性，我们利用双杂合子在肺内进行了致癌研究。Kras4A/4B表达这两种异构体的小鼠，但剪接调节被破坏。特别是用5剂氨基甲酸乙酯、2剂氨基甲酸乙酯和3剂致癌物N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)处理1例双杂合子，以增加突变负担和产生一种或两种亚型突变的可能性。治疗30周后，这些双杂合子动物的肺部没有发现肿瘤。1E)。表达这两种亚型的小鼠，但在不同等位基因上的抗性表明，克拉斯突变必须是内源性的克拉斯能够产生两种剪接变异体的突变体的基因。

双管齐下KRAS4A和KRAS4B致瘤性克拉斯突变型人类癌症

评估致癌物质的功能相关性克拉斯在人癌细胞株中，我们在体外进行了shRNA介导的每种亚型的基因敲除。克拉斯突变型癌细胞株A 549、SUIT 2、YAPC和H 358。我们筛选了几个杂交瘤细胞系，以鉴定一种能检测内源性KRAS4A的抗体(10C11E4)。用KRAS4A特异性抗体10C11E4和KRAS4B特异性抗体(Santa Cruz Kras2b抗体)(补充图)证实了亚型特异性shRNA的特异性敲除。3A)。击倒KRAS4A或KRAS4B在SUIT 2细胞中，软琼脂试验明显削弱了它们形成集落的能力(附图)。3B)。减少KRAS4A或KRAS4BA 549和YAPC细胞对体外生长的影响较小，但对免疫低下小鼠体内生长有明显的抑制作用(附图)。3B、C)，建议，与老鼠的研究一致，两者KRAS4A和KRAS4B是增长所必需的。

接下来，我们使用CRISPR/Cas9技术来生成KRAS4A或KRAS4B在人类克拉斯突变细胞。单导RNA(SgRNAs)被设计成靶向cas 9核酸酶克拉斯人肺癌和胰腺癌细胞株A 549(G12S突变)和SUIT 2(G12D突变)中的4A或4B外显子。移码插入和删除克拉斯第4A外显子或第4B外显子通过等位基因特异性克隆和测序确定(补充图)。4)。我们无法分离出任何纯合子KRAS4B移码突变克隆，并注意到大量减少的菌落增殖超过最初的几个细胞分裂在这个手臂的实验。KRAS4A完全丢失，KRAS4B水平降低。2A)。以确定.的影响克拉斯研究了异型特异性基因敲除对细胞生长、塑料和软琼脂细胞增殖的影响。纯合敲除KRAS4A和杂合基因敲除KRAS4B这两种检测方法都显著降低了生长(图1)。2B-D)。与亲代SUIT 2或A 549细胞相比，裸鼠皮下注射的基因敲除细胞的肿瘤形成能力也受到了损害(图1)。2E)。综合起来，这些数据表明KRAS4A和KRAS4B都是最佳增长所必需的克拉斯突变型肺和胰腺肿瘤细胞体外及在免疫缺陷小鼠中的作用Kras4A在完整的免疫系统中抑制肿瘤的生长仍有待建立。

剪接KRAS4A由rbm 39 rna结合蛋白调节。

因为我们的老鼠遗传数据表明Kras4A和Kras4B来自同一等位基因的异构体对于肿瘤的形成是必要的，我们探讨了小分子抑制剂在剪接位点机制中的不同组分可能影响肿瘤的生长。克拉斯突变肿瘤细胞9,10。我们测试了四种抑制剂KRAS4A/B剪接：唐菖蒲内酯，它的目标是剪接因子SF3B，破坏了剪接复合物组装的早期阶段。11异银杏素，一种生物类黄酮和通用剪接抑制剂12和两个相关的磺胺类药物Indiulam和Tasisulam，最近被证明会导致rbm 39 RNA结合蛋白的蛋白酶体降解和抑制RBM 39-介导剪接13,14。异银杏素对.KRAS4A或KRAS4BMRNA，而角斗士则下调两者的表达KRAS4A和KRAS4BSUIT 2细胞中的剪接变异体(图1)。3A，B)与其在破坏剪接机械方面的一般作用相一致。用Indisulam或Tasisulam治疗，特别是下调KRAS4A，但对KRAS4B(无花果)3A，B)。另外两个细胞系A 549也得到了类似的结果(见图)。3C，D)和AsPC 1(附图1)。5A，B)，建议RBM 39控制KRAS4A水平。在SUIT 2和A 549细胞的蛋白水平上也证实了KRAS4A的下调，但没有KRAS4B的下调。3 E、F和补充图。5C)，以及AsPC 1细胞(附图)。5D).

测试RBM 39是否参与控制克拉斯通过剪接，我们首先证实了Indisulam处理导致SUIT 2和A 549细胞中RBM 39的下调(图1)。3 E、F)。在所有的情况下，KRAS4A的表达在RNA和蛋白质水平降低，RNA结合蛋白RBM 39也减少(图一)。3 E、F和补充图。5D)。这一效应在Indisulam和Tasisulam的所有三种细胞系中都能看到，它们通过与DCAF 15的相互作用而以RBM 39为靶点。13。一般的剪接抑制剂唐菖蒲再一次对4A和4B异构体产生抑制作用(如图所示)。3 E、F).

然后我们生成RBM 39利用CRISPRi/dCas9-KRAB打倒细胞15使用针对RBM 39基因在SUIT 2和A 549细胞中的表达。RBM 39的缺失导致KRAS4A剪接变异水平显著降低，但对KRAS4B没有影响(图1)。第三代)，证明了.的特殊性。RBM 39控制住克拉斯MRNA前剪接。虽然RBM 39导向RNA对A 549细胞RBM 39蛋白表达有显著影响(图一)。第三代MRNA水平的影响较小(补充图)。5E)。这可能反映了RBM 39当蛋白质被耗尽时转录，因为英狄兰治疗令人惊讶地引起了显著的上调。RBM 39MRNA在降低蛋白质水平的同时(例如，比较图)。第三代和补充图。5E)。这种表观反馈控制的进一步研究RBM 39，可能会说明所涉及的确切机制。

Indisulam最初被提议作为CA9(碳酸氢酶9)，参与HIF1a调节缺氧16。然而，CRISPRi/dCas9-KRAB下调了对CA9MRNA(附图)5F)对KRAS4A水平无影响，对Indisulam对KRAS4A水平的影响无影响(图1)。第三代)。当RBM 39影响许多前mRNAs全基因组的剪接，这些数据支持这一建议。13那RBM 39对于剪接机械的一般抑制剂来说，它的生理靶点比预期的更有限，并且建议KRAS4A剪接可由RBM 39。为支持这种可能性，分析了RBM 39基因组范围内的结合位点确定了在克拉斯基因17。其中最重要的标记位于克拉斯接近外显子4A(附图)。6)的候选目标站点。RBM 39可以控制KRAS4A剪接。然而，需要对特定地点的突变进行进一步的详细分析，以验证RBM 39影响KRAS4A直接剪接而不是通过中间蛋白复合物。

以确定indisulam是否能模拟KRAS4A在免疫低下小鼠肿瘤生长缺失的情况下，我们将SUIT 2和A 549细胞注射到NSG免疫缺陷小鼠体内，用Indisulam治疗已建立的肿瘤动物。3H)。两种细胞系在体内均表现出明显的抑瘤作用，但对SUIT 2细胞的抑制作用更为明显(图一)。3H)。其他人也证明了indisulam对植物生长的显著影响。克拉斯突变型HCT 116人结肠癌细胞株的体内研究13.

因此，我们的数据确定了一种现有的药物途径，包括抑制RBM 39，它可以针对未成年人的表达式。KRAS4A等价物。有趣的是，对DEPMAP门户网站的检查表明，来自骨、造血系统、软组织和中枢神经系统等组织的肿瘤细胞中Indisulam活性最高。这些肿瘤细胞株的排名按KRAS4A和KRAS4B事实上，水平表明这些肿瘤类型有最低水平的这一比率(图一)。3I，J和补充图。7A)。确定是否有显著的影响KRAS4A在Indisulam敏感性方面，我们获得了DEPMAP和Indisulam存在下的反复细胞生长试验中的几种细胞株，并直接测量了细胞的表达水平。克拉斯等价物。我们选择了2个血癌细胞系(Jurkat和hl 60，野生型)。克拉斯)，2株肺癌细胞系(NCI-H 661和NCI-H 1703，野生型)。克拉斯)和2株胰腺癌细胞系(YAPC和SW 1990，突变株)克拉斯)用于这些研究。补充图7b结果表明，血液癌细胞对Indisulam的敏感性高于肺癌、NCI-H 661细胞和胰腺癌细胞系，与DEPMAP分析结果一致。YAPC显示KRAS4A水平最高，HL 60细胞KRAS4A/KRAS4B比值低于肺癌和胰腺癌细胞(附图)。7C)，与肿瘤细胞株百科全书(CCLE)的结果一致。Indisulam可下调Jurkat和HL 60细胞的RBM 39和KRAS4A，但不下调KRAS4B(补充图)。7D)。与Indisulam在SUIT 2中的作用相比，Indisulam在较低浓度下下调KRAS4A在HL 60(附图)中的作用。7E)。我们还观察了wt对肿瘤细胞的敏感性。克拉斯用Indisulam治疗，并证明KRAS4A在H 1650细胞中对Indisulam和敲除RBM 39均有下调作用(补充图1)。7F)。因此，我们建议KRAS4A的比率KRAS4A到KRAS4B，可能是对依迪舒兰或其他干扰药物敏感的生物标志物。KRAS4A剪接，但需要更多的临床研究来证实这种可能性。

KRAS4A在具有肿瘤干细胞特性的细胞中富集

上述结果表明，抑制.KRAS4A能影响肿瘤在体内的生长是令人惊讶的，因为事实是KRAS4A水平一般比主要异构体低得多。KRAS4B，和Kras4A仅在正常组织或肿瘤的细胞亚群中表达。6,18。我们检验了假设KRAS4A可能在癌干细胞亚群中优先表达。19,20用一种特征良好的“侧群”细胞分析方法21已经被证明是在干细胞特性中富集的。我们从3种不同的细胞系中分离出侧群体细胞，并分析了侧群体和非侧群体细胞的球体形成效率(附图)。8A，B)。侧群体细胞标记的表达，(ABCG 2)22A 549和SUIT 2细胞以及另一种胰腺细胞的侧群细胞显著升高。克拉斯突变株AsPC 1(图1)4A)。重要的是，KRAS4A表达也在相同的干细胞群体中富集，如对这两种干细胞的TaqMan分析所显示的。克拉斯剪接异构体(图1.4B)。不再表达的纯合敲除细胞KRAS4A有较低比例的侧群细胞，这些细胞可以通过重新引入功能来拯救。KRAS4A表达式构造(图1.4C)。侧群体干细胞标记物醛脱氢酶(ALDH)活性的研究23，也减少了在KRAS4A敲除细胞，并通过重新导入修复。KRAS4A等价物(图1.4D)。与这些意见形成对比的是KRAS4A，无显着性差异。ALDH在减少的细胞中表达KRAS4B杂合基因敲除系(图1.4D)表示KRAS4A，但不是KRAS4B与具有干细胞特性的细胞相连。为了提高侧群体干细胞分离的特异性，我们使用了另外报道的干细胞标记(CD 166和CD 133)和ALDH联合进行FACS分析。CD 133在SUIT 2细胞中有一些额外的富集作用，但在A 549细胞中没有增加，而CD 166在这两种细胞株中都没有改善侧群细胞和非侧群体细胞之间的区别(附图)。8C，D)。最后，根据KRAS4A导向RNA靶向RBM 39(无花果)3)，抑制RBM 39同时降低SUIT 2和A 549细胞中ALDH阳性细胞的比例(附图)。5G).

图4：KRAS4A调节人癌细胞的干细胞特性。

用Hoechst 33342染色法检测A 549、SUIT 2和AsPC 1细胞的干细胞侧群(SP)。A ABCG 23种细胞株的侧居细胞水平均显著升高。数据显示为平均值±S.E.Mn=3项独立实验。*P < 0.05; **P < 0.01 by one-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison. B KRAS4A，但不是KRAS4B侧群体细胞TaqMan分析表明，其水平显著升高。数据显示为平均值±S.E.Mn=3项独立实验。*P < 0.05; **P < 0.01 by one-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison. C, D损失KRAS4A减少侧种群细胞的比例(C)以及ALDH侧群标记(D)。转染a，可恢复侧支细胞比例和ALDH表达水平。KRAS4A荧光活化细胞分选分析表达结构。数据显示为平均值±S.E.Mn=左面板上的7个独立实验C)和n=3个独立的右面板实验C)和(D). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 by Unpaired two-tailed T-测试一下。

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KRAS4A和KRAS4B都是由不同类型的细胞应激引起的

两人的观察克拉斯肿瘤生长需要剪接异构体，提示它们在肿瘤干细胞和祖细胞中可能具有不同的功能。因此我们调查了KRAS4A和KRAS4B可能对不同类型的细胞压力有反应。CoCl处理亲本A 549、SUIT 2和AsPC 1细胞的实验研究2诱导表达增加HIF-1α，一种已知的缺氧标志(图1.5A). KRAS4A，但不是KRAS4B(无花果)5B)表明，由于这种治疗的结果，表达显著增加，增加主要是在侧群体细胞，而不是在大细胞群体(图一)。5C)。肿瘤的快速生长会导致低氧状态，而低氧状态与干细胞活化和代谢重新编程有关。24。相反，内质网应激，已被确定为治疗目标克拉斯突变型癌症25导致ER标记显著增加HSPA 5(亦称GRP 78)和KRAS4B，但不是KRAS4A，在A 549和SUIT 2癌细胞株中均有表达。5D，E)。虽然两人2而衣霉素对低氧和ER应激可能不是完全特异的，这些数据强调了这两种异构体在同一株人肿瘤细胞中对不同类型的应激反应的功能差异。

低水平KRAS4A与细胞周期/有丝分裂标记的表达增加有关。

接下来我们将研究两者的相对表达水平。克拉斯剪接异构体克拉斯突变人肺癌数据集26,27。我们评估了克拉斯人肺腺癌86例26使用TaqMan探针来识别KRAS4A或KRAS4B成绩单。这些肿瘤中有23例发生了突变。克拉斯密码子12或13，其余63在克拉斯密码子12、13和61。Taqman分析显示这两种情况克拉斯和KRAS4A表达显著升高克拉斯肿瘤的突变子集KRAS4B表达无显着性差异(图二)。6A-C)。由于这些样本有基因表达微阵列数据，我们根据它们的基因表达芯片数据将它们分为两个亚组。KRAS4A/KRAS4B成绩单比率(高)n=8)或低(n=7)。补充表2显示在低表达样本中高表达的前100位基因KRAS4A/KRAS4B成绩单比率令人惊讶的是，鉴于图中的数据。2表示删除KRAS4A在体外培养的人肺癌细胞中，对低表达肺癌高表达基因的GO富集分析KRAS4A水平确定与细胞周期、微管组织、有丝分裂和DNA损伤反应相关的途径(补充表)3)。基因集富集分析证实了低水平细胞周期基因的富集KRAS4A/KRAS4B样本(图)6d)。造成这种差异的原因尚不清楚，这可能是由于在体外和体内在增殖和DNA损伤检查点基因的激活上的差异，或者是由于在生长控制方面的根本差异，包括在人体样本中主动免疫系统的作用。这些问题将是今后调查的主题。

我们还分析了克拉斯来自TCGA肺腺癌(LUAD)标本。虽然rna不适用于特定于TaqMan的异构体分析，但RNAseq读取的是交叉剪接的外显子连接。克拉斯用于估计总数的百分比克拉斯成绩单KRAS4A(见方法)。两者均显著增加KRAS4A和KRAS4B在RNAseq数据中发现了转录本克拉斯突变型与WT型肺腺癌(LUAD)肿瘤KRAS4A显示出较高的增幅(1.7倍)KRAS4B(1.2)(附图)9A-C)。这一分析证实，克拉斯突变型肺肿瘤的比例平均较高。KRAS4A到KRAS4B比克拉斯WT肿瘤。Stephens等人最近也报告了类似的结果。28。确定剪接是否向更高的方向移动KRAS4A在其他癌症类型中，这些分析扩展到TCGA胰腺癌(PAAD)和大肠腺癌(COADREAD)RNAseq数据集。29。大幅度增加KRAS4A和KRAS4B表达在克拉斯观察到突变的肿瘤，并有更大的增加。KRAS4A(补充图。9d-i)。占总数的百分比克拉斯成绩单KRAS4A显示出类似的增长克拉斯突变型PAAD和COADREAD，虽然没有达到显著水平，但可能是由于已知的样本数量有限克拉斯突变状态。总之，这些数据表明克拉斯观察到的表达克拉斯突变型癌症不仅是由克拉斯表达，但通过改变剪接有利于增加的比率KRAS4A到KRAS4B成绩单。为了验证补充表中的观察结果2和3低浓度UCSF肺肿瘤有丝分裂/细胞周期途径的富集KRAS4A/KRAS4B比例，我们将现有的TCGA肺癌样本分离成KRAS4A/KRAS4B高(n=7)和低(n=7)组和胰腺癌标本KRAS4A/KRAS4B高(n=9)和低(n(9)分组并检查总RNAseq数据，以了解这些基因表达途径的差异。图形6E、F和补充表4向低层代表过高的路径显示GO富集。KRAS4A/KRAS4B比例亚型，再次证明细胞周期/有丝分裂基因转录本在低水平KRAS4A mRNA的肿瘤中富集。

我们进一步验证了侧群体细胞、干细胞和KRAS4A人类恶性胸膜间皮瘤基因表达分析(GSE 33734数据集)这与观察到的侧群干细胞大多是静止的一致。30，细胞周期标记的表达(7)而与干细胞生长抑制相关的基因(GFI 1和(NDN)侧群细胞增加(附图)。10A-C)22,31,32,33。重要的是，位于KRAS第4A外显子(ILMN_1652104)内的探针在侧群体细胞中也显著高于非侧群体细胞(补充图)。10d). ABCG 2在侧群体细胞中表达也丰富(附图)。10E)，与图中我们的数据一致。4A，B.

这些来自TCGA的人类肿瘤的数据表明KRAS4A体内水平可能与某些药物在细胞周期进展过程中对G2/M检查点的敏感性增加有关。由于这一假说的严格检验将需要新的人类临床研究，我们首先研究了KRAS4A并利用体外细胞培养条件改变了对现有治疗药物的敏感性。利戈瑟蒂34和KG-535靶微管活跃于G2/M细胞周期检查点，但也具有其他活性36,37。这些药物对父母和儿童生长的影响没有差异。KRAS4B击倒细胞，但是KRAS4A敲除SUIT 2细胞对这两种化合物的敏感性增强(图1)。6g，H)。这些数据支持了抑制KRAS4A在体外可以提高对已知癌症治疗学子集的敏感性，但需要使用小分子库或crispr/ca 9方法进行深入筛选，以确定可能依赖于KRAS4A/KRAS4B水平。

讨论

KRAS4A和KRAS4B在肿瘤发展中的重要作用

瞄准克拉斯癌症治疗的途径尤其具有挑战性，尽管在导致肿瘤激活的基因改变和由激活的RAS癌蛋白驱动的信号网络方面积累了大量的知识。由于缺乏对突变型RAS蛋白的直接抑制，导致了对下游RAS效应的关注，并确定了许多已获批准或目前正在临床试验中的靶向药物。38。在所有有针对性的癌症治疗方法中，包括以KRAS为靶点的治疗方法中遇到的一个主要问题是耐药性的发展，不同的原因是产生了规避药物暴露影响的新突变，或者干细胞可塑性导致了新的细胞命运，失去了对原始驱动突变的依赖。39。这里提供的数据帮助我们解决这些主要问题，采取综合的方法来理解这两种蛋白质的生物学功能。克拉斯位点，而不是只专注于表达得更丰富的异构体。将老鼠和人类遗传方法结合在一起，我们就可以确定一种新的瞄准目标的途径。克拉斯在表达水平上通过抑制KRAS4A剪接，并通过证明这两种剪接变异蛋白由克拉斯位点主要在不同的干细胞和祖细胞中表达。这种细胞异质性是克拉斯突变的肿瘤19，20，38有助于细胞可塑性，影响治疗反应和耐药性的发展。

的两个不同异构体的存在性克拉斯已经知道很多年了，但是几乎所有的研究都是关于克拉斯专注于KRAS4B在多种组织中广泛而丰富地表达的亚型。双管齐下Kras4A和Kras4B在小鼠肺中致癌的起始和/或进展需要异种形式，因为只有在至少有一种功能的动物中才能诱发肿瘤。克拉斯能够同时表达这两种蛋白质的等位基因。双杂合子Kras4A/4B小鼠也极具抗药性，即使在致癌物剂量显著增加的情况下也是如此，这表明从同一等位基因中产生两种异构体的协调剪接是肿瘤发生所必需的。

在老鼠身上、Kras4A在多能胚胎干细胞的分化过程中表达，并在成人组织中的一部分细胞中表达。18，增加了这样的可能性Kras4A在一小部分具有干细胞特性的细胞中具有特定功能。6。与这种可能性相一致，人类KRAS4A，但不是KRAS4B，富集于来自人癌细胞株的干细胞样侧群细胞中.损失KRAS4A，但不是KRAS4B，导致具有侧群体特征的细胞比例下降，以及ALDH活性下降，这是已知的这些细胞的标记。此外，已知的低氧状态会导致干细胞的重新激活，导致KRAS4A，但不是KRAS4B。我们建议克拉斯产生4A和4B亚型可能是控制干细胞和祖细胞的应激反应和增殖或代谢需要的关键事件(图1)。7)。事实上，癌症干细胞和祖细胞在其生长和代谢倾向上表现出了差异。20,40肿瘤干细胞也与耐药性的发展有关。41.

图7：控制干细胞转化的模型KRAS4A/4B剪接。

KRAS4A在肿瘤干细胞中富集，而KRAS4B在干细胞和祖细胞中广泛表达。对…的表达的调节KRAS4A，部分通过DCAF 15/RBM 39剪接复合物，帮助调节与癌症干细胞-祖细胞转移相关的应激反应。KRAS4A/KRAS4B比值较低的细胞对某些肿瘤治疗药物具有较高的敏感性。

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磺胺类药物indisulam已经在各种癌症临床试验中进行了几年，但直到最近证明它可以通过与dcf 15结合而诱导rbm 39 rna结合蛋白降解，它的具体目标才为人所知。13,42。的下游机制和目标RBM 39一直不清楚，但我们在这里证明了RBM 39损失是对未成年人的抑制KRAS4A等价物。CRISPRi介导的抑制RBM 39减KRAS4A水平，以及在人癌细胞株中的侧群干细胞的比例。当RBM 39显然转录组中还有其他的剪接目标，这些数据将一个可药物的途径与靶向性的克拉斯表情。

这些结果有几个可能的临床应用。水平KRAS4A，和/或KRAS4A/KRAS4B比率，可能是预测对已知癌症药物的反应的生物标志。支持这一可能性的证据可以在现有的数据集中找到，例如，DepMap和CCLE资源涉及人类肿瘤细胞株的肿瘤药物敏感性。水平KRAS4A而KRAS4A/KRAS4B从骨、神经元、造血/淋巴样组织衍生的肿瘤中，该细胞系的比率较低，但在肺、胰腺和肠的上皮性肿瘤中则明显较高(图一)。3)。造血、淋巴和神经元肿瘤细胞系对包括rigosertib和indisulam在内的几种细胞癌治疗药物的敏感性最高，尽管这些药物的非靶点效应使这些结果的解释变得复杂，这些药物被报道能抑制包括微管和细胞周期素依赖激酶在内的多个靶点。43。因此，目前的数据不能使我们得出结论，认为药物的作用是低的。KRAS4A水平，G2/M检查点的抑制，或两者的结合。之间的关系KRAS4A在完整的免疫系统存在的情况下，体内的水平、细胞增殖和DNA损伤反应也有待澄清。

抑制KRAS4A通过对RBM 39拼接机的干扰13，或直接抑制寡核苷酸类药物的剪接作用。44，如图中的基因实验所示，可能揭示出对现有药物的新的脆弱性。6。Indisulam介导的抑制KRAS4A这是朝着这一方向迈出的重要一步，尽管这种药物显然还有其他的靶点，而且组合疗法的可能性可能有限。将需要进一步的筛选，以确定可能对癌症干细胞群产生最佳影响的药物组合，从而为以下方面提供更有效的治疗方法：克拉斯突变型肿瘤。