TNBC DNA修复途径的激活 乳腺癌的临床表现与高增殖活性有关。 18 和突变负担 19 ,20 。我们利用癌症基因组图谱(Tcga)数据探讨了复制相关基因(Rrgs)在乳腺癌(Bc)亚型中的表达。 21 。基因组数据显示，TNBC/Basal样癌(TNBC后)高表达RRGS(S期和M期细胞周期)； t -测试 P < 0.001), indicating elevated replication activity (Fig. 1A，b 和补编。无花果。 1A )。DNA复制消耗大量的能量和核苷酸资源。 22 ,23 ，并可能导致核苷酸库失衡，造成复制压力和增加突变负担。 22 ,24 ,25 ,26 。与此相一致的是，TNBCs表现出较高的突变负担，而只有低RRG表达的腔A型肿瘤突变负担明显降低(如图所示)。 1C , t -测试 P < 0.001). Metastatic TNBCs also showed higher mutational burden compared to other BC subtypes20
图1：TNBC中DNA复制和DNA修复途径的激活。 a , b 复制相关基因(S期和M期)在乳腺癌亚型(TCGA BC数据集)中的表达。基因列表是使用Cyclebase_3.0数据库设计的。 c 乳腺癌亚型的肿瘤突变负担(TCGA BC数据集)。 d MMR和BER通路评分按PAM 50分级。基因列表来源于KEGG。 e 在以TNBC/Basal样癌为主要特征的p53突变型肿瘤中，BER和MMR通路中单个基因的表达增加(黄色框突出显示)。
TNBCs表现出C到T转变的普遍现象。 8 ，通常与核苷酸的错误结合或修饰有关。 27 。错配或修饰的核苷酸通常由dna修复机制如错配修复(Mmr)和碱基切除修复(Ber)去除，而这些机制中的活性不足或基因改变可能会增加突变负担。 27 ,28 ,29 。为了解决这个问题，我们评估了BER和MMR基因的基因组数据。非监督聚类结果表明，TNBCs与其他亚型相比，BER和MMR基因的表达水平最高。无花果。 1B )，MMR与BER基因集之间有较高的相关性( ρ =0.88，图1。 1D )。这些结果表明，随着BER和MMR途径的增加，TNBCs具有较高的复制活性。
值得注意的是，BER和MMR基因在p53突变型乳腺癌中的表达较高(图一)。 1E 和补编。无花果。 1C )，而这些修复基因的基因改变并不常见(图中所示)。 1E )。DNA糖基酶参与了尿嘧啶和碱基修饰核苷酸的修复，即Tdg、TDG和MUTYH在TNBC中的高表达。 1E )。这些数据表明，p53突变体(P53mt)癌可能在BER和MMR机制中发生失调或障碍，即使在DNA修复基因没有基因改变的情况下也是如此。这一观点得到了p53 mt乳腺癌高突变负担的支持。无花果。 1E )和p53在DNA修复中的关键作用 15
Ber介导的p53突变乳腺癌细胞DNA修复 P53功能受损的肿瘤的特征是C到T转变水平增加。 30 。错配的核苷酸和indels都是在DNA复制过程中产生的，可以通过MMR机制去除。Mmr缺陷癌的突变特征是微卫星不稳定，这是修复缺陷的结果。 31 。相反，BER系统移除导致C到T转变的dna碱基损伤，如脱胺(尿嘧啶)、氧化(如8-氧鸟嘌呤)或烷基化(如3-甲基腺嘌呤和6-乙基鸟嘌呤)。 32 。基于这一理论，我们检测了一株携带突变型p53(R280 K)的乳腺癌MDA-MB-231细胞株和一株携带野生型p53的正常乳腺上皮MCF10A细胞系的BER修复能力。根据基因组数据，这两种细胞系在BER或MMR通路上都没有遗传改变；而MDA-MB-231细胞与MCF10A细胞相比，表达了较高水平的糖醛酸和RRGs(补编)。无花果。 2 ).
5-乙炔基-2‘-脱氧尿嘧啶(EDU)在5-乙炔-2’-脱氧尿苷(EdUrd)脉冲作用下，在不同的冲洗时间点测定基因组5-乙炔基-2‘-脱氧尿嘧啶(EDU)，评估BER介导的修复。 2 )。用荧光载体标记基因组EDU，然后用流式细胞术或显微术对其进行标记。P53wt和p53mt细胞均含有相当水平的EDU，并与核糖核酸还原酶抑制剂羟基脲(一种核糖核酸还原酶抑制剂)共同孵育，阻断EDU掺入DNA(补编)。无花果。 3A )。流式细胞仪显示 + Mcf10a细胞24 h后，mda-mbb-231细胞保留了edu。 + 长时间的分数(如图所示)。 2A，b )。荧光显微镜证实了这一发现。无花果。 3B，c )。因此，这两种方法都表明，非肿瘤性p53wt细胞有效地去除了DNA中的尿嘧啶类似物，而在p53mt癌细胞中，这种活性则降低了。
图2：BER去除非肿瘤和肿瘤细胞基因组乙炔脱氧尿嘧啶(EDU)。 a , b 用5-乙炔基-2‘-脱氧尿苷(EDURD)脉冲标记乳腺癌细胞株p53wt MCF10A和乳腺癌细胞系p53mtMDA-MB-231。固定细胞，用Click-it化学染色，用Hoechst流式细胞仪检测DNA含量。EDU阳性人群按初始水平进行评分。 c 中处理的细胞的细胞周期数据( a ). d 埃杜 + 减少Hoechst荧光的细胞(左上四分位数)。用对数秩检验(*)进行了比较。 P < 0.05; **, P < 0.01). e 方案说明了EdUrd诱导的BER介导DNA修复的无效循环模型和p53的作用。 f MCF10A和MDA-MB-231细胞经2 h EdUrd-脉冲处理后免疫印迹数据(P)，在无EDUrd培养基中洗涤和孵育48h后24−。
我们注意到 + 在p53mt细胞中的比例增加了~25%。 P < 0.05) at 24 h after EdUrd-pulse (Fig. 2A，b )，根据细胞周期数据，在p53wt MCF10A细胞中观察到DNA复制并没有停止(图1)。 2C )。P53mt细胞基因组edu的增加可能是由BER介导的修复周期引起的，这是氟化尿苷类似物的一种众所周知的现象。 33 。EdUrd和氟化类似物(EdUMP和FdUMP)的单磷酸代谢物对胸苷酸合成酶的抑制作用 34 ,35 ，从而刺激尿苷类似物掺入DNA，进而激活BER修复。 33 ,36 。多周期的BER修复会导致apyrimidine位点的积累(图1)。 2E )，A-T对断裂，DNA断裂 33 。这一观点被Hoechst染料验证，该染料选择性地结合到A-T丰富的区域。 37 。流式细胞术显示EDU的扩增 + P53mtMDA-MB-231细胞24h内低Hoechst荧光组分(图1)。 2A-d )，表明Hoechst与DNA结合的减少与A-T对的断裂一致。其次，我们证实了突变型p53(R273H)MDA-MB-468和野生型p53 CAL 51(Supl)在TNBC细胞中的这些发现。无花果。 4 )。突变型p53细胞与p53wt CAL 51细胞相比，在基因组EDU去除和Hoechst荧光转移方面表现出明显的延迟，表明A-T对断裂。无花果。 4C，d ).
通过检测sr 139(γh2ax)标记dna双链断裂(Dbs)的h2ax磷酸化来评估dna的损伤。 38 。在p53wt MCF10A细胞中，EdUrd脉冲引起γH2AX水平的短暂升高，而p53mMAD-MB-231细胞在48h积累DNA损伤。 2F )。在p53wt细胞中，EdUrd-脉冲激活p53(膦-Ser15)，增加p53转录靶点p21的水平，而p21在p53mt细胞中不被诱导。与此相一致的是，EdUrd脉冲阻断了p53wt MCF10A细胞的复制，而p53mtMDA-MB-231细胞则维持在S期。 2C )。值得注意的是，EdUrd-脉冲在MDA-MB-231细胞中引起了TS抑制复合物的短暂形成，表明TS的迁移率发生了改变，此后6小时，这一活性下降了(如图1所示)。 2F )。TS的抑制与γH2AX和p53的激活暂时分离，提示p53的激活是由DNA损伤信号介导的。
综上所述，这些数据表明，p53 wt细胞有效地去除基因组乙炔-尿嘧啶通过BER机制。同时，EdUrd-脉冲诱导p53wt细胞p53−p21轴和G1期阻滞。相反，根据流式细胞术和γH2AX数据，p53mt癌细胞并没有停止DNA复制，这导致了基因组尿嘧啶类似物的积累和DNA损伤的增加。 2A，f )。Hoechst流式细胞仪数据表明，这种反应与DNA修复无效有关。 33 P53、−、p21轴不活跃导致DNA复制持续。
P53−p21轴限制脱氧尿苷类似物引起的DNA损伤 接下来，我们测试了持续使用EdUrd或临床脱氧尿苷类似物是否会选择性地引起p53mt细胞DNA损伤。EdUrd诱导MCF10A细胞在24h时表达p53−p21轴和γH2AX水平，而γH2AX水平在48h时下降，p53mt癌细胞则随γ损伤信号的持续积累而反应。 3A )。EDURD诱导两种细胞系P53磷酸化，而TS抑制复合物仅在p53mtMDA-MB-231细胞中诱导。 3A )。氟尿苷(5-氟-2‘-脱氧尿苷，FdUrd)是一种临床相关的脱氧尿苷类似物，可引起p53−p21轴的短暂损伤和活化，而p53mt肿瘤细胞则随着EDURD的观察积累了DNA损伤信号。 3B )。这些结果在小鼠乳腺癌P53 wt(EMT 6)和p53-NULL(4T1)细胞系中得到了证实。 3C )，均建立了TNBC模型。在p53wt癌细胞株、乳腺癌细胞CAL 51(TNBC)和肺癌A 549中的进一步试验表明，p53−p21轴被激活，并出现短暂的DNA损伤(如图所示)。 3D，e )。相反，携带突变型p53-R273H的乳腺癌(TNBC)MDA-MB-468细胞株在FdUrd作用下积累了DNA损伤(见图)。 三维空间 ).
图3：p53−p21信号转导控制脱氧尿苷类似物的损伤。 乙炔脱氧尿苷(EdUrd，5 M)反应的免疫印迹分析( a )或氟化尿苷(5-氟-2‘-脱氧尿苷，FdUrd，5 M)( b −e )在p53wt MCF10A、CAL 51、EMT 6和p53mtMDA-MB-231、MDA-MB-468和4T1细胞中。细胞经3M Nutlin-3A(N3)处理。 d ). f , g MCF10A细胞p53−p21轴失活与p53mt癌细胞的反应相似。 f 将siRNA转染MCF10A细胞，转染p53或置乱对照siRNA，然后用5M FdUrd处理6−。 g 细胞经5M FdUrd或1M阿霉素处理24−48h后，分别进行RAD 51(红色)、γH2AX(绿色)和dna(Hoechst，蓝色)染色；600×放大成像；标度20m。γH2AX和RAD 51病灶对mcf10A和md-md-231细胞的反应评价(5 M FdUrd)。 h ，6−48h； i ，24−48h)。 h 用γH2AX细胞荧光强度测定校正后的细胞总荧光，每组至少有4个随机场(>20细胞/组)。图中有代表性的散点点图。比较采用对数秩检验(*， P < 0.001; **, P < 0.01).
然后，我们检测了p53−p21轴在p53wt细胞中的失活是否会导致FdUrd损伤的积累。P53参与DNA修复的多个方面，包括BER。 15 ,39 ，而cdk抑制剂p21通过与增殖细胞核抗原(PCNA)结合，抑制dna复制，介导G1和ina-S阻滞，从而引起dna损伤。 40 。此外，p21还可能调节细胞周期和dna修复途径。 41 ,42 。如所料，siRNA耗尽p53后，FdUrd在MCF10A细胞中诱导p53−p21轴(如图所示)。 3F )。重要的是，FdUrd处理后，P53缺失细胞对DNA损伤(γH2AX)发生了反应，而杂乱对照细胞则表现出γH2AX在时间上的增加和p21的诱导(如图所示)。 3F ).
接下来，用p21敲除(Ko)MCF10A细胞检测p21的作用。 43 。FdUrd处理可诱导对照组和p21ko细胞磷酸化和P53总水平，而p21仅在正常细胞中诱导(Suppl)。无花果。 5 )。FdUrd诱导p21wt细胞瞬时DNA损伤，而p21ko细胞积累DNA损伤。我们证实p53通过nutlin-3A调节p21ko细胞中mdm 2等转录靶点的能力，从而破坏p5 3−mdm 2的相互作用。 44 。Nutlin-3A激活p21wt和p21ko细胞中的p53，增加MDM 2水平，但不引起DNA损伤。无花果。 5 )。注意，Nutlin-3A没有增加p53wt和突变细胞的DNA损伤(见图)。 三维空间 ).
通过对γ、H2AX和RAD 51病灶的显微观察，证实了FdUrd引起的DNA断裂。 3G，h )是围绕DNA断裂形成的 38 。γH2AX荧光定量显示p53wt MCF10A细胞24 h荧光强度短暂增加，而p53mt-md-MB-231细胞荧光稳定积累。 3H )。同样，FdUrd在p53mt癌细胞中强烈诱导RAD 51灶的细胞比例，而在p53wt细胞中RAD 51病灶的诱导是短暂的，在较少的细胞中，表明DNA断裂修复。 3I )。因此，研究结果表明，非肿瘤细胞p53−p21轴失活可使p53mt癌细胞中脱氧尿苷类似物的损伤反应再现，而p53mttnbc细胞株则在脱氧尿苷类似物作用下积累DNA断裂。
PARP抑制p53−p21信号转导 其次，我们质疑DNA修复过程中的干扰是否会进一步增强脱氧尿苷类似物对p53mt细胞DNA损伤的选择性积累。BER机制去除细胞和线粒体dna中的修饰核苷酸，包括乙炔基和氟脱氧尿苷类似物。 45 。DNA糖基化酶(如：糖基酶)识别并切除受损的碱基 46 ，启动修复过程(如图所示)。 4A )。产生的a-嘧啶位点(AP-位点)然后被AP-内切酶APE切割，引入单链DNA断裂，然后被多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)结合，从而启动恢复原始DNA序列的酶的合成(如图所示)。 4A )。抑制PARP可阻断DNA修复，导致DSBs和细胞死亡。 47
图4：PARP 1-抑制剂诱导p53wt细胞p53−p21轴和细胞周期阻滞。 a BER介导的尿嘧啶类似物的去除及PARP 1的作用。PARP抑制可能激活p53。PARP抑制剂olaparib处理MCF10A(P53wt)和md-mB-231(P53mt)细胞的免疫印迹 b )或他拉唑帕林( c )在指示浓度下持续24小时。 d PARPI、他拉佐瑞(10、50和100 NM)、奥拉帕瑞布(200和500 NM)或车辆控制48h后，MCF10A和MDA-MB-231细胞的细胞周期数据。
首先，我们测试了p53mt细胞与p53wt细胞相比，是否表现出对PARP抑制剂(PARPI)的不同反应。PARPI、olaparib对两种细胞在100−1000 nm下的聚-ADP-核糖基化(PAR)活性均有抑制作用(图1)。 4B )。尤其是PARPI诱导MCF10A细胞p53−p21信号转导，而p21在p53mt-mDA-MB-231细胞中不受调控。 4B )。这些发现被高度有效的，但在结构上不同的，PARPI他拉佐巴验证了。 48 。他拉唑巴利能在50 nm时抑制PAR的活性，并能有效地诱导这两种细胞系中的Ser 15-p53磷酸化，而p21仅在p53wt细胞中被发现(见图)。 4C )。PARP抑制剂对p53−p21轴的诱导作用在p53wt细胞株A 549、CAL 51和WI-38中得到进一步证实。无花果。 6 )。根据对γH2AX水平的评估，PARP抑制剂没有引起p53wt和p53mt细胞DNA损伤。 4B，c 和补编。无花果。 6 )。细胞周期数据显示，PARPI增加了p53wt细胞的G1比例。 4D ，与p5 3−p2 1轴的激活相一致(图1)。 4B，c )。在p53mt癌细胞中，PARPI(olaparib和talazoparib)均以S期为代价增加G2部分，提示PARPI在p53mt癌细胞G2期阻滞。 4D )。结果表明，PARPI激活p53−p21轴，使p53wt细胞G1期细胞数增加，而这种反应在p53mt细胞中减弱，导致G2阻滞。
抑制PARP对p53突变型癌细胞DNA损伤的影响 然后，我们研究了PARP抑制是否增强了p53mt细胞对类似物的DNA损伤，而通过诱导p53−p21轴来减轻p53wt细胞的DNA损伤。为了验证这一观点，细胞单独使用FdUrd或与PARPI联合处理，阻断PAR的活性。在p53wt细胞株MCF10A和A 549中，PARPI单独刺激p53−p21信号转导，但不诱导γH2AX的明显水平，而FdUrd激活p53−p21轴，引起γH2AX水平的短暂升高。 5A-d )。FdUrd-PARPI组合在p53wt MCF10A，A 549中可减弱DNA损伤反应。 5A-d )和EMT 6细胞系(补编)。无花果。 7A )。在p53mt细胞系(MDA-MB-231、MD-MB-468和BT 549；ALL TNBC)中，FdUrd诱导的γH2AX和PARPI强烈增强了这一反应(如图所示)。 5B，c-e )。在p53mt细胞株中，两种处理均未增加p21的表达。
图5：PARP 1-抑制剂增强FdUrd诱导的p53−p21信号转导缺陷细胞的DNA损伤。 a −e P53wt(MCF10A；A 549)和p53mt(MDA-MB-231、MDA-MB-468和BT 549)、0.5M olaparib(Ola，O)、5 M氟尿苷(FdUrd，F)或它们的组合(FO)的全细胞提取物免疫印迹。 f 对照组和p21-缺失的MCF10A细胞用100 NM他拉唑巴利(T)、5 MFdUrd(F)或它们的组合(FT)处理。 g , h γH2AX病灶的检测 a )。γH2AX(红色)和dna(Hoechst，蓝色)染色，在600×放大、标度20m处拍摄图像，用γH2AX荧光法测定至少30细胞/组的校正后细胞总荧光(CTCF)。图中有代表性的散点点图。比较采用对数秩检验(*， P < 0.001).
然后，在p21ko MCF10A细胞中检测其对药物组合的反应。他拉唑巴利(Talazoparib)、福德乌尔(FdUrd)或二者联合可明显诱导对照组MCF10A细胞p53−p21信号转导，但对γH2AX水平的影响有限(图1)。 5F )。在p21-缺失的MCF10A细胞中，药物组合可诱导γH2AX水平，而每种药物单独激活p53的水平与对照MCF10A细胞相当(图一)。 5F ).
对γH2AX病灶的显微观察证实了药物组合对DNA损伤的诱导作用。FdUrd可诱导p53mt细胞γH2AX灶，而PARPI作用有限(图1)。 5G，h )。PARPI-FdUrd联合作用进一步增加了p53mt细胞中的γH2AX病灶，但对p53wt细胞无明显影响(图1)。 5G )。γH2AX荧光定量证实了p53mt癌细胞相对于p53wt细胞的DNA损伤积累。 5H )。结果表明，PARP抑制与脱氧尿苷类似物协同诱导p53mt细胞DNA损伤，促进p53−p21信号转导。
脱氧尿苷类似物与PARP抑制剂对p53mt癌细胞的协同毒性作用 为了确定FdUrd-PARPI联合作用对p53mt细胞DNA损伤的增强作用，我们研究了PARPI和尿苷类似物是否在细胞毒性反应中起协同作用。PARPI、olaparib和talazoparib对MDA-MB-231(17.63；1.08 M)、MDA-MB-468(17.27；1.36 M)和MCF10A(14.45；1.59 M)细胞株的IC 50具有可比性。 6A )；这些系携带野生型BRCA 1/2基因。对BRCA 1缺失细胞株(<1mM)的IC 50值明显超过IC 50，对PAR活性有抑制作用的EC 50(1-10nM)。 47 以及细胞培养(图1. 4 ，50−100 nm)。在PARPI浓度下联合尿苷类似物进行细胞毒性试验，抑制PARPI的活性(如图所示)。 4B，c )，但不影响p53mt细胞的生长。 4D ).
图6：PARP 1-抑制剂增强脱氧尿苷类似物对p53突变肿瘤细胞的杀伤作用. a , d PARP抑制剂(PARPI)、olaparib和talazoparib的细胞毒性曲线。 b 氟尿苷(FDU)单独及在0.5mg/L大拉帕瑞布存在下的细胞毒性曲线。 c PARPI(0.5M)对5-氟尿嘧啶(5FU)对p53wt和p53mt细胞的细胞毒性无增强作用。 e PARPItalazoparib(100 NM)增强氟尿苷(FDU)对p53突变型癌细胞株(MDA-MB-231；MDA-MB-468)的杀伤作用。 f 氟尿苷等比浊法 Y -轴心)和他拉唑巴布( X -轴)和平均组合指数(CI-指数)。 g PARPI(100 NM)增强TAS 102(5-三氟嘧啶和噻哌拉西)对p53mt癌细胞的杀伤作用，CI<0.20。在6个重复的细胞毒性试验中至少重复两次。
我们发现，PARPI olaparib使p53mt癌细胞对FdUrd的致敏率接近10倍(图1)。 6B 和补编。表 1 )。MDA-MB-231的组合指数(CI-index)为0.15，MDA-MB-468的CI=0.16，表明FdUrd与PARPI具有协同作用。这些药物在乳腺癌P53-NULL 4T1细胞中也起协同作用。表 1 )。与之相反，药物在p53wt细胞株(CI>1.0)：MCF10A、WI-38、EMT 6和CAL 51中无协同作用(图1)。 6B 和补编。表 1 )。值得注意的是，5-氟尿嘧啶(5 FU)与PARPI olaparib在任何被测细胞系中均无协同作用(图1)。 6C 和补编。表 2 ).
用PARPI塔拉唑比进一步验证了FdUrd与PARPI的协同作用。在p53mt细胞株中，FdUrd和talazoparib具有较强的协同作用(CI<0.2)，而MCF10A细胞则无协同性。 6E ，CI=1.07)。等比目图数据表明，FdUrd和PARPI在p53mt细胞中具有很强的协同性，其基础是所有实验值在0.75截止线以下的位置(图1)。 6f )。接下来，我们研究了PARPI与TAS 102的协同作用，TAS 102是一种新的抗癌药物，由三氟胸苷(TFT)和噻匹拉希组成。 49 。TAS 102与他拉唑比在p53mt细胞中有较强的协同作用(CI<0.2)，而在p53wt MCF10A细胞中无协同作用。 6g CI=0.99)。TAS 102与olaparib在p53mt细胞中也有协同作用，而在p53wt细胞中则不起作用(补编)。表 3 )。免疫印迹进一步证实TAS 102可诱导MDA-MB-231细胞的DNA损伤(γH2AX)。无花果。 7b ).
为了评价药物组合的毒性作用，我们测定了细胞裂解液中caspase-3/7的活性。用FdUrd和olaparib联合处理p53mtMDA-MB-231细胞，与对照组和单独用药相比，对caspase-3/7活性有明显的促进作用(补编)。无花果。 7C )。TAS102-talazoparib组合可显著提高p53mt细胞的caspase-3/7活性，而对p53wt MCF10A细胞无诱导作用(补编)。无花果。 7D )。因此，数据表明，PARPI选择性地使p53mt癌细胞对脱氧尿苷类似物的细胞毒性作用敏感，同时降低了它们对非肿瘤p53wt细胞的毒性。
抑制PARP增强p5 3突变型tnbc模型TAS 102的抗肿瘤活性 观察TAS 102/PARPI联合应用于以TNBC为代表的MDA-MB-231小鼠乳腺癌模型的疗效。将细胞植入SCID小鼠乳腺，一旦原发肿瘤达到100 mm，即开始治疗。 3 。与对照组相比，PARPI对肿瘤生长没有影响(图1)。 7A )。这一结果与基于基因组数据的BRCA 1/2和其他HR修复基因没有基因改变相一致。单用TAS 102可以减少肿瘤的生长，而小鼠的体重并没有减少，说明这种治疗是耐受性好的(图一)。 7a，b )。值得注意的是，与单纯TAS 102相比，TAS 102-olaparib联合应用进一步降低了肿瘤的生长。 7A )，而这种药物组合的耐受性很好，但小鼠体重没有明显变化(如图所示)。 7b )。值得注意的是，与单用药物相比，这种药物组合显著增加了肿瘤异种移植中的细胞死亡(活性caspase-3)(图1)。 7C , P < 0.01). Evaluation of survival, based on time-to-arrive at 300 mm3 肿瘤体积，有统计学意义的改善( P < 0.01) in the combination group compared to TAS102 alone (Fig. 7D )。免疫组化证实肿瘤细胞摄取TAS 102。无花果。 8A )联合治疗可增加DNA损伤(γ，H2AX)，降低肿瘤细胞增殖(Ki 67)(P<0.01)。无花果。 8A )。组织学检查显示，对照组、单用大鼠和单用TAS 102组均有肺转移，而联合治疗组无转移(增生性)。无花果。 8B )。这些发现表明，药物组合在减少原发肿瘤生长和肺转移方面比单一药物更有效。
图7：TAS 102和PARP 1抑制剂olaparib联合全身治疗可减少肿瘤的生长和转移。 a 将乳腺癌细胞MDA-MB-231移植到雌性BALB/c小鼠体内。肿瘤大小100毫米 3 将小鼠随机分为4组，每天口服奥拉哌利布50 mg/kg，TAS 102单用50 mg/kg，TAS 102+奥拉帕瑞布联合用药(50 mg/kg，每剂50 mg/kg)。每周测量肿瘤大小2次。用对数秩检验(*)进行了比较。P < 0.05). b 每周测量两次小鼠体重。 c 免疫组化法检测caspase-3活性。 d 根据300 mm到达时间，用Kaplan−Meier估计器进行生存评估。 3 肿瘤大小。中位生存期21天(车辆和大鼠)，25.5天(TAS 102)，32天(TAS 102+olaparib)。用对数秩检验( P < 0.01). e 脱氧尿苷类似物(如含有三氟甲基脱氧尿苷(TFT/TFdU)的TAS 102与噻螺环腈)与PARP抑制剂(即olaparib或talazoparib)在选择性损伤p53mt癌细胞中的协同作用模型。
