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发光测定法

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发表时间:2019-08-07 15:39作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

发光测定法


发光测定法

发光测定法(luminescent assay,LA)是继免疫酶测定、免疫荧光测定和放射免疫测定之后发展起来的又一项新技术。根据其发光原理不同,又分以下两种技术类型:

(一) 生物光技术 生物光技术(bioluminescene technique)又称荧光虫荧光素酶(fireflyluciferase)测定法。该法虽然早在1964年即由Chappelle和Levine等用于细菌诊断的研究,但由于被检标本中有时存在大量的非细菌性ATP和其他物质的干扰,致使本法获得的结果难以与常规法的结果作比较,因而影响了它的推广应用。

近年来,由于仪器制造和检测方法等方面均作了重要改进,使其益加完善,才使得这一方法重新受到重视。现已证明生物光检测法的敏感性极高,用以检测含菌数量少的标本是很有意义的。

    1. 生物光技术的基本原理ATP普遍存在于包括细菌在内一切活细胞内,而且每一种细菌所含的ATP,均有一个非常狭窄的范围,从而使ATP的存在,成为检测标本中有无细菌存在的最好依据,因为对ATP不能直接作检测,须要转变成光能后才可以作测定,该法的反应式如下:


E+ATP+LH2Mg2+E·LH2·AMP+PPi(1)

E·LH2·AMP+O2氧化荧光素+AMP+CO2+光(hr,λmax=562nm)(2)

(1)式中E(荧光素酶)在Mg2+存在的条件下,与LH2(发光荧光素)和ATP结合,形成荧光素酶-发光荧光素-单磷酸腺苷的复合物(E·LH2·AMP)和PPi(焦磷酸盐)。

(2)式中的O2与所产生的E·LH2·AMP结合,产生可测出的hr(冷光)、CO2、AMP和氧化荧光素。在上述反应的过程中,产生的总光量取决于荧光素酶、发光荧光素、O2和ATP的浓度。当所有的其他反应物达到一定数量时,发出的总光量和最大光强度则需要约30分钟。因此,在检测时,以最大光强度作为细菌的ATP含量加以测定。

   2. 生物光技术的应用可用于血培养物标本及菌尿症标本等的检测。

   3. 生物光技术的特点本法的最大特点是具有极高的敏感性,每毫升细菌含量不少于10个,ATP的含量不低于10-14M时,便可检出,尤其是自动化生物发光仪问世以后,使该法可能成为最敏感的检测技术之一。另外,它具有检测的快速性,能在20分钟内,至少不超过1小时报告结果。

生物光测量法的不足之处是,不但仪器的价格昂贵,而且如果在被检标本中存在组织细胞或非细菌性ATP时,必须先做选择性分解处理,通常对前者用去垢剂TritonX-100溶解,对后者用焦磷酸酶(apyrase)水解,只有排除各种不正常因素的干扰后,才能作检测,因而增加了操作的程序,给本技术的推广应用带来一定的困难。

   (二) 化学光技术

    1. 化学光技术(chemiluminescence technique)的基本原理 本技术的化学基础在于卟啉(porphyrin)存在于所有细菌的原生质中,当检测细菌在碱性条件下,与试剂鲁米诺(luminol,即5-amion-2,3dihydro-1,4-phthazindione,又名氨基苯二酰肼)相遇,在含铁的有机物(如硫氰酸铁)或生物化合物(如细胞色素、过氧化物酶、血红素)存在的条件下,受激发,则可产生出能检测的化学光(430nm),放出的化学光量与细菌所含的卟啉量之间为正相关,故可用该法测量被检标本中的含菌量。

检测时,最常见的仪器是液体闪烁计数器,用其检出光量后,再根据已知浓度的反应物质和受试反应物的浓度产生的光量进行比较,以确定被检测标本所含的细菌数。

    2. 化学光技术的应用 可用于水标本、空气标本及菌尿症标本等的检测。

    总之,化学光技术具有较高的敏感性,每毫升标本中含有103~104个细菌即可检出,而且于2分钟便能报告结果。加之,操作简便,所以说,应用该法诊断标本中的含菌数是有意义的。

文章分类: 试剂盒技术资料
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