干扰素γ驱动的STAT 1活化对乳腺癌细胞对苯甲醛的体外致敏作用
酪氨酸激酶抑制剂降低癌细胞的代谢灵活性，使其对双胍敏感。19。我们最近证实，酪氨酸激酶参与SHCA适配蛋白，以增加乳腺癌细胞代谢的灵活性。28。失磷酸酪氨酸依赖的SHCA信号(Y 239/240/313 F)增加了乳腺癌细胞对线粒体代谢的依赖，暴露出对苯甲醛的选择性脆弱性。28。利用由多瘤病毒MT(MT)驱动的乳腺肿瘤细胞株，我们现在证明了一个非磷酸化的shca突变体(Y313f)能使乳腺癌细胞对苯甲醛敏感(补充图)。1A)。再加上我们观察到pY 313依赖的shca信号的丢失增加了乳腺癌细胞中STAT 1的表达(补充图)。1B)29，我们考虑了STAT 1可能会增加苯甲醛的敏感性。干扰素γ是一种激活STAT 1通路的炎性细胞因子。26,27。我们选择低浓度的干扰素γ(1ng/mL)诱导STAT 1转录反应。β2m, TAP 1)(补充数字1C)但不影响乳腺癌细胞的生长(图一)。1A)。干扰素γ诱导的STAT 1激活与苯甲醛协同作用降低MT乳腺癌细胞的存活率。1A)。而STAT 1-过表达的MT/313 F细胞则表现出明显的苯甲醛敏感性，不能通过干扰素γ共处理进一步增强其敏感性(如图1所示)。1A)。干扰素γ与苯甲醛协同诱导小鼠ErbB 2抗肿瘤反应+(NOP 6，NOP 23和NIC)(图6)。1B)和代表ER的人乳腺癌细胞系+/HER 2−(MCF 7)，HER 2+(HCC 1954，BT 474)和三阴性(MDA-MB-231，BT 20，MDA-MB-436，Hs578T和BT 549)疾病(图)。1C)。这些结果表明，干扰素γ增强了苯甲醛在多种乳腺癌模型中的抗肿瘤作用。
图1：干扰素γ驱动的STAT 1激活使乳腺癌细胞对苯甲醛敏感.a–c苯二甲双胍和干扰素γ单独或联合治疗乳腺癌细胞48 h后，其活力与PBS对照相比有显着性差异(P<0.01)。a, b)鼠aMT 864，MT 4788：n=5；313 F 6737和6738：n=4项独立实验；bNOP6，NOP 23，NIC：n=3项独立实验。c人乳腺癌细胞系MCF 7和BT 474：n=4，其他n=3项独立实验。数据表示为平均值±SEM。dIFNγ处理STAT 1-WT和STAT 1-KO细胞的免疫印迹分析n=3项独立实验。eMT864、MT 4788-STAT1-WT和STAT1-KO细胞单独或联合作用48h后，细胞活力与PBS对照相比有显着性差异(P<0.01)。图数据代表一个实验，四个技术复制(平均±SD)，代表两个独立的实验。P数值计算采用双向方差分析和图基后特别测试(a, b, c, e)，并可在图中找到。另见补充数字1.
为了评估STAT 1是否需要这种观察到的治疗敏感性的增加，我们用CRISPR/Cas9基因组编辑从两个转化为MT的细胞系(864和4788)中删除了STAT 1(如图所示)。1D)29。正如预期的那样，缺乏STAT 1的细胞无法上调STAT 1的靶基因。Irf 9和Psmb 8)(补充数字1D)干扰素γ刺激后。利用这些STAT 1-空细胞，我们发现干扰素γ需要STAT 1来使乳腺癌细胞对苯甲醛的抗肿瘤作用敏感(如图所示)。1E)。因此，干扰素γ以STAT 1依赖的方式使跨越不同分子亚型的多个乳腺癌细胞株对苯甲醛敏感。
干扰素、γ和多聚IC对苯甲醛体内抑瘤作用的影响
接下来，我们询问炎症反应的增加是否也使乳腺肿瘤对苯甲醛体内的抗肿瘤作用敏感。IFNγ乳腺脂肪垫内注射MT 4788细胞+/+和干扰素γ−/−老鼠，都在一个纯的FVB背景上29。当肿瘤达到150毫米时3每天腹腔注射50 mg/kg苯甲醛或磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为对照。苯甲醛使干扰素γ肿瘤生长减少30%+/+，而不是干扰素γ−/−，动物(图1.2A)。由于干扰素γ是肿瘤免疫监测所必需的，我们评估了干扰素γ驱动的抗肿瘤免疫在增强苯甲醛敏感性方面的相对重要性。我们将MT 4788乳腺癌细胞移植到CD8的乳腺脂肪垫中。+/+或CD8−/−小鼠(也是在纯FVB背景下)，用PBS或苯甲醛(50 mg/kg)治疗乳腺肿瘤。虽然CD8−/−小鼠缺乏细胞毒性T淋巴细胞，我们只观察到肿瘤对苯甲醛敏感性的部分丧失，与CD8相比+/+控件(图1.2B)。我们还探讨了苯甲醛的能力，以提高治疗效果，减轻免疫抑制。荷瘤小鼠单独或联合使用苯甲醛和PD1中和抗体(或同型对照)。单用苯甲醛或抗PD1抗体可抑制肿瘤生长30%，并观察到复合效应(补充图)。1A)。我们还测试了苯甲醛是否能增强vsv-M(Δ51)肿瘤学病毒的效力，该病毒部分地通过增强抗肿瘤免疫应答而杀死肿瘤细胞。30。当vsv-M(Δ51)或苯甲醛单独治疗在体内产生抗肿瘤作用时，接受联合治疗的小鼠肿瘤生长未见进一步下降(补充图)。2B)。结合我们的体外研究，这些数据表明，干扰素γ诱导的苯甲醛敏感性并不主要依赖于这种联合治疗的能力，以减轻免疫抑制。
图2：多聚IC诱导的STAT 1激活使乳腺肿瘤对苯甲醛体内的杀瘤作用敏感。
a, b免疫活性(FVB)小鼠乳腺脂肪垫注射MT 4788细胞a干扰素γ−/−或bCD8−/−动物。在~150毫米3，用PBS或苯甲醛(50 mg/kg/d)治疗小鼠。a管制：n=7；苯甲醛：n=8例肿瘤/组。b控制CD8+/+: n=5；苯甲醛CD8+/+: n=8；控制CD8−/−: n=12；苯甲醛CD8−/−: n=11例肿瘤。cMFP在FVB小鼠体内注射MT 4788细胞。在~100毫米3，小鼠用PolyIC(每日50μg)或生理盐水处理。两天后，当肿瘤直径为150毫米时3、苯甲醛(50 mg/kg，每日)(或PBS)联合PolyIC或生理盐水(每2天一次)治疗。管制：n=18；苯甲醛：n=20；多元IC：n=17；苯甲醛+多聚IC：n=17例肿瘤。d, eMFP注射液dMT4788-STAT1-WT或e将STAT 1-KO细胞转化为FVB小鼠。在~80毫米3肿瘤体积、小鼠用PolyIC或生理盐水治疗。两天后，当肿瘤直径为120毫米时3、苯甲醛(50 mg/kg，每日)(或PBS)联合PolyIC或生理盐水(每2天一次)治疗。管制：dn=11和e n=10；苯甲醛(d, e): n=7；多元IC：d n=6和e n=7；苯甲醛和多氯联苯：d n=8和e n=9例肿瘤。f, g肿瘤的免疫组织化学染色(c)使用fKi67和g切割caspase-3特异性抗体。数据显示为平均%阳性细胞±扫描电镜，代表了f管制：n=7；多元IC：n=8；苯甲醛：n=8；苯甲醛+多聚IC：n=10(g) n=10但PolyIC除外：n=8例肿瘤。显示了具有代表性的图像(标度栏=50μm)。h, iMFP注射液h4T1-537细胞进入Balb/c小鼠和iMDA-MB-231细胞转化为SCID-BUGE小鼠。在~150毫米3，小鼠按(c). h管制：n=8；苯甲醛，多效IC：n=9；苯甲醛+多聚IC：n=10例肿瘤；i管制：n=12；苯甲醛：n=10；多元IC：n=9；苯甲醛+多聚IC：n=13例肿瘤/组。jMFP在FVB小鼠体内注射MT 4788乳腺癌细胞。小鼠按(c)使用两种浓度的苯甲醛(10或50毫克/千克)。n=8例肿瘤/组，除苯甲醛(10 mg/kg)+PolyIC外：n=9.用于a–e和h–j，数据表示为肿瘤体积相对于治疗开始±扫描电镜的平均皱襞变化。P值在图中，是使用带有Tukey后特别测试的双向ANOVA或使用Tukey后特别测试的单向ANOVA计算的(f, g)。另见补充数字2.
接下来我们将测试刺激STAT 1介导的炎症反应的疗法是否能提高苯甲醛对乳腺癌的治疗效果。我们使用了一种特征良好的合成双链rna类似物--聚肌苷-聚胞苷酸(Polyic)，它是一种Toll样受体3和维甲酸诱导的Ⅰ型基因受体激动剂，可诱导IFN驱动的STAT 1激活。31。而PolyIC治疗对MT 4788肿瘤生长无影响，但与苯甲醛合用可降低肿瘤的生长潜能(图1)。2C)。此外，PolyIC增强了苯甲醛对STAT 1野生型(WT)的抑瘤性能。二维空间)，但不存在STAT 1缺陷。2E)肿瘤。这表明PolyIC使乳腺癌对苯甲醛的杀瘤作用敏感的能力需要完整的STAT 1通路。免疫组织化学(IHC)分析证实经多IC治疗的肿瘤中STAT 1水平增高(补充图)。2C)，而苯甲酰胺素治疗的肿瘤则显示出较高的磷AMPK水平(补充数字)。二维空间)。我们观察到Ki 67染色在对照组和治疗组之间没有明显变化(图1)。2F)。然而，与单独用药或PBS对照相比，PolyIC和苯甲醛联合治疗可显著提高Caspase-3的切割水平(图1)。2G)。综上所述，这些观察提示，多IC治疗与苯甲醛通过诱导STAT 1依赖的乳腺癌细胞凋亡协同作用。
接下来，我们试图通过使用独立的小鼠和人类乳腺癌的临床前模型来测量聚苯硫醚/苯甲醛联合治疗的杀瘤特性来确定这些观察的普遍性。这些细胞包括4T1-537细胞，这是一种肺转移变异体，在免疫能力良好的Balb/c小鼠和人类三阴性乳腺癌(mDA-MB-231)模型中是同基因的，后者在免疫缺陷(SCID-BIGE)动物中形成肿瘤。值得注意的是，多聚IC/苯甲醛联合治疗也损害了4T1-537和MDA-MB-231肿瘤的生长，而每种药物作为一种单一疗法，对疾病进展的影响最小(图一)。2H，i)。多聚IC/苯甲醛治疗MDA-MB-231肿瘤的组合效应进一步强化了适应性免疫反应对此表型没有显著贡献的事实(图1)。2I)。相反，先天炎症反应可能是增加对这种药物组合的敏感性的基础。为了解决我们的研究结果的潜在影响，我们询问PolyIC治疗是否能使肿瘤对低剂量的苯甲醛敏感，而低剂量的苯甲醛将更容易实现，并与降低人类毒性有关。6,15。多聚IC联合给药可引起类似的抗肿瘤反应，其剂量减少了5倍(10比50 mg/kg)(见图)。2J)。总的来说，这些数据支持了这样一种假设，即多IC驱动的炎症使肿瘤对多个乳腺癌临床前模型中更多临床相关的苯甲醛浓度的杀瘤效果敏感。
干扰素γ对苯甲醛诱导的乳腺癌细胞能量应激的影响
我们发现多聚IC既没有增加磷AMPK水平，也没有诱导颗粒酶B阳性细胞浸润到苯甲醛治疗的肿瘤中(补充图)。2D，e)。这些数据支持了这样的概念，即这种药物组合所观察到的协同作用机制超出了能量压力放大或诱导抗肿瘤免疫反应的范围。然而，考虑到苯甲醛抑制线粒体代谢的既定作用3,4,5我们评估了能量应激是否是干扰素γ诱导肿瘤对这种双胍敏感的原因.苯甲醛单药可使乳腺癌细胞的耗氧率(OCR)消失(如图所示)。3A)，包括大幅度降低耦合和非耦合呼吸的速率(如图所示。3B-f)和大幅度减少OCR-偶联ATP的生产(如图所示)。第三代)。干扰素γ治疗可适度降低乳腺癌细胞的基础呼吸频率和最大呼吸频率(如图所示)。3B，c)和依赖于STAT 1的方式(补充数字)3A，b)。尽管如此，干扰素γ并没有进一步增强苯甲醛对细胞呼吸的抑制作用。3B，c)。相一致的是，干扰素γ驱动的STAT 1激活导致乳腺癌细胞的生物能量能力降低30%，而苯甲醛单独治疗或联合干扰素γ治疗则降低了25倍(如图1所示)。3H和补充数字3C)。这些结果提示，干扰素γ驱动的STAT 1在乳腺癌细胞中的激活并不能进一步增强苯甲醛对细胞呼吸的抑制作用。
图3：干扰素γ诱导乳腺癌细胞中度能量应激。a耗氧率(OCR)n=3个独立实验(平均值)±SEM。b–f使…的比率增加一倍b基础呼吸，c最大呼吸，d备用能力，e非耦合呼吸f分析样本的非线粒体呼吸a). n=3个独立实验，均值(均值)±SEM。g, h折叠变化gOCR-偶联ATP生产和h中描述的细胞的生物能量容量a)。数据表示为平均值±扫描电镜。n=3项独立实验。i细胞外酸化率(ECAR)a)。这些数据代表了n=3个独立实验(平均值)±SEM。j通过绘制糖酵解产生ATP的基础(虚线点)和最大速率(实线点)来表示细胞的代谢能力和柔韧性(J)。三磷酸腺苷糖酵解和氧化磷酸化(J)三磷酸腺苷氧化)，经过处理。n=3个独立实验，均值(均值)±SEM。k治疗后，糖酵解或氧化所产生的基础ATP总量。n=3项独立实验，以均值±SEM表示。l糖酵解代谢物稳态水平的加倍变化。这些数据代表了n=3个独立实验(平均值)±SEM。m从分析的样品中测定乳酸/丙酮酸的比值。l)n=3个独立实验(均值平均值)±SD。n柠檬酸循环代谢物稳态水平的变化与我，) n=3个独立实验(平均值)±SEM。****P < 0.0001 compared to PBS control. Other P图中表示的值。oα-戊二酸酯/柠檬酸盐比值的测定n)n=3个独立实验(均值平均值)±SD。MT4788细胞用1ng/mL干扰素γ、苯甲醛500μM、联合或PBS处理作为载体对照。P数值是使用图基后特别测试的双向方差分析计算的，并显示在图中或以上。另见补充数字3。注：没什么意义。
接下来，我们评估干扰素γ是否改变了乳腺癌细胞对苯甲醛治疗的代谢灵活性。如预期的那样，苯甲醛能提高乳腺癌细胞的细胞外酸化率，但与干扰素γ共处理无进一步差异。3I)。事实上，在乳腺癌细胞中观察到了类似的ECAR值，无论它们是用干扰素γ治疗还是保留完整的STAT 1通路(补充图)。三维空间)。此外，干扰素γ以STAT 1-依赖性的方式适度降低MT 4788乳腺癌细胞的代谢灵活性。3J，k和补充数字3E，f)。然而，苯二甲双胍单独或与干扰素γ联合作用，都会消除氧化磷酸化(OXPHOS)产生的ATP，而糖酵解所产生的能量也会相应增加(如图所示)。3J，k和补充数字3E，f)。以前的研究表明，STAT 1的激活可能会增加糖酵解。32,33。事实上，在干扰素γ刺激的STAT 1野生型和非STAT 1型细胞中，观察到丙酮酸和乳酸水平增加，乳酸/丙酮酸比值升高(补充图)。3G，h)。干扰素γ与苯甲醛共处理可适度提高稳态丙酮酸和乳酸稳定水平，但乳酸/丙酮酸比值与单用苯甲醛相比无显着性差异(图一)。3L，m)。干扰素γ治疗对糖缺乏后乳腺癌细胞活力无影响(补充图)3I)，提示干扰素γ信号并不改变乳腺癌细胞对葡萄糖的依赖。
此外，干扰素γ刺激可提高苯甲醛诱导的乳腺癌细胞α-酮戊二酸(αKG)水平和αKG/柠檬酸比值(图1)。3n，o)。最后，这种干扰素γ-诱导的αkg水平的增加和αkg/枸橼酸盐的比值是STAT 1-依赖的(补充图)。3J，k)。这些数据显示谷氨酰胺代谢的还原羧化作用增强，电子传递链抑制剂曾报道过。34,35。为了支持这一点，干扰素γ治疗会导致轻微但在统计学上显著提高乳腺癌的存活率，以应对谷氨酰胺水平的下降(补充数字)。3L)。这些观察虽然有趣，但不能解释干扰素γ和苯甲醛在刺激乳腺癌细胞毒性反应中所观察到的协同作用的增加。这些结果提示，虽然干扰素γ驱动的STAT 1的激活会略微降低乳腺癌细胞的生物能量能力和柔韧性，但与苯甲醛增强能量和生物合成应激的能力相比，这些差异相形见绌。
干扰素γ及其诱导的苯甲醛敏感性依赖于乳腺癌细胞线粒体活性氧的产生
苯甲醛通过抑制电子传递链的复合物I，抑制细胞呼吸，导致线粒体活性氧的产生。4,24。苯甲醛处理后MT 4788和MDA-MB-231细胞线粒体超氧阴离子生成增加(图1)。4A，b)。这一点得到了一个测量总活性氧水平的探针的证实(补充数字)。4A-C)。干扰素γ治疗既不增加乳腺癌细胞的活性氧水平，也不促进苯甲醛诱导的活性氧生成(图一)。4A，b和补充数字4A-C)。因此，干扰素γ信号不足以引起氧化应激。与未转化的肿瘤细胞相比，肿瘤细胞必须应对较高的ROS水平，并利用适度升高的ROS水平来促进肿瘤的生长和转移。沿着这一思路，许多研究已经探索了利用ros诱导的氧化损伤来选择性杀伤癌细胞的治疗潜力。25。我们研究了干扰素γ是否刺激乳腺肿瘤对苯甲醛诱导的ROS产生的细胞毒性作用。我们发现线粒体活性氧清除剂MitoTEMPO逆转了干扰素γ/苯甲醛联合治疗三种独立乳腺癌模型(MT 4788，MDA-MB-231和BT 474)的细胞毒性作用(图)。4C-E)。此外，同时注射米托TEMPO的小鼠恢复了多聚IC/苯甲醛联合治疗乳腺肿瘤的生长潜力(如图所示)。4F)。与这些观察相一致的是，8-oxo-2‘-脱氧鸟苷(8-oxo-DG)IHC染色显示，与苯甲醛治疗组或对照组相比，多聚氰胺/苯甲醛处理的肿瘤的氧化DNA损伤增加了1.6倍。4G)。因此，氧化应激是苯甲醛和干扰素γ驱动的STAT 1激活增强乳腺癌细胞死亡的协同效应的基础。结合对干扰素γ刺激不增加ROS水平的观察，这些数据进一步支持了干扰素γ可能扰乱乳腺癌细胞清除活性氧能力的假设。
图4：干扰素、γ和多聚IC诱导的苯甲醛敏感性需要线粒体活性氧.a, b米托索克斯几何平均荧光强度(MFI)和代表性直方图aMT 4788和b用干扰素γ和苯甲醛单独或联合作用2 4h后，MDA-MB-231细胞与PBS对照组±SEM相比，MDA-MB-231细胞呈现倍数变化：aMT 4788：n=6/组；bMDA-MB-231：n=4/组。见补充数字10选门策略。c–e细胞活力比DMSO控制的细胞活力增加一倍cMT 4788，dMDA-MB-231，以及e用干扰素γ和/或苯甲醛处理BT 474细胞48h，不加或加入10μM MitoTEMPO。数据表示为平均值±扫描电镜。n=3(d)或n=4(c, e)独立实验。fFVB小鼠乳腺脂肪垫注射MT 4788乳腺癌细胞。在~100毫米3两天后，苯甲醛(50 mg/kg，每日1次)和(或不加)3 mg/kg米托TEMPO(3 mg/kg)开始治疗小鼠。数据表示为联合治疗开始时肿瘤体积较开始时平均增加一倍(±SEM)。对照组：n=8；MitoTEMPO：n=6；苯甲醛+多聚IC：n=8；苯甲醛+PolyIC+MitoTEMPO：n=8例肿瘤。g石蜡包埋的MDA-MB-231肿瘤的8-oxo-DG免疫组织化学染色(见图)。2G)。数据表示为百分比正像素平均值±sd(n=10例独立肿瘤/组。还显示了具有代表性的图像。P数值是使用图基后特别测试的双向方差分析计算出来的，如图所示。另见补充数字4.
抑制谷胱甘肽合成使乳腺癌细胞对苯甲醛敏感
谷胱甘肽(Glutathione)是一种不含蛋白质的硫醇分子，是癌细胞中主要的活性氧清除剂.它以硫醇还原(GSH)或氧化(GSSG)状态存在，GSH占主导地位。NADPH是补充谷胱甘肽水平和维持氧化还原平衡所必需的辅助因子和电子供体。36。我们首先评估了干扰素γ或苯甲醛单独或联合作用是否改变乳腺癌细胞中谷胱甘肽的水平。苯甲醛降低MT 4788细胞GSH水平和降低GSH/GSSG比值(补充图)4D)，这与它的活性氧诱导特性是一致的(如图所示)。4A，b和补充数字4A-C)。然而，干扰素γ治疗单独或联合使用苯甲醛，并没有进一步影响谷胱甘肽水平或谷胱甘肽/谷胱甘肽/谷胱甘肽的比值(补充图)。4D)。此外，在STAT 1缺乏的细胞中谷胱甘肽水平的调节也有类似的趋势(补充图)。4E)。最后，苯甲醛增加NADH/NAD。+乳腺癌细胞的比率，这反映了它作为复合物I抑制剂的作用(补充图)4F)。尽管AMPK的激活已被证明可以减少NAPDH的消耗37干扰素γ和/或苯甲醛对NADPH/NADP无影响+MT 4788乳腺癌细胞比率(附图)4G)。此外，干扰素γ对MT 4788乳腺癌细胞中谷胱甘肽(Glu、Cys和Gly)氨基酸成分的稳态水平没有影响(补充图)。4H)。这些结果表明，干扰素γ驱动的STAT 1激活并不直接影响谷胱甘肽的产生.
然而，我们对苯甲醛降低乳腺癌细胞谷胱甘肽缓冲能力的能力感兴趣。因此，我们研究了进一步干扰乳腺癌细胞产生谷胱甘肽是否能使其对苯甲醛的抗肿瘤作用敏感。事实上，谷胱甘肽合成的药物抑制剂使肿瘤对活性氧诱导的化疗敏感。38。因此，我们测试了BSO抑制谷胱甘肽合成的第一步是否能增强苯甲醛对乳腺癌的细胞毒性作用。BSO处理对细胞活力无影响，但增加了MDA-MB-231(4.6倍)和BT 474(5.7倍)对苯甲醛处理的敏感性(图一)。5A和补充数字5A)。此外，bso共处理可产生类似的抗肿瘤作用，分别使md-mB-231和BT 474细胞的苯甲醛水平降低5倍(100μM)和25倍(20μM)(图1)。5B和补充数字5B)。最后，MitoTEMPO拯救了BSO和苯甲醛处理的癌细胞的活力。5C)。这些结果表明，谷胱甘肽合成抑制剂通过诱导氧化应激而使乳腺癌细胞对苯甲醛有明显的敏感性。虽然bso和苯甲醛共处理可使溴脱氧尿苷阳性细胞数量略有减少(1.3倍)，但我们观察到AnnexinV/碘化丙酸丙酯阳性细胞(PI)的频率有更强的增加。+)细胞(2.7倍)对这种药物组合的反应(如图所示)。5D-E和补充数字5C)。这些数据表明，BSO和苯甲醛联合治疗对肿瘤的杀伤作用主要是细胞凋亡增加的结果。
图5：抑制谷胱甘肽合成使乳腺癌细胞对苯甲醛敏感。a–cMda-mbb-231细胞用不同浓度的aBSO或b苯甲醛。c用10μMMitoTEMPO预处理苯甲醛/BSO细胞。与PBS对照相比，这些数据显示为活力的翻倍变化。为(a, b)，这些数据代表了重复实验(n=4次技术重复)平均±SD。为(c)，数据显示在n=3个独立实验，均值(均值)±SEM。P中所示的值(b)将苯甲醛+BSO与单独处理的苯甲醛浓度进行比较。d, e百分比d附件五+/PI+或e流式细胞仪检测BrdU阳性的MDA-MB-231细胞(±SEM)。用PBS对照、苯甲醛和(或)BSO处理细胞40h，每组数据代表三个独立实验。有代表性的点图显示。见补充数字10选门策略。P数值显示在图中，并使用图基后特别测试的双向方差分析进行计算。另见补充数字5.
苯甲醛不需要oct转运体进入细胞，使其在较低浓度下成为更有效的复合物I抑制剂。4,39。然而，大多数肿瘤学的研究都集中在与肿瘤相关的家族成员二甲双胍上。6。这是由于二甲双胍被批准用于2型糖尿病的长期治疗。40，因为乳酸酸中毒发生率较低41。因此，我们评估了BSO使乳腺癌细胞对二甲双胍和苯甲醛的细胞毒性作用的相对能力。低剂量苯甲醛(100μM)与bso协同作用降低癌细胞活力，而二甲双胍则不能增强bso诱导的细胞死亡，即使浓度高出10倍(1mm)(补充图)。5D)。与苯甲醛不同，二甲双胍在这种浓度下无法刺激活性氧的产生(补充图)5E)。这些数据表明，谷胱甘肽合成的药物抑制剂通过诱导氧化应激和随后的凋亡细胞死亡，选择性和有效地使乳腺癌细胞对苯甲醛敏感。
抑制NQO 1水平增强苯甲醛对ROS的杀伤作用
这些研究表明BSO和苯甲醛联合治疗乳腺癌的临床潜力。然而，他们并不知道干扰素γ驱动的STAT 1激活如何增强这种双胍对活性氧依赖的细胞毒性效应。为了解决这一问题，我们对干扰素γ刺激后的对照组和STAT 1缺失的乳腺癌细胞(MT 864和MT 4788)进行了全基因组RNA测序(RNAseq)分析。我们发现有1233个基因在MT 4788-STAT 1-WT和MT 4788-STAT 1-敲除(KO)细胞之间有差异表达，而在MT 864-STAT 1-WT和MT 864-STAT 1-KO细胞之间差异表达的基因有573个(补充数据文件)。1和补充数据文件2>100读，>2倍，假发现率<0.05)。GO定期分析显示，与免疫系统过程、抗病毒反应、抗原处理和呈递有关的转录反应被干扰素γ驱动的STAT 1激活(补充数据文件)最强烈地上调。3和补充数字6a，b).
知道氧化应激是必需的干扰素，γ和苯甲醛，以诱导抗肿瘤作用(图一)。4C-f)，我们重点研究了控制氧化还原稳态的差异表达基因(补充图)6B)。这包括10个基因(NOS 2, NOX 4, TXNIP, XDH, Bnip 3, NOXO 1, 德迪4, 多沙, LRRK 2, 多氧1)，它编码一种具有ROS诱导特性的蛋白质，与STAT 1缺陷细胞相比，该蛋白在STAT 1-WT中过高表达(如图1所示)。6A和补充数字6C)。然而，由于干扰素γ不刺激乳癌细胞产生活性氧(如图所示)。4A，b和补充数字4A-C)，我们重点研究了作为ROS清除剂的差异表达基因。已鉴定出三个这样的基因，包括PRDX 4, SOD 3，和NQO 1(无花果)6A和补充数字6C). Prdx 4干扰素γ和SOD 3干扰素γ对MT 4788细胞mRNA水平的抑制作用(附图)6C)。相反，STAT 1的激活减少了。NQO 1干扰素γ刺激下MT 864和MT 4788细胞的水平(补充图)6C)。NQO 1编码NAD(P)H脱氢酶，它是一种双电子还原酶，在超氧清除、醌解毒和细胞应激反应中起重要作用。42。此外，nqo 1经常在多种肿瘤类型中过度表达，包括肺癌和乳腺癌。43,44。我们验证了NQO 1作为STAT 1靶基因在MT 4788细胞中的表达，其表达在干扰素γ治疗后下降，特别是在STAT 1熟练细胞中(补充图)。7a，b)。接下来，我们比较了NQO 1、STAT 1和pY 701-STAT 1蛋白在跨越不同亚型的乳腺癌细胞系中的水平。基线STAT 1和pY 701-STAT 1水平与NQO 1表达水平的差异无关(图1)。6B)。然而，我们观察到，在三重阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、Hs578T和MDA-MB-436)中，有3株细胞经干扰素γ处理后，NQO 1蛋白水平下降。相反，干扰素γ刺激并没有明显改变ER中NQO 1的水平。+或HER 2+细胞株测试(图1.6C)。定量逆转录-聚合酶链反应(rt-qPCR)分析没有显示出类似的下降。NQO 1干扰素γ处理的tnbc细胞中的水平，提示IFNγ刺激在转录后水平主要降低人乳腺癌细胞中nqo 1的水平(补充图)。7C)。18例肺癌脑转移患者肿瘤溶解物的免疫印迹分析证实了这种负相关(补充图)。7D)45。这些结果表明NQO 1是一种STAT 1调节的基因，在某些乳腺癌中受到干扰素γ刺激的抑制，而不是所有的乳腺癌。我们的数据进一步提示了STAT 1在不同的生物学环境中控制NQO 1表达的复杂机制，包括转录和转录后控制。
图6：干扰素γ诱导的抑制NQO 1表达的作用增强了苯甲醛的抗肿瘤作用。a用干扰素γ刺激MT4788-VC和STAT1-KO细胞24 h的RNA-seq分析，ROS代谢相关差异表达基因的热图(>2倍；FDR<0.0 5)。b人乳腺癌细胞系免疫印迹分析。相对NQO 1蛋白水平与pY 701-STAT 1或总STAT 1水平比较，n=1次技术重复。c细胞株的免疫印迹分析b)干扰素γ治疗48h后。干扰素γ治疗后NQO 1/微管蛋白比值与对照组比较的变化n=3个独立实验，均值(均值)±SEM。d载体控制(VC)和NQO 1-高表达MT 4788细胞的免疫印迹分析n=3个生物重复序列。e中描述的细胞的相对活力(d)对苯甲醛(500μm)和干扰素γ治疗(48h)的反应。与pbs处理的对照组相比，数据显示为活力的翻倍变化，并代表了n=3个独立实验(平均值)±SEM。****P与PBS对照组比较值<0.0001。f靶向人或小鼠的shRNAs转导细胞株的RT-qPCR分析NQO 1或者是对照的非哺乳动物的shRNA。数据表示为平均值±扫描电镜。n=3个生物重复序列。g细胞在(f)检测其对干扰素、γ和/或苯甲醛的相对敏感性(48h)。与pbs对照相比，这些数据显示了细胞活力的翻倍变化，并代表了n=3个独立实验(MT 4788和MDA-MB-231)(均值)±SEM，或2个独立实验(BT 474)(均值)±SD。h分别表达两种针对人的shRNA的mDA-MB-231细胞的RT-qPCR分析NQO 1或者用非哺乳动物靶向的shRNA做对照。n=4个生物重复序列；(均值)±SEM。i细胞描述为(h)在5μM MitoTEMPO存在或不存在的情况下，检测对苯甲醛的相对敏感性(48h)。数据显示，与PBS控件相比，其生存能力发生了翻倍的变化，n=3个独立实验(平均值)±SEM。P值是用未配对的双面计算的。t干扰素γ与PBS治疗的比较试验(c, f)，一个带有图基(Tukey‘s)后特别测试的双向方差分析(e, g, h, i)和带有图基后特别测试的单向方差分析(h)。另见补充数字6和7.
为了探讨干扰素γ诱导的抑制NQO 1表达是否有助于观察到干扰素γ与苯甲醛的协同作用，我们在MT 4788细胞中过度表达了NQO 1。6d)。随着NQO 1水平的提高，他们在干扰素、γ和苯甲醛联合治疗的作用下恢复了生存能力(如图1所示)。6E)。我们还使用小鼠和人类短发夹RNA(ShRNAs)来保持沉默。NQO 1在多个乳腺癌细胞系中的表达水平。6f)。减少NQO 1的表达使MT 4788、BT 474和MDA-MB-231细胞对苯甲醛的反应受到抑制，这与干扰素γ/苯甲醛联合治疗所观察到的存活率下降相类似。6g)。表达nqo 1 shRNAs的乳腺癌细胞对干扰素γ和苯甲醛联合治疗没有进一步的致敏作用，这表明NQO 1是一个重要的目标基因，它赋予了苯甲醛的抗肿瘤作用(如图所示)。6g)。最后，我们研究了干扰素γ介导的抑制NQO 1表达是否通过氧化应激反应使肿瘤对苯甲醛敏感。而shRNA-介导NQO 1敲除增加了苯甲醛对MDA-MB-231细胞的杀伤作用，与MitoTEMPO共处理后，这些抗肿瘤作用被逆转。6h，我)。这些发现与先前的研究一致，表明另一种线粒体复合体i抑制剂鱼藤酮(Rotenone)可被辅酶q(Coq)逆转，并以nqo 1依赖方式逆转rotenone的细胞毒性。46。这些结果表明，STAT 1依赖的信号可以抑制某些乳腺癌细胞中NQO 1的表达，使其对苯甲醛诱导的氧化应激敏感。直接沉默NQO 1的表达，揭示了NQO 1在保护肿瘤细胞免受苯甲醛氧化应激的重要作用。
β-拉帕酮是一种NQO 1生物活性药物，通过引起氧化损伤，使乳腺肿瘤对苯甲醛敏感。
NQO 1是肿瘤治疗中可行的药物靶点。42。β-拉帕酮是一种含醌的前药，被NQO 1生物激活，经历一个无效的氧化还原循环。在此过程中，β-lamachone不仅从内源底物中分离出nqo 1，而且还进一步促进了nqo 1阳性细胞的超氧生成。22,47,48。我们研究了β-拉帕酮和苯甲醛联合治疗是否也能引起抗肿瘤反应.β-拉帕酮对细胞活力的影响最小，但对苯甲醛处理的MDA-MB-231、BT 474和BT 549细胞有明显的致敏作用。7A和补充数字8a，b)。而β-雷帕酮/苯甲醛治疗不能明显诱导细胞凋亡。7b)，这种药物组合显着降低肿瘤细胞的增殖(如图所示)。7C)。我们延长了这些发现在体内，并表明联合β-拉帕酮和苯甲醛治疗明显损害了MDA-MB-231乳腺肿瘤的生长(如图所示)。7D)。虽然我们没有观察到在实验终点上，ki 67和被切割的caspase-3阳性细胞百分比的稳态差异(补充图)。8C，d8-oxo-DGIHC染色结果显示，苯甲醛和β-雷帕酮联合治疗可显著增加乳腺肿瘤的氧化损伤(对照组为32.7%，β-雷帕酮/苯甲醛治疗组为49.2%)。7E)。这些数据表明，β-拉帕酮通过诱导氧化损伤使乳腺肿瘤对苯甲醛的抗肿瘤作用敏感。
图7：β-拉帕酮，一种NQO 1生物活性药物，通过诱导氧化损伤，协同作用于乳腺肿瘤对苯甲醛的敏感性。a苯甲醛和/或β-拉帕酮作用48h后，mda-mbb-231细胞的存活率与dmso对照相比呈倍增变化，具有代表性。n=4项独立实验(平均值)±SEM。b, c百分比b附件五+/PI+或c流式细胞仪检测BrdU阳性的MDA-MB-231细胞(均值±SEM)。用PBS对照、苯甲醛和(或)β-雷帕酮作用细胞48h，这些数据代表了三个独立实验的结果。有代表性的点图显示。d乳腺脂肪垫注射MDA-MB-231乳腺癌细胞到SCID-BUGE小鼠体内。肿瘤大小~100 mm3β-拉帕酮/HPβCD(25 mg/kg，每2天一次)或(HPβCD/PBS)。2天后，与HpβCD/PBS或β-拉帕酮/HPβCD联合使用苯甲醛(50 mg/kg，每日)(或PBS)。数据表示为肿瘤体积相对于联合治疗开始时的折叠变化±扫描电镜，n=11例肿瘤/组，除β-拉帕酮/HPβCD外，n=12例肿瘤/组。P将组合处理组的值与：黑色字体：对照；紫色字体：苯甲醛；绿色字体：β-拉帕酮组进行比较。e石蜡包埋肿瘤的8-oxo-DG免疫组化染色(d)。数据表示为平均百分比正像素±扫描电镜(n=10例肿瘤/组。还显示了具有代表性的图像。体外研究采用0.5μMβ-雷帕酮和500 mg/L苯甲醛.P数值显示在图中，并使用图基后特别测试的双向方差分析进行计算。另见补充数字8.
抑制靶向活性氧清除机制选择性地使乳腺癌对多种线粒体复合物I抑制剂敏感
与正常细胞相比，肿瘤必须应对长期升高的活性氧水平，这暴露了癌症治疗的选择性脆弱性，使平衡倾向于增加活性氧生成或减少清除活性氧。49。为了测试苯甲醛诱导的活性氧水平是否选择性地抑制转化细胞的活力，我们使用永生化的nmuMG细胞和一种与ErbB 2(nmuMG-nt)的致癌变异体neunt转化的等基因细胞系。50。与预期的一样，NMuMG细胞在苯甲醛处理后产生的ROS水平低于其NuNT转化的细胞(图1)。8A)。NMuMG细胞在与苯甲醛或β-雷帕酮联合使用时，对苯甲醛的细胞毒性作用有较强的耐药性。然而，NMuMG-NT细胞对两种联合治疗均表现出显著的抗肿瘤作用(图一)。8B)。因此，癌细胞有选择地受到苯甲醛的杀瘤作用，与增强氧化应激的药物结合，创造了一个治疗机会之窗，避免了未转化的组织。
图8：靶向清除活性氧的机制选择性地使人类乳腺癌对多种线粒体复合物I抑制剂敏感。aDcfda几何平均荧光强度(Mfi)在pbs或苯甲醛(500μM)作用24 h后，对永生化的nmuMG细胞和转化的nmumg-neunt细胞的荧光强度有显着性差异。n=4项独立实验(±SEM)。有代表性的直方图显示。b所述细胞的活力(a)对苯甲醛(500μM)和/或bso(100μM)处理(上图)或苯甲醛(500μM)和/或β-拉帕酮(4μM)处理48h的反应。n=4(上图)或n=3个独立实验(下图)，以均值±扫描电镜表示。c010759(50 Nm)和(或)β-拉帕酮(BT 474：1.0μM和MDAMB 231：0.5μM)处理BT 474和MDA-MB-231细胞48 h后，其活力与DMSO相比有显著的变化。n=4项独立实验(平均值)±SEM(MDA-MB-231)；n=8个技术复制，经过两个独立的实验±SD(BT 474)。dMda-mb-mb-231细胞经ics-010759(50μM)和/或β-μM处理24 h后，mda-mb-231细胞的mda-mbm-231细胞的mdma-mb-231n=3个独立实验±SEM。e, fHER 2活力+PDXs(CRC-132，GCRC 2080)单独使用苯甲醛(CR-132,100μM；GCRC 2080,500μM)后，与.e)BSO(300μM)或(f)β-拉帕酮(0.5μM)，持续48小时。数据显示，与车辆相比，这些数据在生存能力上有翻倍的变化，并代表了n=3个独立实验(平均值)±SEM。g, h基础样PDX(GRC 1735、GRC 1915、GRC 1963和GCRC 1986)g苯甲醛(500μM)和/或BSO(300μM)或h苯甲醛(500μM)和/或β-拉帕酮(1μM)作用48h。n=3个独立实验(平均值)±SEM。P数值的计算采用双向方差分析和图基的后特别测试。另见补充数字9和10.
最近的研究描述了一种新的小分子复合物I抑制剂ics-010759，它是一种有效的抗白血病药物，目前正在临床试验中。51。IACS-010759还与β-拉帕酮合作，降低MDA-MB-231和BT 474细胞的存活率。8C)。这与观察到β-拉帕酮和IACS-010759共治疗提高了整个ROS水平是一致的。8D)。这些数据表明，抑制物损害了乳腺癌细胞清除活性氧的能力，大大增加了几种复杂I型抑制剂在肿瘤学中的治疗潜力。
最后，我们评估了我们的发现是否可以被翻译成更有临床意义的乳腺癌模型。我们使用了从HER 2中获得的6个PDX细胞株。+(crc-132和gcrc 2080)和基底样乳腺癌(gcrc 1735、gcrc 1915、gcrc 1963和gcrc 1986)52,53。HER 2+PDX对苯甲醛的细胞毒作用有显著的敏感性，与苯甲醛或β-拉帕酮联合使用(图1)。8E，f)。除GCRC 1963外，其余的基底样PDX在体外对BSO/苯甲醛和β-雷帕酮/苯甲醛联合处理的活性降低(图1)。8g，h)。虽然我们确实观察到NQO 1与STAT 1在这些乳腺癌中的水平成反比关系，但PDX(补充图)9a，b)，NQO 1/STAT 1比值不足以预测β与雷帕酮/苯甲醛联合治疗的相对敏感性(补充图)。9C)。事实上，我们观察到了bso或β-lamachone对个体PDXs对苯甲醛治疗的敏感性的相对能力的差异(如图所示)。8g，h)，表明乳腺肿瘤可能依赖谷胱甘肽和/或NQO 1维持氧化还原平衡。总的来说，这些结果支持了这样一种观点，即有针对性的清除活性氧的机制可以被缓解，从而选择性地使人类乳腺癌对线粒体复合体I抑制剂敏感。
