WSX 1在正常肝组织中高表达，其在肝癌中的表达下调与预后不良密切相关。 虽然WSX 1在免疫系统中的作用已被广泛研究，但其在非免疫细胞中的表达模式和生物学功能尚不清楚。为了阐明WSX 1的生理分布，我们首先用人多个正常组织芯片(FDA662a)检测了33种不同类型的正常器官组织中WSX 1的表达。与以前的报告一致 16 ,17 ,18 WSX 1在脾脏、淋巴结等免疫细胞富集组织中呈阳性表达，在胸腺和骨髓中表达水平较高。出乎意料的是，我们观察到WSX 1在多个正常人体器官中的高表达，如结肠、肠道和肾脏(附图)。 1 )。值得注意的是，正常人肝组织对WSX 1呈均匀阳性染色(图1)。 1A )肝细胞胞浆和细胞膜中分布均匀。此外，WSX 1在肝组织中的表达水平甚至高于免疫细胞富集组织。结合我们先前的发现，wsx 1缺乏的小鼠对肝脏炎症高度敏感。 23 ,24 我们推测WSX 1在肝脏中起着至关重要的作用。
图1：WSX 1在正常肝细胞中高表达，其在HCC中的表达下调与预后不良有关。 a 人正常组织芯片(TMA，FDA662a)中WSX 1的免疫组织化学(IHC)染色所显示的图像代表了两个个人的结果。b 肝癌组织(BC03116a和HLiV-HCC180Sur-03)中WSX 1的IHC染色 n =17)，NAT( n =103， P < 0.0001 compared to normal liver tissue), and HCC (n =130， P < 0.0001 compared to both normal liver tissue and NAT) samples. Statistical analysis results are based on quantification of the percentage of WSX1+ 每个TMA组织核心的面积。 c 低肝癌患者整体生存率的比较(英文) n =47)和WSX 1高表达组( n =43， P =0.0034)。由于缺乏生存数据，TMA BC03116a的40例HCC患者被排除在外。 d WSX 1在包括NAT在内的HCC不同病理分级中的表达水平 n =103)，一级( n =21)，二级( n =73， P =0.0321(与一级相比)和三级( n =34， P < 0.0001 compared to grade I and P =0.0123与二级相比)。量化和统计分析结果显示在右边。标尺，50μm，定量数据为平均±SD。单因素方差分析计算 P 价值。在方差分析中，采用Tuke-Kramer多重比较检验进行配对比较。采用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析，用对数秩检验比较各组间的总生存率。所有的统计检验都是双面的。* P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001. HCC hepatocellular carcinoma, NAT normal tumor-adjacent liver tissue. Source data are provided as a Source Data file.
为了验证上述结果并探讨WSX 1是否与HCC的发生有关，我们进一步分析了WSX 1在人肝组织芯片(BC03116a和HLiV-HCC180Sur-03)中的表达，其中包括130例HCC、17例健康供体正常组织和103例癌旁正常肝组织(NAT)。130例HCC的临床和病理特点见表。 1 。在130例HCC患者中，90例(HLiV-HCC180SuR-03)可获得相对存活随访信息.由于阳性染色区域的强度相似，结果被量化为wsx 1的百分比。 + 该区域由ImageJ软件开发。我们一致观察到WSX 1在正常肝组织(平均±SD，48.97%±6.64%)呈均匀扩散型，主要分布在肝细胞中。而WSX 1在NAT中的表达显著低于NAT(39.31%±8.58%)。 P < 0.0001) and was the lowest in HCC tissues (14.31% ± 7.95%, P < 0.0001, Fig. 1B )。此外，以中位数为界，HLiv-HCC180Sur-03中的90例HCC患者被手动划分为低度(n =47)和高( n =43)WSX 1表达组。正如预期的那样，WSX 1表达较低的患者总生存期较短(危险比[HR]=2.460， P =0.0034，图1。 1C )。此外，我们观察到WSX 1在Ⅲ级组织中的表达较低(10.31%±5.18%)。 n 与Ⅰ级(19.51%±8.67%)比较，差异有显着性(P<0.05)。 n =21， P < 0.0001) and grade II (14.80% ± 7.97%, n =73， P =0.0123)。WSX 1的表达与年龄、性别或TNM分期无关(表) 1 )。这些结果表明WSX 1在HCC的发生发展中起着消极的作用。
表1 TMAS中130例HCC患者的临床和病理资料。 WSX 1在体内独立于IL-27延缓肝癌的发展。 为了阐明WSX 1在肝癌发生中的作用，我们在免疫能力强的FVB/NJ小鼠中建立了自发性肝癌小鼠模型。与以前的研究一致 25 ,26 ，我们发现水动力注射(HDI) NRAS/AKT 癌基因在6周内诱发结节性和弥漫性肝癌的发生，无例外。 2A )。苏木精和伊红(H&E)染色显示肿瘤病变占肝实质的90%以上。然而，每周一次的hdi质粒DNA编码WSX 1，肝癌的形成明显延迟，散发分布的肿瘤结节约占20%的肝实质。 P < 0.0001, Fig. 2B，c )。WSX 1的HDI导致肝脏重量显著下降( P =0.0088，图1。 二维空间 )，具有明显的生存扩展(HR=0.2046， P =0.0217，图1。 2E )。此外，与我们在人肝癌组织中的结果一致，癌基因处理的小鼠肝组织中WSX 1的表达比未处理的小鼠降低，并且在编码WSX 1的质粒HDI后基本恢复(如图1所示)。 2K ).
图2：WSX 1延缓致癌 NRAS/AKT -体内诱导肝癌的发生。 a (上) NRAS/AKT FVB/NJ小鼠癌基因自发肝癌模型( n =8)。箭头代表水动力注射WSX 1每周。(下)代表整个小鼠肝脏的癌基因和癌基因+WSX 1组。 b 苏木精与伊红(H&E)组织学比较。 c 基于H&E结果的肝前病变/肿瘤病变面积百分比的比较( P < 0.0001). d 癌基因与癌基因+WSX 1组肝脏重量的差异( P =0.0088)。 e 整体生存比较( P =0.0217)。 f (上图)野生型或WSX 1型肝癌小鼠模型概述 −/− C57BL/6J小鼠( n =6)。(下)野生型或WSX 1型小鼠肝脏的典型图像 −/− 老鼠。 g H&E组织学比较。 h 肝前病变/肿瘤病变面积百分比的比较( P =0.0012)。 i 野生型与WSX 1型肝脏重量的差异 −/− 老鼠( P =0.0328)。 j 整体存活率比较( P =0.0252)。 k WSX 1在小鼠肝组织中表达的载体、癌基因和癌基因+WSX 1组。标度条，100μm。所有数据和图像代表3个独立的实验。定量数据以均值±sd表示，并由双面学生进行分析。 t 测试一下。采用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析，用对数秩检验比较各组间的总生存率。* P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001. Source data are provided as a Source Data file.
WSX 1 −/− 用C57BL/6J小鼠建立自发性肝癌模型。 NRAS/AKT 注射癌基因。因此，尽管WSX 1 −/− 老鼠一般都是有生存能力的，并且没有明显的异常，他们更容易受到 NRAS/AKT -诱发致癌(图1. 2F )。具体来说，与野生型小鼠相比，WSX 1 −/− 小鼠肿瘤形成较早，肿瘤较多( P =0.0012，图1。 2G，h )，肝脏重量增加( P =0.0328，图1。 2I )，存活率显著下降(HR=4.821， P =0.0252，图1。 2J )。这些结果进一步支持了WSX 1在肝癌发展中的抑瘤作用。
此外，先前的一项研究报告，wsx 1对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用取决于其配体IL-27的存在。 19 。因此，我们在IL-27p28中建立了自发性肝癌小鼠模型。 −/− C57BL/6J小鼠。IL-27p28是异二聚体细胞因子IL-27中不可缺少的组成部分。 27 。结果发现，IL-27p28缺乏对WSX 1的抑瘤作用无明显影响。在没有IL-27的情况下，WSX 1仍然受损。 NRAS/AKT 癌基因诱导的肝癌的形成和整体生存率的改善(补充图。 2 提示WSX 1在HCC中的抑制作用与IL-27无关。
WSX 1通过最大化CD8来阻碍肝癌的发展 + T细胞介导的抗肿瘤免疫监测 肿瘤细胞和免疫系统之间的串扰被公认为肝癌发展的关键因素。 5 。考虑到WSX 1对肝癌细胞体外增殖和迁移无明显影响(附图)。 3B，c )，而长期以来有报道称WSX 1与免疫调节密切相关。 16 ,17 ,18 我们推测，免疫系统可能参与了WSX 1的抑瘤功能。为了验证这一假设，我们用免疫缺陷NOD建立了自发性肝癌小鼠模型。 SCID γ(NSG)小鼠(缺乏成熟T细胞、B细胞和NK细胞)。正如预期的那样，WSX 1未能阻止 NRAS/AKT 癌基因诱导的NSG小鼠肝癌的发生 P =0.99，附图。 4 )，强烈支持我们的观点，一个完整的免疫系统是必不可少的抗肿瘤功能的WSX 1。
为了确定免疫如何促进WSX 1的抑瘤功能，我们从自发性肝癌小鼠模型的整个肝脏中分离出肝内浸润免疫细胞，然后用飞行时间质量流式细胞术(Cytof)进行细胞分析。34个细胞标记物表达谱的表型分析确定了6种主要的免疫细胞亚群：T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞和其他CD3。 − 细胞(图1. 3A )。如图所示。 3B WSX 1对这6种细胞亚群在肝内免疫细胞中所占比例无显著影响。有趣的是，约80%的肝内免疫细胞由T细胞组成。 3B )。因此，我们的进一步分析集中在T细胞簇上。如图所示，在整个肝内T细胞群体中，CD4所占的比例。 + 、CD8 + ，CD4 + CD8 + 双阳性(DP)和CD4 − CD8 − 癌基因+WSX 1组与癌基因+WSX 1组的双阴性T细胞相似(图1)。 3C )，和CD8 + T细胞占两组肝内T细胞总数的50%.此外，在T细胞面板中，相图分析确定了13个T细胞亚群：2个CD4。 + (T2和T10)，7 CD8 + (T3，T5，T7，T8，T9，T11，T12)，3DP(T1，T4，T6)和1 DN(T13)。 三维空间 )。在热图中显示每个T细胞簇上28个不同标记的表达谱。 3E )。图形 3F 显示每个T细胞簇在整个肝内T细胞群中所占的比例。值得注意的是，WSX 1显著增加了T6的比例(DP T， P =0.0003)，T9(CD8) + T， P =0.0016)和T13(DN T， P =0.0453)子集，但减少了T1(pd-1)的比例。 + 滞后-3 + DP T， P =0.0114)，T5(滞后-3) + CTLA-4 罗氏 CD8 + T， P =0.0126)和T11(Pd-1) 罗氏 滞后-3 + CTLA-4 + CD8 + T， P =0.0216，图1。 3F )子集。这些结果表明WSX 1治疗主要影响CD8。 + T细胞此外，所有CD8 + Pd-1、ctla-4和延迟-3是抑制T细胞功能的受体，包括t1 dp T细胞簇在内的t-细胞簇均有较高的pd-1、ctla-4和延迟-3的高表达。 28 。T细胞衰竭的特点是免疫抑制受体的共同表达(如pd-1、延迟-3、ctla-4)和T细胞功能的进行性丧失，包括细胞因子的递阶性丧失(如IL-2、IFN-γ)。 29 ,30 。最近的研究表明hmg-box转录因子TOX是T细胞衰竭的中枢调节因子。 31 ,32 ,33 ,34
图3：WSX 1通过减轻T细胞衰竭抑制肝癌的发展。 a T分布随机邻居包埋(t-SNE)地图从飞行时间的质量流式细胞术(CyTOF)分析从肝癌小鼠模型中获得的肝内免疫细胞在图中。 2A (n =4)。细胞的颜色由R表型鉴定的簇组成。聚类按表达谱分组，手动划分为6个主要细胞亚群：T细胞、B细胞、NK细胞、Mϕ、DC和其他CD3。 − 细胞。 b T、B、NK、Mϕ、DC及其他CD3的百分比 − 所有肝内免疫细胞中的细胞( n =4)。 c CD4比例 + 、CD8 + ，CD4 + CD8 + DP和CD4 − CD8 − 肝内总T细胞中的DN T细胞亚群( n =4)。 d 肝内T细胞经细胞TOF分析后的T-SNE图谱。通过28个标记的表达谱鉴定出13个T细胞亚群。 e 热图显示13个T细胞簇中28个T细胞板标记的表达。 f 2 CD4比例的差异 + (T2和T10)，7 CD8 + (T3，T5，T7，T8，T9，T11，T12)，3 dp(T1，T4，T6)和1个DN(T13)T细胞团群。 n =4)。WSX 1降低了T1的比例( P =0.0114)，T5( P =0.0126)和T11( P =0.0216)，同时增加了T6的比例( P =0.0003)，T9( P =0.0016)和T13子集( P =0.0453)。所有数据都代表了两个独立的实验。定量数据以均值±sd表示，并由双面学生进行分析。 t 测试一下。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. NK cells natural killer cells, Mϕ macrophages, DCs dendritic cells, DP double positive, DN double negative. Source data are provided as a Source Data file.
我们的独立多色流式细胞仪实验进一步验证了CD8的有效性。 + 癌基因+WSX 1组T细胞不仅T细胞耗竭标记物(pd-1： P =0.0074；CTLA-4： P =0.0471；滞后-3： P =0.0295)，也是T细胞耗尽驱动程序TOX( P =0.0116，补充图。 5B，d )。此外，WSX 1还提高了T细胞功能标记物的表达水平(颗粒酶B： P =0.0344；穿孔素： P =0.0440；Ki67： P =0.0418；IL-2： P =0.0405；干扰素-γ： P =0.0268；附图。 5C，d )。以上结果表明，wsx 1的存在可以减轻CD8。 + T细胞衰竭可能与WSX 1介导的肝癌形成和进展的抑制有关.
为了验证我们的假说，wsx 1的抑瘤作用依赖于它对CD8的影响。 + T细胞，我们接下来在体内进行CD8的消耗。 + 和CD4 + T细胞和NK细胞使用特异性抗体。在体免疫细胞耗竭的效率如图所示。 4A 。CD8耗竭 + T细胞明显损害WSX 1介导的抑制癌基因攻击所致肝癌的发展，从而产生大量结节性和弥漫性肝癌( P =0.0002，图1。 4B，c )。相反，CD4的消耗 + T细胞或NK细胞无明显作用，或仅轻度增加肝脏重量.因此，体内CD8的消耗 + T细胞几乎完全消除WSX 1诱导的存活延长(HR=7.078， P =0.0343，图1。 4D ).
图4：WSX 1诱导的肝癌回归依赖于CD8 + T细胞。 抗CD8耗竭抗体 + T(α-CD8)，CD4 + 用T(α-CD4)和NK(α-NK)细胞对自发性肝癌模型小鼠进行免疫细胞耗竭实验。 a 流式细胞术验证了体内免疫细胞耗竭的效率。分类CD8的选通策略 + T细胞，CD4 + T细胞和NK细胞如图所示. 8A . b WSX 1在体内免疫细胞缺失前后对肿瘤生长的影响 n =5)。红色箭头代表WSX 1每周注射一次。绿色箭头代表每周注射3次指示抗体。 c CD8耗竭 + T细胞受损WSX 1介导的抑制肝癌形成( P =0.0002)。 d CD8耗竭 + T细胞抑制WSX 1诱导的生存期延长(HR=7.078)， P =0.0338)。所有的数据和图像代表了两个独立的实验。定量数据以均值±SD表示，用单因素方差分析(ANOVA)进行分析.在方差分析中，采用Tuke-Kramer多重比较试验进行配对比较。采用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析，用对数秩检验比较各组间的总生存率。所有的统计检验都是双面的。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Source data are provided as a Source Data file.
WSX 1通过下调pd-L1在肿瘤细胞中的表达，减轻pd-L1/pd-1轴诱导的T细胞衰竭。 由于编码WSX 1的质粒DNA的HDI对肝内CD8中WSX 1的表达没有显著影响 + T细胞(附图) 5D ()我们推测WSX 1对T细胞衰竭的调控主要是通过其对肿瘤细胞的影响来实现的。认为pd-L1与其受体pd-1在T细胞上的结合是T细胞衰竭的重要原因。 35 接下来我们将测试WSX 1是否通过影响Pd-L1在肿瘤细胞中的表达来减少T细胞衰竭。首先，我们利用低表达WSX 1的人肝癌细胞株SNU449和SNU475构建了2个稳定的wsx 1过表达细胞系(449)。 WSX 1 和475 WSX 1 )。我们还使用CRISPR/Cas9引导RNA(CrWSX 1)在人肝癌细胞株SNU398中敲除WSX 1，该细胞系具有较高的WSX 1(补充图1)的表达水平。 3A )。与亲代细胞相比，pd-L1在wsx 1-高表达细胞株449中的表达和总蛋白水平均降低。 WSX 1 P < 0.0001) and 475WSX 1 P =0.0002，图1。 5A，b )，但在WSX 1-敲除细胞( P =0.0028，图1。 5C，d ).
图5：WSX 1过表达下调肝癌细胞中pd-L1的表达。 a WESTERNBLOTTING分析WSX 1、FLAG和Pd-L1的蛋白水平。用编码WSX 1标志(449)的质粒DNA转染肝癌细胞株SNU449和SNU475。 WSX 1 和475 WSX 1 )或载体质粒。 b 流式细胞仪分析WSX 1过表达对细胞表面Pd-L1表达的影响。Wsx 1过表达降低pd-l1的比例 + SNU449中的HCC细胞( n =4个独立实验， P < 0.0001) and SNU475 cells (P =0.0002)。 c SNU398细胞WSX 1和PD-L1蛋白水平的免疫印迹分析。采用CRISPR/Cas9引导RNA对人WSX 1(CrWSX 1)进行敲除，并加入非靶向性的crRNA作为对照(CrCtrl)。 d WSX 1基因敲除增加了pd-l1的比例。 + SNU398细胞中的肝癌细胞( n =4个独立实验， P =0.0028)。 e 从肝癌小鼠模型中获得的小鼠肝细胞的细胞TOF分析的T-SNE图谱见图。 2A 。用PD-L1和WSX 1的表达强度来表示细胞的颜色。 f Pd-L1比例的差异 + (n =4只老鼠， P =0.0012)和WSX 1 + 小鼠肝细胞( P =0.0002)。所示数据是两个独立实验的代表。 g 小鼠肝溶解物中pd-L1蛋白水平的免疫印迹分析(C1-C3代表“癌基因”组的独立样本，T1-T3为“癌基因+WSX 1”组的独立样本)。所有的图像都代表了3个独立的实验。定量数据以均值±sd表示，并由双面学生进行分析。 t 测试一下。** P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. The gating strategy for sorting PD-L1+ 肝癌细胞如附图所示。 8B 。源数据作为源数据文件提供。
为了证实WSX 1与PD-L1在体内的联系，我们对自发性肝癌模型小鼠全肝细胞进行了细胞TOF分析。由于自发性肝细胞癌模型的独特特征，没有明确的界限来区分肿瘤病灶、癌前增生区和正常肝组织。没有特异性的标记物可以区分自发肿瘤细胞和正常肝细胞。因此，我们的进一步研究从整体上分析了肝细胞。与体外实验结果一致，CytoF分析结果表明WSX 1确实降低了pd-L1在肝细胞中的表达。 P =0.0012，图1。 5E，f )，经小鼠肝溶解物免疫印迹分析进一步证实。 5G )。其次，为了进一步支持WSX 1介导的PD-L1下调可以减少T细胞衰竭和增强T细胞介导的杀伤作用的观点，我们用不同比例的活化人效应T细胞(E)和肿瘤细胞(T)进行了共培养实验。WSX 1-过表达449的存活率 WSX 1 (e：t=1：1， P =0.0029；E：t=2：1， P =0.0108)和475 WSX 1 (e：t=1：1， P =0.0022；E：t=2：1， P 0.0038)细胞不到亲本细胞存活率的一半(补充图)。 6A )。此外，与449共培养的T细胞 WSX 1 P =0.0131)和475 WSX 1 P 细胞pd-1表达明显降低(附图)。 6B，c )。以上结果共同验证了WSX 1能下调肝细胞中pd-L1的表达，同时降低pd-L1/pd-1轴介导的T细胞耗竭，保证免疫监测的生物学功能。
WSX 1通过增强gsk 3β介导的pd-l1蛋白降解而使pd-l1失稳 在我们观察到WSX 1下调Pd-L1的基础上，我们试图探索其潜在的分子机制。为此，我们首先测试WSX 1是否参与了PD-L1的转录调控。有趣的是，WSX 1对SNU449或SNU475细胞的PD-L1 mRNA水平无显著影响(图一)。 6A )，提示WSX 1对PD-L1的调节处于蛋白水平。为了验证这一观点，我们用编码标记PD-L1的质粒转染肝癌细胞，该质粒不受内源性PD-L1启动子的调控。正如预期的那样，WSX 1能够下调外源性PD-L1(图1)。 6B )。蛋白酶体抑制剂MG 132的加入进一步证实了我们的观点，该抑制剂显著恢复了WSX 1介导的pd-l1在wsx 1-高表达细胞株449中的下调。 WSX 1 P =0.0027)和475 WSX 1 P =0.0362，图1。 6C，d )。以前的研究报道了e3泛素连接酶介导的赖氨酸48(K48)多泛素化和随后的蛋白酶体降解控制包括pd-l1在内的多种蛋白质的周转。 36 。在MG 132存在时，WSX 1-过表达细胞中检测到Pd-L1的K48泛素化增加(如图1所示)。 6E )。此外，脉冲追踪分析结果显示，WSX 1明显降低了pd-L1蛋白的半衰期(如图所示)。 6f )，支持我们的假设，即WSX 1通过促进其泛素介导的蛋白酶体降解而破坏PD-L1的稳定。
图6：WSX 1通过促进GSK 3β介导的PD-L1降解而使PD-L1失稳。 a QRT-PCR检测显示WSX 1对pd-L1 mRNA表达水平的影响。 n =3项独立实验)。 b WSX 1对外源性PD-L1-旗表达的影响。将编码PD-L1标志的质粒DNA转染SNU449和SNU475细胞，并进行Westernblotting分析。 c 蛋白酶体抑制剂MG 132作用12h后PD-L1蛋白水平的免疫印迹分析。 d 流式细胞仪检测MG 132对细胞表面Pd-L1表达的影响。MG 132抑制WSX 1介导的Pd-L1在两种SNU449( n =5个独立实验， P =0.0027)和SNU475细胞( P =0.0362)。 e WSX 1对PD-L1泛素化的影响。MG 132预处理细胞12h，Pd-L1蛋白被特异性Pd-L1抗体抑制。用抗泛素抗体分析pd-L1泛素化。 f WSX 1对肝癌细胞pd-L1蛋白半衰期的影响。用25 mM CHX处理肝癌细胞0、4、8和12h，分别收集细胞裂解物，检测Pd-L1蛋白水平。 g WSX 1对p-GSK 3β蛋白水平的影响 Ser9 ，总gsk 3β，p-β-catenin Ser33/Ser37/Thr 41 ，以及总β-catenin。β-catenin在Ser33/Ser37/Thr 41上被gsk 3β直接磷酸化，并与p-β-catenin水平成对映体(p-β-catenin)。 Ser33/Ser37/Thr 41 间接反映GSK 3β活性。 h GSK 3β抑制剂LiCl或GSK 3β基因敲除对PD-L1表达的影响。WSX 1-过表达449细胞表面pd-L1的表达 WSX 1 和475 WSX 1 细胞经LiCl处理或转染GSK 3βshRNAs 48h后，流式细胞仪分析。 i 统计分析结果表明，两种LiCl处理( P =0.0135 WSX 1 和 P =0.0052 WSX 1 )和GSK 3β基因敲除( P =0.0020 WSX 1 和 P =0.0015 WSX 1 )增加pd-l1的比例。 + 肝癌细胞( n =5项独立实验)。 j Pd-L1-NP(S176A、T180A和S184 A)的一致基序位点定向突变原理图，GSK 3β不能将其磷酸化。 k SNU449和SNU475细胞分别转染PD-L1野生型(WT)或PD-L1-NP(突变型)或与WSX 1共转染的SNU449和SNU475细胞。流式细胞术检测细胞表面Pd-L1表达水平的变化。 l Pd-L1 MFI比值的定量研究。Pd-L1-NP位点定向突变使WSX 1介导的pd-L1下调在两种SNU449中( n =3项独立实验， P =0.0066，而pd-L1-WT)和SNU475细胞( P 与Pd-L1-WT相比，=0.0004。定量数据以均值±sd表示，用单因素方差分析或学生分析。 t 测试一下。在方差分析中，采用Tuke-Kramer多重比较检验进行配对比较。除非另有说明，所显示的数据和图像是3个独立实验的代表。所有的统计检验都是双面的。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. CHX cycloheximide, SP signal peptide, TM transmembrane domain, ECD extracellular domain, ICD intracellular domain, MFI mean fluorescence intensity. The gating strategy for sorting PD-L1+ 肝癌细胞如附图所示。 8B 。源数据作为源数据文件提供。
糖原合成酶激酶3β(gsk 3β)是一种重要的激酶，可促进pd-l1磷酸化及随后的k48泛素化。 37 。考虑到WSX 1促进PD-L1泛素化，我们研究了WSX 1与GSK 3β在PD-L1降解过程中的联系。为支持这一点，上一份报告 38 发现wsx 1内源水平较低的肝癌细胞株su 449和smu 475均有磷酸化gsk 3β(p-gsk 3β)的基础水平升高。 Ser 9 )，代表GSK 3β激酶活性的抑制。在我们的研究中，wsx 1在su 449和su 475细胞中的过表达导致p-gsk 3β的显著下降。 Ser 9 对GSK 3总β水平无显著影响(图1)。 6g )，提示GSK 3β活性增加。据报道，gsk 3β可在Ser33/Ser37/Thr 41(p-β-catenin)上特异性地磷酸化β-catenin。 Ser33/Ser37/Thr 41 39 ，其水平间接反映GSK 3β酶活性。值得注意的是，p-β-catenin的含量增加了。 Ser33/Ser37/Thr 41 同时，我们也发现了WSX 1增强GSK 3β活性的观点(图1)。 6g )。报道了gsk 3β抑制剂LiCl对pd-l1降解的抑制作用。 40 。在我们的研究中，LiCl治疗对WSX 1诱导的pd-l1在449的下调有很大的帮助。 WSX 1 P =0.0135)和475 WSX 1 细胞( P =0.0052，图1。 6h，我 )。为进一步支持我们的假说，转染了抗人GSK 3β(shGSK 3β)的短发夹RNA，建立了WSX 1基因敲除肝癌细胞。结果，gsk 3β基因敲除在很大程度上逆转了wsx 1诱导的pd-l1在449的下调。 WSX 1 P =0.0020)和475 WSX 1 细胞( P =0.0015，图1。 6h，我 )。此外，我们从野生型PD-L1结构(标志-PD-L1-WT)中，通过突变PD-L1(S176A，T180A和S184 A)上的3个磷酸化共识基序，合成了标志-PD-L1-NP表达结构。 6J )，以前有报道说它完全废除了gsk 3β介导的pd-l1磷酸化。 37 。WSX 1明显下调了旗标-PD-L1-WT，但只略微降低了旗标-PD-L1-NP的表达(SNU449： P =0.0066；SNU475： P =0.0004；图1。 6k，l )。这些结果表明WSX 1通过促进GSK 3β介导的PD-L1磷酸化及随后的降解而下调PD-L1的表达。
WSX 1通过激活PI3Kβ/δ信号通路增强GSK 3δ活性 蛋白激酶B(PKB/AKT)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在体内外均能磷酸化GSK 3β。 41 ,42 。此外，越来越多的证据证明AKT通路在肝癌的发生和pd-l1的调控中起着关键的作用。 2 ,43 。我们推测WSX 1通过调节AKT来增强GSK 3β的活性。事实上，我们发现wsx 1显著抑制了aKT的活化，而pAKT的活性却下降了。 瑟473 (无花果) 7A )。结核蛋白(TSC 2)在Thr 1462被活化的AKT直接磷酸化。 44 。PTSC 2的还原进一步证实了WSX 1对AKT活性的抑制作用。 Thr 1462 (无花果) 7A ).
图7：WSX 1通过阻断PI3Kβ/AKT信号通路，减轻GSK 3δ活性的抑制。 a WSX 1过表达对p-AKT蛋白水平的影响 塞尔473 、AKT、p-TSC2 Thr 1462 免疫印迹法检测肝癌细胞中的TSC 2和TSC 2。TSC 2在Thr 1462被AKT直接磷酸化，从而p-tsc2。 Thr 1462 水平间接反映AKT的活动。 b 流式细胞仪检测AKT再激活对WSX 1介导的PD-L1下调的影响。将WSX 1单独转染SNU449和SNU475细胞，或用膜结合MYR-AKT共转染SNU449和SNU475细胞。统计分析结果显示在右边( n =5个独立实验， P < 0.0001 in both SNU449 and SNU475 cells). c MYR-AKT转染对p-AKT蛋白水平的影响 塞尔473 ，总AKT和pd-l1在449 WSX 1 和475 WSX 1 细胞。 d WSX 1、PD-L1和p-AKT表达的免疫印迹分析 塞尔473 注射FVB/NJ小鼠的全肝溶解物 NRAS/AKT 含有或不含WSX 1的癌基因(左，C1-C4代表“癌基因”组的独立样本，T1-T4为“癌基因+WSX 1”组的独立样本)。WSX 1与PD-L1和p-AKT相关性的统计分析 塞尔473 在小鼠肝脏中表达(右)。 e WSX 1对PTEN、PI3K-P85、PI3K-p110α和PI3K-p110δ表达的影响。 f 影响.的影响 PIK3CD WSX 1介导的PD-L1还原过表达(左)。 PIK3CD PI3K-p110δ编码是PI3Kδ的关键组成部分。重新引进 PIK3CD WSX 1损伤引起的Pd-L1在两种SNU449中的减少( n =5个独立实验， P =0.0001)和SNU475细胞( P =0.0013)。 g WSX 1对 PIK3CD SNU449 mRNA水平( n =3项独立实验 P =0.0139)和SNU475肝癌细胞( P =0.0006)。 h 提示WSX 1通过抑制PI3Kδ/AKT/GSK 3β/PD-L1信号通路，促进抗肿瘤免疫监视。在生理条件下，肝细胞中WSX 1的高表达下调了PIK3δ，从而降低了AKT的激活，从而使GSK 3的β激酶活性从AKT的抑制中释放出来，从而促进了GSK 3β介导的PD-L1的降解。无pd-l1在肿瘤细胞上的过度表达，效应细胞CD8 + T细胞最大限度地发挥其杀伤作用，从而抑制肝癌的发展(左)。否则，WSX 1的缺乏导致不受控制的肿瘤性PD-L1的表达，并最终导致肿瘤免疫逃避(右)。 i WSX 1，PI3Kδ，AKT，GSK 3β和PD-L1相互作用原理图。定量数据以均值±sd表示，并进行单因素方差分析或学生分析。 t 测试一下。在方差分析中，采用Tuke-Kramer多重比较检验进行配对比较。相关分析采用Pearson相关检验。除非另有说明，所显示的数据和图像是3个独立实验的代表。所有的统计检验都是双面的。* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. myr-AKT myristoylated AKT. The gating strategy for sorting PD-L1+ 肝癌细胞如图所示。 8B 。源数据作为源数据文件提供。
上述结果为我们制定了一条途径，其中WSX 1通过激活AKT促进GSK 3β介导的PD-L1降解。为了支持我们的观点，我们转染了编码肉豆蔻酰化AKT(MYR-AKT)的质粒，以重振WSX 1-高表达的肝癌细胞中的AKT活性。事实上，转染MYR-AKT会增加AKT总量和p-AKT。 瑟473 蛋白质水平(图1. 7C )。更重要的是，AKT活性的恢复几乎完全逆转了WSX 1诱导的pd-l1在两种情况下的下降。 WSX 1 P < 0.0001) and 475WSX 1 细胞( P < 0.000, Fig. 7b，c )。为了支持这一体外观察，我们在肝癌小鼠模型中的体内研究发现WSX 1的表达与pd-L1水平呈负相关。 r =−0.7802， P =0.0224)和AKT活化( r =−0.8662， P =0.0054)，用WSX 1、pd-L1和p-aKT的蛋白质水平来衡量。 瑟473 (无花果) 7D )。同时，我们的结果揭示了Pd-L1稳态调控的负调控机制，其中WSX 1阻止AKT介导的GSK 3β抑制，从而激活GSK 3β对PD-L1的降解。
接下来，我们研究了WSX 1对AKT磷酸化的影响。据报道，导致AKT活化的典型途径主要是由磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的激活引起的，其活性可被抑癌基因PTEN所抑制。 41 。PI3K包含催化亚基p110-α，-β，-γ和-δ的4种异构体。 45 。其中PI3Kδ是PI3K亚型之一，构成激活aKT信号通路，在肝癌组织中有高表达，在肝脏恶性肿瘤中发挥重要作用。 46 ,47 。有趣的是，WSX 1对PTEN、PI3K-P85(PI3K调节亚单位)或PI3K-p110α(PI3Kα)均无显著影响，而对PI3K-p 110δ(PI3Kδ，图1)有明显的下调作用。 7E )。为了揭示PI3Kδ的降低是否与wsx 1诱导的pd-l1下调有关，我们重新引入了 PIK3CD ，编码PI3Kδ，在WSX 1-高表达肝癌细胞中表达。我们的结果表明，与外源转染MYR-AKT一样，PI3Kδ的重新导入在很大程度上损害了WSX 1介导的PD-L1的还原(SNU449： P =0.0001；SNU475： P =0.0013；图1。 7F )。为了进一步探讨WSX 1是如何下调PI3Kδ的，我们对WSX 1高表达和亲代肝癌细胞进行了rna-seq和qRT-PCR分析。我们的结果一致表明WSX 1显著减少了 PIK3CD 两种基因的mRNA水平 WSX 1 P =0.0139)和475 WSX 1 细胞( P =0.0006)，提示WSX 1转录抑制PI3Kδ的表达。 7g )。WSX 1对PI3Kδ/AKT/GSK 3β/PD-L1信号转导的影响在WSX 1-敲除细胞中也得到证实(附图)。 7 ).
总之，在上述结果的基础上，我们能够揭示WSX 1、PI3Kδ、AKT、GSK 3β和PD-L1的相互作用模型(图1)。 7H，i )。具体来说，在生理条件下，wsx 1在肝细胞中高表达，通过调控pd-l1的pd-l1水平，调控pd-l1信号通路，使pd-l1在正常肝细胞上稳定表达，从而使pd-l1在正常肝细胞中稳定表达，从而产生有效的CD8。 + T细胞介导的免疫监测。然而，当WSX 1被多种致癌信号下调时，PI3Kδ从WSX 1介导的转录失活中逃脱，从而导致转录失活。高活性的AKT使GSK 3β失活，从而阻断GSK 3β介导的Pd-L1降解，导致Pd-L1在恶性肝细胞上过度表达，导致Pd-L1/Pd-1轴介导的肿瘤免疫逃逸，最终导致肝癌的发生发展。
