BRAF V600E 和转化生长因子β-受体丢失驱动的Wnt-低肿瘤在右半结肠。 鉴于rCRCs与 BRAF 、转化生长因子β-受体信号的缺陷和失配修复基因的表观遗传沉默 MLH 1 2 ，我们针对这些突变到小鼠肠道。我们使用他莫昔芬诱导的肠上皮细胞特异性维林Cre。 呃 有条件地激活 BRAF LSL-V600E 敲入等位基因，或删除编码转化生长因子β受体TGF BR 1/ALK 5或错配修复蛋白MLH 1的基因的杂合等位基因。 TGF-BR 1/ALK5 Fl/fl 或 MLH 1 Fl/fl 分别) 26 ,27 ,28 。维林Cre 呃 碱5 Fl/fl 小鼠(被指定为A)没有因所指示的诱导机制而发展成肿瘤(一次为3毫克)，而另一组接受更严格制度的20只小鼠(连续天为3毫克，2毫克)则未在475天内发展成肿瘤(图1)。 1A )。此外，VillinCre 呃 MLH 1 Fl/fl 和VillinCre 呃 BRAF LSL-V600E/+ (指定B)小鼠主要在小肠内发生肿瘤(图一)。 1A ，补充图。 1A，b ).
图1：上皮特异性 BRAF V600E 突变与失去转化生长因子β受体信号一起驱动右侧肿瘤的发生，而不激活Wnt通路。 a Kaplan-Meier生存曲线显示肠道无瘤生存(诱导后几天) 呃 BRAF V600E/+ (B) n =11；3毫克他莫昔芬诱导)，VillinCre 呃 碱5 Fl/fl ( a； n =3；3毫克他莫昔芬诱导)和VillinCre 呃 BRAF V600E/+ 碱5 Fl/fl (学士； n =18；2mg他莫昔芬诱导小鼠。一只小鼠在诱导后550天被检查(用Kaplan-Meier曲线上的勾痕表示)。(*) p =1.835e−7，B与BA比较；Mantel-Cox对数秩检验，双尾检验). b BA小鼠结肠代表H&E染色 n =8)(瑞士卷)。右侧，左面板虚线区的高倍率，突出腺癌的近端(右侧)结肠位置。标尺，500μm。 c BA小鼠肠道肿瘤部位评分( n =11只老鼠)。平均±S.E.M.(*) p =0.0194，* p =0.0003，* p =8.5E−6；Mann-Whitney U -测试，双尾)。 d 图示BA小鼠肠道肿瘤分布，圆周大小与区域肿瘤数成正比( c )。蓝色，盲肠，近端结肠；红色，左结肠(降)至直肠；对角线，脾曲。 e 典型的肠系膜浸润图像，肿瘤上皮以点状轮廓(H&E；左侧)和粘液染色(AcianBlue/PAS；右侧)突出显示于BA小鼠的原发肿瘤切片( n =5)。标尺，500μm。 f 具有代表性的肿瘤切片，来自VillinCre 呃 APC Fl/+ 、B、BA小鼠( n =5只小鼠(每组5只)，免疫组化β-catenin和Wnt-通路激活标记物染色。 Lgr5 , Axin 2 ，和 鼻孔 (ISH)。标尺，100μm。 g WT VS中Wnt激活(WA)签名的方框图 BRAF -来自患者的突变型CRCs，右侧和左侧CRCs，跨CMS亚型.中值显示的框从第25至75百分位数和晶须，它扩大了1.5×四分位数范围。左面板 n =579，中间 n =604和右 n =467个独立样本(左、中面板：*) p < 0.001, T -试验，双尾；右面板：* p < 2e−16, T -试验，两尾)。
我们认为β受体失活是由于错配修复缺陷(由微卫星序列引起)在人类癌症中发生的。 TGF-BR 2 ，从小鼠基因组中缺失) 29 -可能与突变体braf协同引发右侧结肠肿瘤。的确，VillinCre 呃 BRAF LSL-V600E/+ 碱5 Fl/fl (指定BA)小鼠与B小鼠相比，肿瘤迅速发展，中位生存期分别为192天和485天。 1A )。最关键的是，BA小鼠的腺癌主要发生在近端结肠，相当于人的右结肠(图1)。 1B-d )。进一步重组RCRC，BA肿瘤表现出扁平/无柄的形态，黏液的分化和明显的侵入肠系膜的能力(见图)。 1B 、e)。
为了确保ba小鼠肿瘤的优势右侧不受肠道长度的局部重组效率的影响，我们在Villincre中对tdato报告基因的表达进行了评分。 呃 Rosa 26 LSL-tdTomato/+ 小鼠服用不同剂量的他莫昔芬。事实上，当剂量为80毫克/千克时，虽然出现的肿瘤是右侧的，但与小肠相比，结肠和盲肠的重组效率最低，这凸显出该模型中肿瘤的优先右侧性是特定遗传背景的结果(补充图1)。 1C ).
TGF-β生长抑制信号是通过一个由TGF-BR 1/ALK 5和TGF-BR 2同源二聚体组成的异四聚体复合物传递的。鉴于 TGF-BR 2 比在 TGF-BR 1 在人类肿瘤中 30 ，我们还生成了VillinCre 呃 BRAF V600E/+ TGF-BR 2 Fl/fl 小鼠 31 。这些小鼠还发展主要是近端结肠腺癌，直接再现BA模型(补充图)。 1D )。重要的是，BA和VillinCre之间的这种共同的表型 呃 BRAF V600E/+ TGF-BR 2 Fl/fl 小鼠排除非典型受体特异性转化生长因子β信号在抑制右侧肿瘤发生中的作用。
接下来，我们试图确定BA肿瘤是否表现出Wnt通路的激活。不像APC-缺陷(VillinCre) 呃 APC Fl/+ )或B型肿瘤，BA瘤未见核β-catenin积聚(图1)。 1F )。此外，我们还检测到某些wnt靶基因的表达减弱。 Lgr5 , Axin 2 ，和 鼻孔 )和我们先前报道的wnt-目标基因标记。 32 ，证实这些右侧结肠肿瘤缺乏Wnt通路激活(图一)。 1F ，补充图。 2 )。使用VillinCre的rna-seq(rna-seq)数据 呃 APC Fl/fl 肠组织，在诱导后第4天收获，我们接下来衍生出一个Wnt激活(WA)信号(补充图)。 3A )，过滤后只保留聚集在一起的上皮基因。 AXIN 2 (β-catenin依赖性wnt信号的一个重要的转录靶点)在大量的人类基因表达数据中 33 ,34 ,35 。重要的是，这一特征在病人肿瘤中被显著下调。 BRAF -与 BRAF 野生型对应物，右侧和左侧位置，CRC共识分子亚型(CMS)1(为MSI和炎症/免疫基因的表达富集)和CMS 2(富集于与典型Wnt信号相关的基因；图1)。 1g )36 。这些结果表明，虽然BRAF的激活并不足以促进右半结肠肿瘤的形成，但上皮型β受体信号的同时丢失与人rCRCs的组织学特征和减弱的Wnt/β-catenin信号共同参与了近端结肠肿瘤的发生。
BA肿瘤从早期开始就表现出胎儿样的分化。 由于明显缺乏 Lgr5 + 在BA肿瘤中，我们下一次确定这些肿瘤是否再现了 Lgr5 -独立的胎儿球形签名 21 与电离辐射或葡聚糖硫酸钠(DSS)处理后的再生反应相关 20 ,23 。Rna-seq和基因集富集分析(Gsea)显示，与Villincre相比，BA肿瘤与胎儿样信号有很强的关联。 呃 (WT)控制(图1. 2A-C ，补充表 1 )。值得注意的是，这些胎儿标记包括 Ly6a 和 Anxa 1 ，两个基因在dss诱导的再生过程中高表达。 20 。我们还发现BA肿瘤中与炎症反应相关的基因的富集(图一)。 2A ，右面板) 37 。考虑到许多胎儿标记物可能由基质细胞表达，特别是免疫浸润，我们证实了某些胎儿标记物在上皮细胞中的特异性表达。 Ly6a 和 Anxa 1 )通过原位杂交(ISH)。 二维空间 )。有趣的是，细胞角蛋白7--一种通常不在成人肠道上皮中表达的角蛋白，而是胎儿基因程序的一个组成部分--在BA结肠肿瘤上皮中强烈表达(补充图1)。 1E )。事实上，CK7在crc中被作为锯齿路径的独立标记而被提出。 38
图2：WNT-低的，右侧的肿瘤表现出胎儿样的信号，从早期开始存在. a GSEA图显示胎儿球体的富集和特征性炎症反应信号在端点BA结肠肿瘤( n =4)VS WT近端结肠( n =3)。其他正常浓缩分数，FDR错误发现率。( p =0.0，代表 p < 0.001 calculated empirically.) b 热图显示Z评分转化的胎儿特征基因的相对表达水平在BA肠肿瘤端点间差异表达( n =4)和WT近端结肠组织( n =3)。 c BA肠肿瘤与WT近端结肠中胎儿标记物的qRT-PCR检测(英文) n =每组4只)。平均±S.E.M.(*) p =0.0286，与WT比较；Mann-Whitney U -测试，双尾)。 d 胎儿标记物染色的代表型肠肿瘤上皮ISH Ly6a 和 Anxa 1 (n =5只老鼠)。标尺，100μm。 e GSEA图显示胎儿球体征(左面板)正富集， Lgr5 + 诱导后30天BA近端结肠组织与WT对照组织的ISC签名(右面板) n =每组5人)。其他正常浓缩分数，FDR错误发现率。( p =0.0，代表 p < 0.001 calculated empirically.) f 热图显示Z评分转化的胎儿特征基因在BA近端结肠组织中的相对表达水平( n =5)，与WT( n =4)，上岗后30天。 g 诱导后30d，A、B、BA标记物与WT近端结肠组织标记物的qRT-PCR检测(英文) n =每组4人)。平均±S.E.M.(*) p =0.0286，与WT比较；Mann-Whitney U -测试，双尾)。 h 代表WT和BA结肠近端组织的ISH，胎儿标记物染色 Ly6a 和 Anxa 1 ，30天后上岗( n =每组5人)。标尺，100μm。
接下来我们将讨论胎儿样基因信号是否在肿瘤发生过程中出现，或者它是否早于肿瘤发生时出现。为此，我们在诱导后第30天(D30)从BA和WT小鼠的结肠近端组织中提取，并在此早期用rna-seq检测相同的胎儿标记物的表达。事实上，我们发现胎儿样基因的特征明显丰富，并且抑制了 Lgr5 + ISC签名 22 (无花果) 2e-g ，补充表 1 )在D30 BA组织中相对于WT近端结肠。我们再次证实了上皮细胞特异性表达 Ly6a 和 Anxa 1 (图) 2H ).
在rCRCs和我们的BA模型中显示了低Wnt通路的激活(如图所示)。 1F G，补充图。 2 接下来，我们从我们的端点肿瘤和d30 BA RNA-seq数据(补充图)中生成了一个类似的上皮特异性基因标记(命名为BA)。 3B )。使用此ba签名查询crc患者数据集。 34 ,35 ，我们发现与 BRAF CRC患者肿瘤的突变、右侧和CMS 1亚型(图1)。 3A-c )。我们还发现，我们的BA和WA信号及其相关CMS亚型在患者样本中呈显著的负相关，我们的BA信号与Mustata等人的胎儿球体特征呈正相关。 21 (无花果) 三维空间 ，补充图。 3C )。此外，我们观察到我们的BA特征与更高级的原发性肿瘤分期(T3-4)之间有显著的关联，这与我们的BA模型的局部侵袭行为一致(图1)。 3E )。因此，我们的BA信号也与复发患者的生存期较短有关，并显示复发时腹膜疾病发生率增加的趋势(图1)。 3F ，补充图。 三维空间 )，符合rCRCs患者转移扩散的模式。 12 ,13
图3：预后不良 BRAF -突变型，右侧患者CRCs是Wnt-低，并表达BA标志从一开始. a 在WT VS中显示BA签名的表达式 BRAF -来自病人的突变型CRCs( n =579)。中位数显示为方框，从第25百分位数延伸至第75百分位数，而晶须则延伸1.5×四分位数范围(*) p =3.58e−5；T检验，双尾)。 b 例图显示患者右侧和左侧CRCs BA信号的表达( n =604)。中位数显示为方框，从第25百分位数延伸至第75百分位数，而晶须则延伸1.5×四分位数范围(*) p =1.28e−9；T检验，双尾)。 c 框图显示跨CMS子类型的BA签名的表达式( n =461)。中间值显示为方框，从第25百分位数延伸至第75百分位数，而晶须则是间隔范围的1.5倍(*) p =2.16e−13；T检验，双尾)。 d 人肿瘤WA和BA特征值的散点图呈负相关(Pearson‘s) r =−0.232， p =8.36e−9，双面)( n =467)。CMS图被覆盖，突出了CMS 1和CMS 2子类型之间签名的差异表达。CMS 1(MSI-高，免疫)：橙色；CMS 2(典型Wnt信号)：蓝色；CMS 3(代谢失调)：粉红色；CMS 4(间充质)：绿色。中位显示的框，从第25至75百分位数和胡须，它延长了1.5倍的中间四分位数范围。 e BA信号在T3-4人肿瘤中的表达高于T1-2(*) p =0.0002；t检验，双尾)( n =604)。中间显示的框，从第25至75百分位数和胡须，扩大了1.5×四分位数范围。 f 具有BA特征性高肿瘤(红色)的患者在复发后的存活时间比携带BA信号的患者-低肿瘤患者(蓝色)(*)要短。 p =0.00016；Wald检验，双尾)( n =197)。 g 管状绒毛腺瘤(TVA)中WA信号的表达较高。 n =29)高于无柄锯齿状腺瘤(SSA)( n =15)(*) p =1.538e−05；t检验，双尾)。中间显示的框，从第25至75百分位数和胡须，扩大了1.5×四分位数范围。 h BA信号在无柄锯齿状腺瘤(SSA)中的表达高于管绒毛腺瘤(TVA)(*)。 p =1.498E−05； T -测试，双尾)。中间显示的框，从第25至75百分位数和胡须，扩大了1.5×四分位数范围。 i BA信号的较高值与WA信号在TVA/SSA人癌前病变中的低表达值显著相关(Pearson‘s)。 r =−0.66， p =1.11e−06)。回归曲线为95%置信区间(阴影区)。
我们还观察到在无柄锯齿状腺瘤/病变(Ssa)中BA的特征与肾小管绒毛腺瘤(Tvas)相比显著增加，而管绒毛腺瘤(Tvas)是CRCs癌前病变与突变相关的。 BRAF 和Wnt-途径的成分，分别(图)。 第三代 、h) 39 。此外，我们发现这些癌前病变中的WA和BA信号之间存在显著的负相关关系，这意味着它们的基础生物学从一开始就存在着根本的差异(图1)。 3I )39 。这些数据支持了这样一种观点，即表达胎儿样BA信号的细胞存在于人类右侧肿瘤发生的早期阶段，这与我们在BA模型中的发现相似，在BA模型中，这种特征是在早期肿瘤发生过程中出现的。
BRAF V600E 促进Yap依赖的胎儿样分化 转录辅激活子yap在损伤再生过程中对胎儿重编程的中心作用 20 ,23 接下来，我们检查了我们的端点肿瘤和d30 RNA-seq数据，以确定在我们的BA模型中YAP活性是否与胎儿样表型有关。利用由Gregorieff生成的yap目标基因签名 等人 .=‘class 1’>在终点肿瘤和d30个BA结肠组织中，我们发现与YAP的激活有很强的相关性(图). 4A 、b、补充表 1 )23 。这个yap标记中的顶级基因特别包括胎儿标记，例如 Ly6a 和 Anxa 1 ，以及经典的YAP目标，例如 CTGF 23
图4：BRAF V600E 通过YAP激活促进胎儿样分化，支持近端结肠的细胞活力。 a GSEA图显示BA端点肿瘤中YAP的上调和下调基因信号的富集( n =4)VS WT近端结肠( n =3)。其他正常浓缩分数，FDR错误发现率。( p =0.0，代表 p < 0.001 calculated empirically.) b GSEA在诱导后30天，BA近端结肠组织与WT对照组织中YAP上调和下调基因信号阳性富集(P<0.05)。 n =每组5人)。其他正常浓缩分数，FDR错误发现率。( p =0.0，代表 p < 0.001 calculated empirically.) c 诱导后30d，qRT-PCR检测法基(vs-4718)处理的BA小鼠近端结肠组织中的胎儿标记物(qRT-PCR)。 n =5只小鼠。平均±S.E.M.(NS不显著；** p =0.0079；Mann-Whitney U -测试，双尾)。 d QRT-PCR Lgr5 用4-羟基他莫昔芬体外诱导，并于诱导后5天取样，检测出BA细胞器中的胎儿标记物。 n =3株未诱导BA小鼠的细胞器系)。折叠变化显示相对于未诱导的器官(Etoh处理)。平均±S.E.M.(*) p =0.05；Mann-Whitney U -测试，双尾)。 e QRT-PCR Ly6a 在BA类有机物中，用4-羟基他莫昔芬体外诱导，用药后48h取样，诱导后5天。药物在DMSO载体(0.1%)中重组，最终浓度为：维泊芬(YAPI；3μM)、AZD 6244(MEKI；100 NM)、ERKI(100 NM)、eCF 506(SRCI；50 NM)和VS-4718(Faki；1μM)。 n =3株未诱导BA小鼠的细胞器系。折叠变化显示相对于DMSO处理，诱导的器官.平均±S.E.M.(*) p =0.05；Mann-Whitney U -测试，双尾)。 f 具有代表性的结肠及盲肠近端H&E染色 BRAF V600E/+ 碱5 Fl/fl 雅普 Fl/fl 诱导后6天，小鼠出现严重的上皮丢失和坏死，与BA对照组比较，差异有显着性( n =每组5只)。标尺，500μm。 g 免疫荧光法检测培养的BA和VillinCre； APC Fl/+ 肿瘤球体为SCA 1/LY6A(绿色)和YAP 1(红色)。细胞核用DAPI(蓝色)染色。合并的图像显示在右侧。有代表性的 n =3个生物复制体。标尺，100μm。 h BrdU百分比的图像分析评分 + WT近端结肠上皮细胞 n =6)、A( n 4)、B(n=6)和BA( n 6)小鼠，诱导后30天。平均±S.E.M.(NS不显着；Mann-Whitney) U -测试，双尾)。 i Caspase 3裂解率的图像分析评分 + WT近端结肠上皮细胞 n =6)、A( n =4)、B( n =6)，及广管局( n 6)小鼠，诱导后30天。平均±S.E.M.(**) p =0.0076，Mann-Whitney U -测试，双尾)。
接下来，我们使用特征良好和有效的药理学药物来询问在我们的BA模型中诱导YAP激活的信号通路。以往的研究表明，在dss诱导的结肠炎和再生过程中，由细胞外基质重塑而触发的yap的激活依赖于fak信号。 20 。然而，我们不能用fk抑制剂vs4718在体内抑制胎儿程序。 40 ,41 (Faki)，暗示在我们的BA模型中，机械转导不参与YAP的激活(图)。 4C ).
对B和BA小鼠肠道FITC-葡聚糖摄取的评估显示了明显的肠屏障缺陷(补充图)。 4B )，与盲肠和近端结肠中明显的固有中性粒细胞浸润有关(补充图。 4C )。这种局部炎症与肿瘤灶的形成共同定位，提示在我们的BA模型中微环境信号可能在触发胎儿样表型中起作用。因此，我们从未诱导的BA和B小鼠中产生了有机物，并在体外诱导了基因重组。重要的是，在这些无菌培养条件下，在没有基质影响的情况下，突变体的诱导。 BRAF 单独一次就足以激活胎儿样程序，同时也会丢失 Lgr5 以及胎儿标记物的扩增(图1. 4D ，补充图。 5A )。在细胞器环境中，FAK的选择性抑制剂不影响胎儿标记物的表达(Vs4718)。 40 ,41 或SRC(ECF 506) 42 ，但MEK抑制剂(AZD 6244)对其有明显的抑制作用。 43 ,44 、ERK 45 ，和YAP(脊椎动物鳍) 20 (无花果) 4E )，MEK和ERK抑制剂抑制典型MAPK靶点的有效性。 杜斯普6 (补充图。 5B )。尤其是MEK抑制剂AZD 6244对BA小鼠的治疗作用 43 ,44 (Meki)明显抑制胎儿标记物的表达，证实MAPK通路在体内胎儿样表型形成中的作用(补充图)。 4A )。这些结果表明MAPK激活的突变与YAP信号直接结合，从而以上皮细胞内禀ERK依赖的方式诱导胎儿重新编程。在这方面，通过yap体外抑制来抑制胎儿样表型，增加了胚胎样分化程序可能是一种直接启动的适应性存活机制。 BRAF -突变上皮。为了用遗传学的方法测试yap在体内的作用，我们生成了 维林Cre 呃 BRAF V600E/+ 碱5 Fl/fl YAP Fl/fl 老鼠。在他莫昔芬诱导后，这些小鼠迅速减轻体重和腹部驼背，并必须在诱导后第6天取样，因为这些临床症状。组织学评价 维林Cre 呃 BRAF V600E/+ 碱5 Fl/fl YAP Fl/fl 肠组织证实了YAP对肠上皮细胞存活的必要性，因为在没有YAP的情况下，我们在近端结肠中检测到明显的上皮坏死，尽管它在肠道其他部分也很明显(见图)。 4F )。与以往文献一致，他莫昔芬诱导 维林Cre 呃 YAP Fl/fl 小鼠无明显表型 46 ，证实YAP对正常肠道内稳态是可有可无的。
我们还注意到 BRAF 他莫昔芬体外诱导突变体(B和BA)在Matrigel中生长，只有在PGE 2存在的情况下才能成功传代。PGE 2是一种强有力的炎症介质，曾被证明是支持胎儿肠球体传代的培养基的关键成分。 47 。在长期培养中，终点肿瘤BA球体也表现出这种PGE 2-依赖性，并保持着相同的胎儿样表型，LY6A的表达和YAP 1的核定位证明了这一点(见图)。 4G )。考虑到我们的右侧结肠肿瘤发生的BA模型中的叶区域炎症，鉴于最近描述的创伤后创面愈合过程中对PGE 2的芽周间质产生的需求，外源性pge 2对长时间器官传代的需求可能具有重要的意义。 48 。这提示YAP和COX 2(合成PGE 2的酶)的联合抑制可能对治疗突变型braf驱动的rCRCs有一定的疗效。
重要的是，突变体braf单独驱动胎儿样分化的能力表明，braf信号本身并不抑制胎儿的表型，而是独立地抑制肿瘤的发生。D30近端结肠组织BrdU阳性评分清楚地表明，消融上皮β受体信号对上皮细胞增殖无影响(图1)。 4H )。突变体braf在体内诱导的凋亡水平升高，但在上皮特异性失活转化生长因子β受体信号后被抑制，表明对细胞死亡的敏感性降低(图一)。 4I )如先前所报告的那样，在β受体信号丧失之后。 49 。综上所述，这些发现表明，失去转化生长因子β-受体信号使结肠上皮细胞逃避凋亡，而不是增强其增殖能力。
右侧肿瘤的发生是由微生物引起的炎症所支持的。 我们的结果表明，突变braf可以通过激活yap启动类细胞器中的胎儿样表型，而不需要额外的遗传事件或上下文线索的输入。尽管如此，BA肿瘤的近端结肠位置--一个由肠道菌群大量定植的区域--以及在肿瘤发生早期明显存在的局部炎症，增加了局部微环境因素可能影响肿瘤发生的可能性。事实上，我们的数据显示，黏膜屏障的完整性在BA组织中受到损害，很可能使上皮暴露在肠道微生物群和有毒代谢物中，从而通过引发炎症来促进肿瘤的发生。 24 ,50 。为了验证这一点，我们从他莫昔芬诱导时起用广谱抗生素治疗BA小鼠(补充图)。 6A )。抗生素能显著延长BA小鼠的存活率并减少肿瘤数量，但这种作用仅对右侧肿瘤有显着意义(图一)。 5A ，b，附图。 6B )。对抗生素和载体处理的d30 BA小鼠rna-seq分析的比较证实，前15条路径中有11条被抗生素治疗显著下调，与炎症和免疫应答有关(补充图)。 6C )。虽然仍然存在，但胎儿样表型受到抑制，胎儿标记物的表达减少，包括 Ly6a , Ly6d , Krt 7 ，和 Anxa 1 ，特别是在整个组织和上皮室(如图所示)。 5C ，补充图。 6d )。这些发现支持了这样一种假设，即尽管 BRAF 突变本身驱动胎儿样分化，微生物驱动的炎症是BA模型中早期肿瘤形成的另一个关键因素，而局部微生物环境支持肿瘤的形成、向右和疾病的进展。因此，我们的研究建立了上皮间的协同关系。 BRAF V600E 突变，失去转化生长因子β受体信号，和局部炎症微环境驱动右侧，胎儿样肿瘤。
图5：炎症和上皮性转化生长因子β受体丧失在胎儿样肿瘤形成中起协同作用. a Kaplan-Meier生存曲线强调无瘤生存(在他莫昔芬诱导后的几天) n =28)及经抗生素处理的( n =28)BA小鼠(*) p =0.0006；曼特尔-考克斯对数秩检验，双尾检验)。 b 经车辆治疗的肠道肿瘤总数( n =28)及经抗生素处理的( n =28)BA小鼠。平均±S.E.M.(*) p =2.9E−7；Mann-Whitney U -测试，双尾)。 c 诱导后30天定量逆转录聚合酶链反应(QRT-PCR)对BA小鼠结肠近端组织标记物的定量检测(英文) n =4只小鼠。折叠变化显示相对于车辆处理的BA小鼠平均±S.E.M。(*) p =0.0286；Mann-Whitney U -测试，双尾)。 d Kaplan-Meier生存曲线显示舒林达克治疗A的存活时间(诱导后数天) n =5)和B( n =3)小鼠。 e 舒林酸治疗小鼠肠道肿瘤定位评分(英文) n =5)。平均±S.E.M.(NS不显著；* p =0.0397，** p =0.0079；Mann-Whitney U -测试，双尾)。 f 磺胺酸治疗近端结肠肿瘤的代表ISH，胎儿标记物染色 Ly6a 和 Anxa 1 (n =5只老鼠)。标尺，100μm。 g GSEA的rna-seq数据从磺胺酸治疗的A和WT近端结肠组织，30天后诱导，使用胎儿球体(左面板)和 Lgr5 + Ic(右面板)基因签名( n =每组4只)。其他正常浓缩分数，FDR错误发现率。(左面板- p =0.0，代表 p < 0.001, Right panel—p =0.008，按经验计算。) h 磺胺酸处理A小鼠结肠近端组织中胎儿标记物的qRT-PCR与WT小鼠比较，诱导后30d。 n =每组4只)。折叠变化显示相对于未治疗的WT小鼠。平均±S.E.M.(*) p =0.0286；Mann-Whitney U -测试，双尾)。
炎症以一种与MAPK无关的方式驱动结肠肿瘤的发生。 接下来，我们试图建立损伤和炎症的模型，以确定它们是否足以启动和驱动B或A小鼠的肿瘤发生。大剂量舒林达治疗已被证实会导致近端结肠上皮损伤。 51 。因此，为了提供一个简短的炎症/损伤窗口，我们在诱导后立即给予舒林达14天(补充图)。 7A )。这种急性侮辱足以导致A，而不是B小鼠近端结肠肿瘤的形成(如图所示)。 5D )。磺胺酸治疗的小鼠肿瘤几乎完全是右侧的(图一)。 5E )，与受伤地点一致 51 。与BA模型相似，磺胺酸治疗的A型肿瘤具有侵袭性，有黏液性组织学表现，并对上皮室胎儿的转录本呈强阳性染色(图一)。 5F ，补充图。 7b )。此外，在诱导后第30天(停止治疗后16天)，从磺胺酸处理的A小鼠的近端结肠组织中，胎儿样信号有显著的阳性富集，而 Lgr5 + 如在BA小鼠中观察到的那样。 5G H，补充表 1 ).
考虑到BRAF的能力 V600E -驱动MAPK激活在体外直接启动一个类似胎儿的程序，我们接下来将讨论MAPK激活是否是通过舒林酸驱动的炎症在体内出现的胎儿样分化的原因。利用MEK抑制剂AZD 6244，我们证明在WT小鼠中，胚胎样程序的激活可能不依赖于MAPK的激活(补充图)。 7C ).
舒林酸诱导的炎症驱动小鼠右侧肿瘤发生的能力反映了BA小鼠急诊肿瘤的形貌。因此，我们接下来讨论是否可以通过引导炎症到不同的部位来影响肿瘤形成的位置。Dss以前曾被证明能推动转化生长因子β受体基因敲除小鼠的肿瘤发生。 52 。利用该模型，我们证实DSS诱导的炎症诱导A小鼠肿瘤形成.不出所料，突发性结肠肿瘤具有侵袭性，呈粘液组织学特征，缺乏Wnt通路的激活，并在其上皮中表达胎儿的转录本。重要的是，这些肿瘤位于结肠的远端，就像DSS治疗一样(补充图)。 7D-f )。这些发现表明，在炎症刺激驱动胎儿样上皮分化的情况下，转化生长因子β受体信号的丧失是允许炎症部位出现侵袭性结肠肿瘤的原因之一。
