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免疫荧光技术

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发表时间:2018-08-30 15:21作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

免疫荧光技术


Coons等于1941年合成了异氰酸荧光黄(FIC),能有效地标记抗体球蛋白而不损害抗体的活性,但标记困难,不易普及。其后,于1958年又成功地合成了异硫氰酸荧光黄(fluorescein isothiocyanate, FITC),它既易与Ig形成稳定的结合物,又不影响Ab的活性,从而使得免疫荧光技术得到了迅速推广,几经改进简化,现又出现了吖啶橙免疫荧光法(AOFA)和荧光标记A蛋白试验等。现将其分别简介如下:


(一) 荧光抗体检测法(fluorescence antibody assay) 是应用FITC或罗丹明B(lissamine rhodamine B,RB200)等与提纯的抗体球蛋白相结合,制成所谓的荧光抗体,然后将其滴加于事先涂好被检抗原标本的载玻片上,经过一定时间染色,冲洗后,再用荧光显微镜做检查的一种方法(直接法)。如在被检标本中存在相应的微生物,则发生特异的抗原抗体反应,在荧光显微镜的视野内,不但可以看到典型形态的微生物,而且在微生物上还可以看到发出特异的草绿色荧光,由此可对被检标本作出诊断。

荧光抗体检测法在实际工作中还可根据自身条件,采用间接法。直接法操作虽比较简单,特异性较高,但敏感性稍低,适用于对相应微生物的直接检测。间接法的操作较复杂,但可以只用一种标记了荧光素的抗IgG的免疫球蛋白检测多种微生物,其敏感性较直接法约高10倍,但易产生非特异性荧光。另外,还有所谓的抗补体法,但在检验工作中应用的不多。

由于荧光抗体技术日趋完善,已成为一项既准确又快速的诊断技术,尤其是检测含微生物少,污染严重的标本时,更可显示出其独特的优点。本法主要用于炭疽、猪丹毒、布鲁氏菌病、鼻疽、沙门氏菌病、猪瘟、猪水泡病、马传贫、流乙脑炎等的快速诊断。另外,也可用以检查病原微生物在机体内的分布,血清抗体的滴度等。


(二) 吖啶橙免疫荧光法(AOFA) 用高倍稀释的吖啶橙溶液(1∶8万~1∶16万~1∶100万)与2~4单位的特异免疫血清等量混合后制成的诊断液,用其着染被检标本,如其中含有相应细菌,则与诊断液中的抗体结合,并产生特异的荧光,特别是细菌被抗体凝集成菌团后,用高稀释度的吖啶橙液仍可使细菌明显着色,然后以1 000r/min离心5~10分钟,取沉淀物倒于玻片上,用低倍荧光显微镜观察荧光菌团现象,当看到疏松,边缘不整齐,呈淡绿色的荧光菌团,大小在1mm以上者为阳性,然后用白金耳挑取荧光菌团作进一步的培养鉴定。 本法是在血清学的特异性和荧光法的敏感性基础上,与分离培养相结合而建立的一种方法,并且又通过低速离心沉淀和高度稀释的荧光色素的作用,加速了凝集,既能达到增大细菌凝块,又可减少类属抗原抗体交叉凝集反应的目的,并由于抗原-抗体的选择性凝集作用,而排除了标本中杂菌及杂质的干扰,并且能从荧光菌团中分离到活细菌,以作出确切的诊断,因而增加了本法的特异性、敏感性和快速性。根据荧光菌团作为初筛预报结果,可以在30分钟内完成,从荧光菌团分离培养至作出确切诊断,可在14~18小时内完成,比常规培养法提前20~30小时;用此法分离到细菌的阳性率,比常规法高3倍左右;此外本法不用提取Ig,与免疫血清混合、制成诊断液即可,方法简单,且易长期保存。本法已用于猪丹毒菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌及产气荚膜杆菌的检验。


(三) 荧光标记A蛋白(FITC-SPA)检测法 SPA是大多数金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种主要成分,它能与多种正常哺乳动物的IgG的Fc片段结合,而不影响该抗体分子的免疫活性,仍能与抗原起反应,当用荧光色素将其标记后,可制成特异的诊断制剂。在常规的荧光抗体技术间接染色法中,必须使用第二抗体(即抗球蛋白抗体),但由于动物的种类不同,需要使用抗各种动物的第二抗体(如兔抗猪球蛋白抗体、兔抗马球蛋白抗体等)和抗各种动物球蛋白的荧光抗体,这样不仅操作复杂,同时也容易出现类属反应。而SPA能与多种哺乳动物的IgG的Fc片段结合,因此可用SPA来取代第二抗体,这样就不受第一抗体动物种属来源的限制,同时,SPA荧光试剂制备简单,易于纯化和高度稳定。用其检测病毒抗原时,将培养在飞片上的病毒感染细胞用PBS轻洗2次,然后用标记的SPA荧光试剂覆盖,置4℃10~30分钟,用PBS洗二次后,将玻片反置于载玻片上,于荧光显微镜下观察结果。

另外,在链球菌细胞壁上,亦发现有类似SPA免疫功能的蛋白成分存在,通常将A群链球菌产生的称为Ⅱ型FcR,C群链球菌细胞壁产生的称为Ⅲ型FcR,G群链球菌产生的称为Ⅳ型FcR,兽疫链球菌产生的称Ⅴ型FcR,以上各型FcR均能与人及动物IgG的Fc段结合,如将其引入到免疫检测系统中,也可充当第二抗体应用。

上述的免疫荧光技术系传统方法,由于主要凭借手工操作,效率低,且对结果的判定在一定程度上可受主观因素的影响,所以近些年来又建立了几项相应的新方法:①荧光激活细胞分类法(fluorescence activated cell sorter,FACS),见本章二十四项中的流式细胞术;②时间分辨荧光免疫分析法(timeresolved fluoroimmunoassay,TrFIA),是一项超微量物质免疫分析技术;主要特点是以镧系(稀土)元素铕(Eu3+)及其螯合物为示踪剂标记抗体或抗原,并利用时间分辨荧光光度计测量法排除检品中的非特异性荧光干扰;镧系标记物激发的光波长范围宽,辐射荧光的波长范围窄,有助于降低本底,荧光衰变时间长(100~1 000μs),可用于检测蛋白质、肿瘤标志及病毒抗原等。


文章分类: 试剂盒技术资料
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