Tnbc在体内全基因组crispr基因敲除筛选中的应用 为了开始破译TNBC中的癌症脆弱性和肿瘤抑制基因超敏反应，我们使用一个慢病毒基因敲除库(GeCKOv 2)进行了一个全基因组范围的crispr功能缺失筛选。该库包含65,383个单一引导RNAs(SgRNAs)，包括19,050个目标中的3个和1,000个非目标控制的sgRNAs。 20 。在高致瘤性TNBC细胞系SUM159PT(以下简称SUM 159)上进行了全基因组筛选。SUM 159细胞携带两种癌基因突变( PIK3CA 和 HRAS )和肿瘤抑制因子( TP 53 )21 ,22 。当 HRAS 在TNBC中通常不会发生变异， PIK3CA 和 TP 53 是乳腺癌中最常见的两个突变基因，特别是在tnbc患者中。 23 。事实上，如附图所示。 1A ，对METABRIC数据集的分析显示 TP 53 和 PIK3CA TNBC患者突变率分别为74.4%和16.6%。含有PIK3CA突变的大多数肿瘤患者也携带TP 53突变，占数据集中TNBC患者总数的12%。在SUM 159细胞中发现的PIK3CA突变位于H 1047残基上，导致PI3激酶的本构激活。 24 ,25 。H 1047突变也是2500多名乳腺癌患者中最常见的PI3K突变，如METABRIC数据集(补充图)所示。 1B )26 ,27 。PIK3CA突变的患者与未发生突变的PIK3CA患者相比生存效果较差，TP 53突变不能预测TNBC患者的生存(附图)。 1C和d 分别)。值得注意的是，携带这两种基因突变的TNBC患者的总体生存结果最差，中位生存期最低(补充图1)。 1E和F )。因此，SUM 159癌症模型代表了TNBC最具攻击性的基因特征。
如图所示。 1A 在SUM 159细胞中对GeCKOv 2 KO慢病毒文库进行了3种独立的生物学感染，每sgRNA最少覆盖400次，平均多重感染0.3次(估计每个细胞有一个整合因子)。经普罗霉素筛选后，将3000万细胞皮下移植到免疫缺陷NOSCIDγ(NSG)小鼠体内。另有3000万个细胞被快速冷冻，作为在随后的扩增序列中作为池库sgRNA的初始代表(称为Cell Rep1/2/3)。移植后30天，肿瘤发展达到人道终点(>1cm)。 3 )那时，他们被收集作为晚期肿瘤的代表(如图所示)。 1B )。肿瘤标本经下一代测序处理后，采用MAGeCK鲁棒秩聚合算法定量测定sgRNA的丰度和分布，并根据体内选择压力进行定量。 28 。比较各基因在体内选择压力(细胞Rep1/2/3与晚期肿瘤标本)前后的sgRNA阅读计数。如图所示。 1C ，所有体外(细胞Rep1/2/3)和体内肿瘤(Gecko1-6)标本的sgRNA文库平均表达率分别为99%和97%，表明这两种条件下的文库覆盖率都很高。值得注意的是，所有体外细胞标本均呈均匀、无偏的sgRNA分布，低基尼指数为0.1，而体内肿瘤标本由于选择压力而表现出较高的基尼指数(图一)。 1D )。Log 10中的移位进一步说明了这一点。 (重新点票) 所有细胞Rep和肿瘤标本之间的累积sgRNAs分布曲线(图1)。 1E )。这些结果表明，体内选择压力导致sgRNAs在肿瘤中的功能选择和分布改变，从而验证了我们在体内基因组范围内CRISPR/Cas9筛选的功能。此外，生物复制在移植前的体外对照样本中的平均相关系数为0.98，在肿瘤复制中的平均相关系数为0.66(图1)。 1F )，进一步反映了我们屏幕的高度重现性。重要的是，体内筛选产生阳性和阴性基因剖面(fdr<0.25)，每个基因各自富集或耗尽至少两个sgRNAs，而1000个非靶向sgRNAs中没有一个属于阳性或阴性选择(图1)。 1g 和h，补充表 1 ).
图1：TNBC体内全基因组CRISPR基因敲除筛选。 a 利用人慢病毒CRISPR/Cas9文库(GeCKOv 2)对三阴性乳腺癌(TNBC)SUM159PT(SUM 159)细胞的功能缺失全基因组筛选的原理图。 b 3,000,000,000,000,000,000,000,000,000 GeCKOv 2慢病毒文库感染SUM 159细胞的NSG小鼠皮下移植瘤体积的三个独立感染复制实验。 n =6，2只小鼠/生物复制)。数据用平均±扫描电镜表示。 c 移植前细胞库中sgRNAs的定位百分比 n =3)和肿瘤样本( n =6)第30天。 d GINI指数测定细胞和肿瘤复制样品中sgRNA读取深度的均匀度。 e 文库sgRNAs在3个转导细胞复制和6个肿瘤复制中的累积分布功能。肿瘤样本的变化表明，sgRNAs的一个子集中的读计数发生了改变。 f SgRNA在体外和体内所有样本之间的Pearson相关关系。红盒突出三个生物复制的体外细胞表现样本，显示高度的相关性。图右侧的黑线表示基于样本间距离的样本分层聚类的树状图(根据Pearson相关系数计算)。 g 转移细胞复制归一化的肿瘤标本中阳性和阴性基因的LOG 2(折叠变化)(假发现率(FDR)<0.25)。 h 具有0、1、2或3显著富集或缺失的sgRNAs(FDR<0.25)的基因数目(FDR<0.25)。 i 否定选择的基因与普通基本基因或非必需基因列表重叠的Venn图。源数据作为源数据文件提供。
阳性选择发现了46个丰富的基因，可能发挥抑瘤作用，因为它们各自的基因敲除促进了肿瘤在体内的生长。基因列表中包含了几种公认的肿瘤抑制因子( NF2 29 TSC 1 30 ，和 PTPN 12 31 )，验证筛选的特异性，只显示那些被体内选择压力改变和相关的基因。阴性选择显示有343个缺失的基因具有基本的生存或促进肿瘤的功能。作为概念的证明，这份清单包括了几个众所周知的癌基因，例如 MYC 32 HRAS 33 ，和 PTPN 11 34 (无花果) 1g )。为了进一步评估体内阴性选择的总体质量，我们采用了一种金标准方法，即343个阴性基因列表与共同的基本参考基因和非必需的参考基因重叠。重要的基因集是从depmap门户网站的阿基里斯数据集20q1中获得的大规模体外筛选得到的。 16 ,35 35 。大约50%的体内阴性屏幕点击被认为是“基本”表型(在343次点击中有185次)，只有一次被归类为“非必需”(图一)。 1I )。重要的是，当使用UCSC Xena和cBioPortal平台分析1200多名乳腺癌患者TCGA数据集中343个HITS的mRNA表达时 26 ,27 我们发现，与非TNBC肿瘤或正常组织相比，大量的这些基因(117)在TNBC中被过度表达(附图)。 2A )。对METABRIC和TCGA薄饼癌数据集的3,593名乳腺癌患者的进一步分析表明，与其他亚型相比，这些基因在基底型乳腺癌(主要是TNBC患者)中经常被扩增并显示出更高的基因改变频率(补充图)。 2B和C )。这些基因的改变也与TP 53突变频繁，肿瘤分级较高有关，并预测整体生存结果较差(附图)。 2D和f 分别)。这些结果突出了我们的筛选的严格性、质量和效率，并将候选的阴性点击定义为TNBC潜在的促肿瘤基因。总之，我们在体内的基因组范围的crispr筛选显示了足够的文库覆盖率，提供了来自阳性和阴性选择的高置信度基因命中数据集，并进一步确定了TNBC潜在的癌症脆弱性和抑癌基因超敏性。
MTOR通路激活促进TNBC肿瘤发生 为了确定TNBC中促进肿瘤生长的致癌信号通路，我们利用EnrichR对阴性选择基因集进行了路径富集分析。 36 ,37 。如图所示。 2A 阴性的HITS主要表现为RNA加工和细胞周期等重要的生存功能。除了基因的重要性外，PI3K/AKT/mTOR(PAM)信号通路的9个成员( 里克特 , SEH1 L , HRAS , WDR 59 , ATP 6V1H , 瑞布 , TTI 1 , 米奥斯 ，和 Grb 2 )，提示这一途径在促进TNBC肿瘤生长中起着重要作用。除了三个基因， Grb 2 , TTI 1 ，和 SEH1 L ，所有其他基因都没有出现在共同的基本清单中，这表明它们可能具有癌症类型特异性的功能(图一)。 2B )。然而，除了特征良好的上游mtor激活剂(Pi3k)外， 25 、Grb 2 38 ，和HRAS 39 2C )使用PathwayMapper 40 。HITS包括PI3K上游激活剂(Grb 2)、两个mTORc 1/2核心组分(RICTOR和TTI 1)、mTORC 1直接激活剂(土卫一)和HRAS，后者通过抑制TSC2-TSC1复合物来刺激mTORC 1。 41 。除了对有丝分裂原和生长因子的反应外，mTORC 1还通过gator复合物检测特定的氨基酸水平。 42 。在氨基酸存在的情况下，GATOR 2抑制GATOR 1，GAP蛋白通过作用于Rag GTPase而降低mTORC 1的激活。有趣的是，GATOR 2复合体(WDR 59、MIOS、SE-H1L)的三个成员出现在我们的负面点击中，强调了GATOR 2在促进TNBC肿瘤生长中的重要性。
图2：mTOR通路的激活促进了TNBC的肿瘤发生。 a 顶级路径( p < 0.05) from KEGG pathway enrichment analysis of the negative selection gene list (343 genes) in tumors. In addition to essential survival pathways, the mTOR signaling pathway significantly ranked with nine identified targets (labeled in the box). b 9个mTOR成员的Venn图与共同的基本基因列表或非必需基因列表重叠。 c 从体内筛选的9个mTOR信号通路成员的定位。通过体内筛选，用LOG 2(FC)(蓝色)和FDR(粉红色)标记所鉴定的靶基因。 d 应用METABRIC和TCGA薄饼癌数据集对3,593例乳腺癌患者9种联合mTOR的基因组改变频率的百分比。条形图中的颜色表示特定的突变和拷贝数的改变(CNA)。 e 所有级别(1级、2级和3级)9个mTOR的改变组和未改变组的百分比。 p 数值是从X-平方检验得来的。 f 乳腺癌患者9种mTOR中改变组和未改变组的Kaplan Meier生存分析。 p 数值是从logrank测验得来的。源数据作为源数据文件提供。
为了进一步研究已鉴定的PAM的临床相关性，我们使用METABRIC和TCGA薄饼癌数据集，检测了3,593例乳腺癌患者的基因改变和表达水平。 26 ,27 。我们发现，大多数基因的改变是由于拷贝数的扩增，而在较低的程度上，是由突变/缺失引起的(如图所示)。 二维空间 )。然后，我们根据ER/PR/HER 2状态将这些患者分组，如附图所示。 3A 9个PAM成员在TNBC和非TNBC亚型中均有拷贝数扩增。此外，基底样亚型(代表大部分TNBC)的基因改变也增加，但在HER 2、腔B亚型中也有改变(补充图1)。 3B )。我们还比较了不同肿瘤期的基因改变。如附图所示。 3C和D ，基因改变更多发生在淋巴结阳性和II期肿瘤，即大的肿瘤，扩散到周围组织。我们的结果还表明，这些改变更有可能发生在高级别的乳腺肿瘤表型，并预测不良的整体生存结果(图一)。 2 E， f )。总的来说，这些基因的改变和相关性与不良的预后特征不仅限于TNBC，而且也适用于非TNBC患者。然后，我们进一步比较了TNBC和非TNBC的mRNA表达。有趣的是，TNBC患者更多地表达了GATOR 2复合物的两个成员， WDR 59 和 SEH1 L ，以及一种直接的mTOR激活剂。 瑞布 与非TNBC患者比较(附图)。 3E )。这些结果共同强调PAM信号通路的多个组成部分是有效的肿瘤生长调节剂。重要的是，它们还为TNBC中以前未描述的PAM信号电路(即mTORC2和GATOR 2)定义了一个角色。
MTORC 2和GATOR 2在TNBC肿瘤生长中的作用 如上所述，mTORC2或GATOR 2复合物在原发性乳腺肿瘤发展中的直接作用尚未在TNBC中表现出来。因此，为了评估它们的功能相关性和对TNBC肿瘤形成的贡献，我们采用CRISPR/Cas9KO方法专门阻断SUM 159细胞株mTORC2和GATOR 2复合物(分别为RICTOR和WDR 59)中一个已鉴定的代表HIT的表达。在大体积KO细胞中存在适当的Indel突变，用基因组切割试验进行了验证(图1)。 3A )。WDR 59 KO阻断GATOR 2信号转导的能力是通过降低mTORC 1下游两个靶点rpS 6和p70S6K1的磷酸化水平来验证的。 3B )。RICTOR KO调节mTORC2活性的功能验证是通过降低其底物AKT在Ser473上的磷酸化来证实的(如图4所示)。 3C ).
图3：mTORC2和GATOR 2在TNBC肿瘤生长中的作用特征。 a 在SUM 159上用基因组切割试验研究了针对WDR 59和RICTOR的慢病毒CRISPR/Cas9sgRNA的基因组修饰。 n =2个具有相似结果的独立实验)。 b , c 用免疫印迹法检测WDR 59和RICTOR基因敲除对SUM 159细胞mTOR信号通路的影响。以非靶向(NT)sgRNA为对照( n =2个具有相似结果的独立实验)。 d NT、WDR 59和RICTOR KO SUM 159细胞原位乳腺脂肪垫移植于NSG小鼠体内( n =每组5人)。每隔两天测量一次肿瘤体积，评估乳腺肿瘤生长情况。数据用平均±扫描电镜表示。 p 值是将每个ko组与nt控件(Ntctrl)进行双边未配对比较。 t 在同一天进行测试。* P < 0.05, **P < 0.01 or ***P < 0.001. e 第43天采集乳腺肿瘤的典型图像(NT ctrl，WDR 59 KO，RICTOR KO)。 f 第43天肿瘤标本(NT Ctrl、WDR 59 KO和RICTOR KO)的蛋白裂解物通过免疫印迹法检测mTOR信号通路。 n =4例肿瘤标本/组)。 g 16只动物不同KO肿瘤标本pS 240/244 rpS6/rpS6和pS473AKT/AKT比值的定量分析 n =4例肿瘤标本/组)。数据表示为平均值±扫描电镜和 p 值由双边未配对 t 测试表明。 h , i 在SUM 159中，用特异性慢SAM CRISPR sgRNAs诱导WDR 59和RICTOR的mRNA表达。数据表示为平均值±扫描电镜和 p 值由双边未配对 t 测试表明( n =每组3个细胞)。 j 将CRISPR激活的NT ctrl、WDR 59和RICTOR转导的SUM 159移植到NSG小鼠体内( n =每组6只)。乳腺肿瘤体积平均为±SEM。 p 值是将每个激活组与nt ctrl之间的双边未配对值进行比较。 t 在同一天进行测试。* P < 0.05, **P < 0.01, or ***P < 0.001. k 在SUM 159中用两种特异的小扁豆RNA诱导sestrin 3 mRNA的表达。数据表示为平均值±扫描电镜和 p 值由双边未配对 t 测试表明( n =3个细胞 p ER组)。 l 用免疫印迹法检测CRISPR活化ctrl和sestrin 3转导SUM 159的蛋白水平。 n =2个具有相似结果的独立实验)。 m 将Ctrl和sestrin 3激活转导的SUM 159移植于NSG小鼠( n =每组3只)。通过测量肿瘤体积来评估原发性乳腺肿瘤的生长情况。数据表示为平均值±扫描电镜和 p 值由双边未配对 t 测试表明。* P < 0.05. Source data are provided as a Source Data file.
为了评价RICTOR和WDR 59在乳腺癌形成中的作用和作用，将单个KOS移植到NSG小鼠乳腺脂肪垫中，每隔两天测量一次肿瘤体积。值得注意的是，单个RICTOR和WDR 59基因缺失明显地阻断了NSG小鼠的原发性乳腺肿瘤生长，缩小了肿瘤的大小，这两种蛋白是潜在的原癌因子(图一)。3 d和 e )。此外，如图所示。 3F 对切除肿瘤组织的免疫印迹分析表明，在不存在RICTOR的情况下，肿瘤组织的比例(p-AKT Ser473相对于总AKT)持续下降。然而，这一下降并没有统计学上的显着性(图)。 第三代 )，可能是由于动物之间的异质性和切除肿瘤标本的数量和/或AKT磷酸化是一个非常短暂的事件，很可能在肿瘤切除时无法维持。与预期相反，WDR 59 KO对p-AKT Ser473没有影响，因为这种磷酸化事件是由mTORC2复合物特异性调控的。有趣的是，与非靶向性肿瘤标本相比，WDR 59和RICTOR KOs显示rpS 6磷酸化水平显著下降(图1)。 3 f、 g ).
为了进一步探讨RICTOR和WDR 59在乳腺中的促肿瘤作用，我们采用了CRISPR激活(CRISPRa)方法(详见方法)。 43 ,44 。利用特异性靶向RICTOR和WDR 59基因启动子的CRISPRa sgRNAs，可以显著提高SUM 159细胞内源性RICTOR和WDR 59基因的表达。 3 h， i )。重要的是，RICTOR和WDR 59基因表达的激活导致乳腺肿瘤生长显著增加(图一)。 3J )。总之，这些结果清楚地定义了RICTOR在乳腺中的直接促肿瘤作用.此外，我们还确定了WDR 59作为乳腺肿瘤生长的一种强有力的诱导剂的功能，将营养素敏感的GATOR 2复合物定义为TNBC中的一种原癌途径。
GATOR 2复合物由一个名为Sestrins的应激相关蛋白家族负调控。尤其是Sestrin 3与GATOR 2的活性相互作用，与细胞内亮氨酸水平无关。 45 。为了进一步了解GATOR 2在肿瘤发生中的作用，以及Sestrin 3能否作为GATOR 2的上游调控因子调控TNBC的乳腺肿瘤生长，我们利用CRISPRa系统特异性地诱导内源性Sestrin 3的表达。利用两种针对Sestrin 3启动子不同结构域的特异性sgRNAs，可以显著诱导内源性Sestrin 3基因表达。 SESN 3 )SUM 159 TNBC细胞的64倍和170倍。 3K )。随后Sestrin 3蛋白水平增加，mTOR信号进一步受到抑制，p70S6K磷酸化水平降低就说明了这一点(见图)。 3L )。通过在NSG小鼠体内原位移植SUM159-SESN3细胞，观察Sestrin 3表达增加对肿瘤生长的影响。如图所示。 三米 ，随着时间的推移，Sestrin 3表达水平的增加导致乳腺肿瘤负担的显著减轻。这些结果清楚地定义了GATOR 2复合物在TNBC中作为肿瘤启动子的功能，并强调负调控子Sestrin 3是一种潜在的肿瘤抑制因子。总之，这些结果强调了致癌mTOR通路在TNBC肿瘤发展中所起的关键作用。我们的研究还揭示了多个PAM信号元件作为肿瘤发生过程的重要调节因子，进一步明确了mTORC2/RICTOR和GATOR 2/WDR 59在TNBC乳腺肿瘤生长中的作用，提示Sestrin 3介导的GATOR 2负调控可能阻止这些作用。
阻断河马通路促进TNBC肿瘤发生 肿瘤的发生是一个复杂的过程，它可以由致癌途径的激活和肿瘤抑制活性的丧失引起。从全基因组的CRISPR筛选中筛选出积极选择的基因，为揭示这种功能抑制途径提供了一个独特的机会。为了从我们的筛选阳性选择基因集(46次点击)中找出优势路径，我们使用EnrichR进行了基因通路富集分析。如图所示。 4A 肿瘤抑制因子Hippo信号通路成为首选。此外，我们还发现mTOR信号通路的负调节因子也有很高的排名。个别河马路径撞击(FRMD 6 , NF2 , SAV 1 , TAOK 1 , MAP4K4 , PTPN 14 )及其下游调控器与其相关的FDR和折叠变化值集成使用PathwayMapper(如图所示)。 4B )。河马通路由四个核心成分MST 1/2和LATS 1/2组成，被高细胞密度、细胞外基质刚度和缺乏营养物质激活。 46 。SAV 1(编码萨尔瓦多)是一种MST 1/2共调节蛋白。NF2(编码merlin)和frmd 6(编码蕨类植物结构域蛋白6)是核心级联的上游调控因子，通过磷酸化mst 1/2和LATS 1/2激活河马通路。河马途径的抑瘤作用是通过磷酸化yap(Ser 127)、核输出和随后泛素降解Yap蛋白，从而抑制yap/taz调控复合物，进一步阻止tead介导的基因转录而介导的。 46 。为了研究河马相关的肿瘤抑制作用，我们在SUM 159细胞中使用了上述CRISPR/Cas9KO和CRISPRa系统。选择了两个HIT(SAV 1和FRMD 6)作为原则的证明，因为在肿瘤发生的背景下，这两种方法都没有功能上的特征。如图所示。 4C ，产生特异性CRISPR-SAV 1和-FRMD6KOs。这两个KO导致其各自目标萨尔瓦多和FRMD 6的蛋白质水平急剧下降。SAV 1和FRMD6KOs中YAPSer127/总YAP的磷酸化比例较对照细胞降低，提示萨尔瓦多和FRMD 6可抑制TNBC中的YAP癌基因。重要的是，在TNBC原位移植的临床前模型中，两个单独的SAV 1和FRMD6CRISPR-KO能够显著促进原发性乳腺肿瘤的生长(图一)。4D )。相反，使用CRISPRa系统激活SAV 1和FRMD 6基因的表达会显著抑制乳腺肿瘤的生长，并显著缩小肿瘤的大小(图一)。 4E -g)。重要的是，对切除肿瘤的免疫印迹分析表明，CRISPRa系统激活SAV 1和FRMD 6后，P-MST 1/2和p-LATS 1(图1)所测得的河马核级联激活。 4 h， i )。此外，通过过表达萨尔瓦多和FRMD 6而激活Hippo通路，导致YAP癌蛋白抑制位点Ser127的YAP磷酸化增加(如图所示)。 4J )。总之，这些结果不仅验证了我们的筛选结果，而且通过抑制YAP癌基因，揭示了萨尔瓦多和FRMD 6在TNBC中的抑癌功能。
图4：阻断河马通路促进TNBC的肿瘤发生。 a 顶级路径( p < 0.05) from KEGG pathway enrichment analysis of the positive selection list (46 genes) in tumors. b 我们的基因列表中与河马相关的单个点击率使用PathwayMapper绘制，节点被折叠变化(Log2fc)和FDR值覆盖。c 用免疫印迹法检测SAV 1和FRMD 6基因敲除对SUM 159细胞SAV 1和FRMD 6表达、YAP磷酸化和总蛋白水平的影响。 n =2个具有相似结果的独立实验)。 d NT、SAV 1和FRMD6KOSUM 159细胞原位乳腺脂肪垫移植于NSG小鼠体内( n =每组6只)。每隔两天测量一次肿瘤体积，评估乳腺肿瘤生长情况。数据用平均±扫描电镜表示。 p 值是双面不成对的。 t 测试，* P < 0.001. e 在SUM 159细胞中，利用三种不同的sgRNAs慢病毒CRISPR/dcs 9 SAM结构激活内源性SAV 1和FRMD 6基因启动子。RT-PCR检测SAV 1和FRMD 6 mRNA在SUM 159细胞中的表达。 n =2个来自3个sgRNAs/基因的细胞)。 f 将CRISPR激活的Ctrl、SAV 1和FRMD 6转染SUM 159细胞于NSG小鼠体内。 n =每组5只)。通过测量肿瘤体积来评估原发性乳腺肿瘤的生长情况。数据用平均±扫描电镜表示。 p 值是双面不成对的。 t 测试* P < 0.05, **P < 0.01 or ***P < 0.001. g 第30天采集乳腺肿瘤的典型图像。 h 第30天肿瘤标本(LentiCRISPRa NT、SAV 1和FRMD 6)的蛋白裂解物通过免疫印迹法检测Hippo/YAP信号通路。对p-mst 1/2/mst 1的比值进行了量化，并与SAV 1和FRMD 6激活样本进行了比较。 n =3例肿瘤标本/组)。数据表示为平均值±扫描电镜和 p 值由双边未配对 t 测试表明。 i P-LATS 1和α-微管蛋白在NT、SAV 1和FRMD 6活化肿瘤标本中的免疫印迹 n =3例肿瘤标本。 j 用免疫印迹法和p-yap/yap比值定量法对对照样品进行比较。 n =5)与SAV 1( n =4)和FRMD 6( n 5)活化样品。数据表示为平均值±扫描电镜和 p 值由双边未配对 t 测试表明。源数据作为源数据文件提供。
药理mTOR和YAP抑制剂协同抑制肿瘤生长 在明确了mTOR和Hippo/YAP通路对TNBC肿瘤发展至关重要之后，我们接下来探讨了我们发现的治疗价值。由于mTORC 1对mTORC 2/AKT的负反馈效应，mTORC 1抑制剂在不同类型的临床试验中未能阻止肿瘤的进展。 47 ,48 。为了克服这一限制，第二代抑制剂被开发出来同时阻断mTORC 1和mTORc 2，目前正在各种癌症患者中进行临床试验。 49 。为了阻断致癌的mTORC 1/2通路，我们使用了ATP竞争性选择性mTOR抑制剂torin 1。 50 。为了激活抑制肿瘤的河马通路，我们使用了一种阻遏yap/tead结合和转录活性的yap抑制剂--verporfine。 51 。维泊芬是美国食品及药物管理局批准的药物，用于治疗黄斑变性，并在最近被建议发挥抗肿瘤作用的视网膜母细胞瘤和肺癌。 52 ,53 。BET溴结构域抑制剂(Bbdi)jq 1和维泊芬的协同作用研究也表明，该组合对bbdi耐药衍生物细胞系的体外细胞培养有一定的抑制作用。 54
这两种特异性抑制剂首次单独或联合使用上述异种移植乳腺癌模型进行了试验。Nsg小鼠原位TNBC细胞移植后，肿瘤可生长至200 mm。 3 。选择肿瘤体积相似的小鼠，分为4组(6只小鼠/组)进行后续药物治疗：载体组(100 mg/kg)、托林1组(20 mg/kg)和联合治疗组(维甲酸/托灵1组)。药物通过每日腹腔注射给药2周(联合治疗组以5-h间隔给药，以防止两种制剂之间的任何潜在相互作用)，并通过卡尺测量测量肿瘤体积。55 ,56 。如图所示。 5A ，Torin 1在预防原发肿瘤的发展方面表现出很好的效果。与Torin 1相比，单用维甲酸对肿瘤生长的作用较弱，起效较晚，但在疗程结束时，对肿瘤生长有明显的抑制作用。有趣的是，与单次给药相比，联合治疗Torin 1/Verporfine对肿瘤体积减少的作用加快且明显改善。这些结果突出了这两种途径在促进TNBC肿瘤发展中的合作性质，以及双重抑制对获得更大的抑癌作用和潜在的患者治疗效益的重要性。
图5：药理mTOR和YAP抑制剂协同阻断肿瘤生长。 a 将SUM 159乳腺癌细胞移植到NSG小鼠乳腺脂肪垫中，肿瘤可持续27天至200 mm左右。 3 肿瘤体积。小鼠分为四组，每组10只，每组10只。 n =6只小鼠)，脊椎动物鳍(100毫克/千克)( n =6只小鼠)，Torin 1(20 mg/kg)( n =7只小鼠)和联合治疗(脊椎动物鳍/Torin 1，组合体)( n (7只小鼠)每日腹腔注射。通过测量肿瘤体积来评估原发性乳腺肿瘤的生长情况。数据用平均±扫描电镜表示。 p 值是双面不成对的。 t 测试* P < 0.05, or ***P < 0.001. b , c 4种TNBC细胞株(SUM 159、MDA-MB 231、SUM 1315、SUM 149)在一定剂量下，用托林1或维甲酸处理3天后，经预染色观察细胞存活率。数据表示为平均值±扫描电镜( n =对每个细胞系进行3次独立实验)。 d , e 4株TNBC细胞在一定剂量下用维甲酸和托林1的联合药物基质作用3d。用PrestoBlue染色法测定细胞活力。用HSA、ZIP和Bliss模型对4个TNBC细胞株的协同效应评分和三维表面图进行了量化和分析，并利用SynergyFinder( n =对每个细胞系进行3次独立实验)。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们使用其他TNBC模型评估并进一步描述了所提议的药物联合治疗效果。为此，我们采用了一种药物组合方法。 57 因此，我们设计了一个药物基质结合不同剂量的每种抑制剂，并量化了由此产生的细胞活力参数。本研究采用来自不同患者的4株TNBC细胞系(SUM159PT、MDA-MB 231、SUM1315MO2和SUM149PT)作为研究对象。 58 5 b， c )。接下来我们用药物基质设计来测量和量化药物疗效和联合治疗(补充图)。 4A )。在数据分析方面，我们使用了几个建立良好的药理学模型(hsa、bliss和zip)和SynergyFinder算法。 57 。如图所示。 5 d和 e 在所有TNBC细胞株中，观察到的组合药物作用均强于个体效应。有趣的是，这三种模型(HSA、Bliss和ZIP)在所有TNBC中都显示出两种药物之间的正协同得分。此外，使用两种最严格的模型(Bliss和ZIP)进行的进一步详细数据分析表明，在每种药物的最低剂量结合的地区，协同作用得分最高，突出表明了使用这种联合治疗的潜在额外临床益处(降低毒性)(图一)。5E 和补充图。 4B )。总之，我们的结果表明，mTORC 1/2(Torin 1)和YAP(脊椎动物芬)在体外和体内均能有效地阻断TNBC肿瘤的生长，显示了两种药物之间的协同作用，并突出了这种靶向联合治疗对TNBC患者的潜在和益处。
Torin 1增强维甲酸诱导的TNBC细胞凋亡 接下来，我们研究了Torin 1和椎体鳍在TNBC中传递抑瘤作用的细胞内和分子机制。为此，我们首先评估了药物对癌细胞死亡和存活的影响。如图所示。 6A ，Torin 1和椎体鳍均能显著减少癌细胞的数量。有趣的是，两种药物的联合治疗几乎完全抑制了细胞活力，证实了两种药物之间的协同作用，并突出了联合治疗方式的有效性。为了获得进一步的机械洞察力，我们接下来研究了药物对细胞死亡的影响。为了解决这一问题，我们通过检测Annexin V+/PI+群体在单药和联合治疗中的凋亡情况来评估细胞凋亡。如图所示。 6 b， 6C ，以及附图。 5 治疗3d后，维泊芬对细胞凋亡有明显的促凋亡作用，而Torin 1对不同剂量的细胞凋亡无明显影响。有趣的是，联合使用更多的Torin 1，进一步增强了维甲酸的凋亡效应。
图6：Torin 1增强了维泊芬诱导的TNBC细胞凋亡。 a 单独或联合对Torin 1和Verporin(Verte)对SUM 159细胞活力的药物反应。数据表示为平均值±扫描电镜和 p 值由双边未配对 t 测试表明( n =每次治疗3个独立实验)。 b , c SUM 159中凋亡细胞百分比(Annexin V+/PI+)在不同剂量的药物或联合用药中均有不同程度的变化。数据表示为平均值±扫描电镜和p 值由双边未配对 t 测试表明( n =每次治疗3个独立实验)。 d 50 NM Torin 1处理SUM 159细胞24h后，LY(绿色)和LAMP 1(红色)的光场和荧光 n =3个具有相似结果的独立实验)。标尺为20m。 e Ttorin 1(50 NM)和维甲酸(0.6M)作用24 h后SUM 159细胞LY的流式细胞术分析。 n =4次生物复制)。 p 值由双边未配对 t 测试表明。SUM 159细胞内维甲酸荧光 f )和HuMEC( g )单独使用或联合托林治疗。数据表示为平均值±扫描电镜和 p 值由双面成对 t 测试表明( n =每次处理3次生物复制)。源数据作为源数据文件提供。
在明亮视野(BF)显微镜下对Torin 1处理的TNBC细胞进行观察，发现细胞内有一个过程，表现为巨噬细胞增生症(图1)。 6d )。巨噬细胞增生症的特点是大量的细胞外液被吞噬，导致形成膜结合的大的胞内空泡，被称为巨球小体。 59 。巨细胞增生症主要发生在癌细胞中，在饥饿的条件下促进了细胞的营养供应。 19 ,60 。然而，这些大液泡的持续积累也被报道导致细胞膜破裂和随后的非凋亡灾难性细胞死亡。 19 。最近的一项研究表明，在5-25M范围内，高剂量mTORC 1/2抑制剂可引起多种癌细胞的巨噬细胞增多和细胞死亡。 61 。巨细胞增生症可通过快速掺入液相示踪剂如路西法黄(路西法黄)、晚期溶酶体标记LAMP 1的出现以及大松脂小体与溶酶体融合的成熟来评估。 61 。如图所示。 6d 在终浓度为50 nm时，Torin 1可诱导大液泡形成，然后与晚期溶酶体标记LAMP 1共定位的细胞内LY积累，提示Torin 1可诱导TNBC的巨噬细胞增多。用流式细胞仪定量分析LY的摄取，结果表明Torin 1与DMSO和维斯珀芬处理的细胞相比，LY荧光含量高的细胞百分比显著增加(图一)。 6E 和补充图。 6 )。总之，我们的结果表明，在TNBC中，维甲酸和Torin 1可以通过不同的机制诱导细胞死亡。
这两种药物在体外和体内都能协同抑制肿瘤的生长，而且联合治疗会导致细胞死亡的增加，我们接下来将探讨这种协同作用的分子机制。由于表明Torin 1可以诱导细胞外液体的摄取，我们推测Torin 1可能促进脊椎动物鳍与细胞外液一起进入细胞，当这两种药物同时使用时。细胞内维斯帕芬浓度的增加将导致凋亡细胞死亡的增加，并解释了这两种药物之间的协同作用。为了解决这一问题，我们接下来评估了在是否存在Torin 1的情况下，脊椎动物鳍的细胞内水平。方便地，通过测量远距离辐射光谱中的脊椎动物鳍固有的自荧光，可以定量测定细胞内的脊椎动物鳍的含量。 62 。如图所示。 6f ，如预期的那样，细胞内的脊椎动物荧光信号呈剂量依赖性增加。有趣的是，与托林1联合治疗后，与相同剂量的单用维甲酸相比，脊椎动物鳍细胞内水平明显而显着地增加(图一)。 6f )。这些结果强烈地表明，Torin 1通过巨噬细胞增生症，促进了细胞对脊椎动物鳍的摄取，进一步导致了由维甲酸介导的凋亡细胞死亡。
此外，对正常人乳腺上皮细胞(HuMEC)中Torin 1/Verporfin联合治疗的附加分析表明，Torin 1的作用是肿瘤细胞特有的。事实上，用Torin 1治疗HuMEC并不能诱导巨噬细胞增多、LY摄取和LY/LAMP 1共定位(补充图1)。 7a，b )，也不增加两种药物同时给药时的细胞内吸收(如图所示)。 6g )。这表明，与正常细胞相比，联合治疗在癌细胞中具有更强的选择性和有效性，进一步凸显了其作为药物联合适应症的治疗价值。
Torin 1/维甲酸联合治疗对异种移植瘤生长的影响 为了进一步强调药物联合治疗对TNBC患者的临床意义，我们接下来在TNBC患者衍生异种移植(PDX)模型中检测药物效应(单独或联合)。PDX更能代表人类癌症生物学和预测患者的治疗反应，因此更适合测试任何联合治疗。本研究采用TM 00096 PDX模型，是从一例转移性导管癌(52岁白人/西班牙裔女性)中建立的。PDX肿瘤在初发肿瘤植入后仍维持在低传代状态。为扩大肿瘤的范围，将肿瘤摘除、切碎并皮下移植到接受移植的NSG小鼠体内。PDX肿瘤直径达200 mm 3 将小鼠按相似的中位肿瘤大小分为4组(每组6只)。然后动物单独或不使用抑制剂治疗，或通过每日注射联合用药。按规定剂量注射。令人兴奋的是，当单用维甲酸和托林1时，肿瘤生长速度和最终肿瘤体积都有明显的下降，但联合治疗在整个治疗过程中几乎是最大的、持续的抑制肿瘤生长的(图一)。 7 一个, b )。我们还监测了潜在的药物毒性，没有观察到在治疗过程中不同组的体重、食物摄入量和脱发量的任何变化，进一步支持了综合疗法的好处(图一)。 7C ).
图7：TORIN 1/VISTOPOFIN联合治疗阻断了患者来源的异种移植瘤的生长。 a 将TNBCPDX肿瘤皮下移植到NSG小鼠体内，培养28d。将小鼠分为4组(每组6只)，每组6只，分别腹腔注射维甲酸(100 mg/kg)、环磷酰胺(8mg/kg)和联合治疗(维甲酸/环磷酰胺)，连续2周。从单个小鼠的初步测量结果可以看出肿瘤的生长速度。数据表示为平均值±扫描电镜和p 值由双边未配对 t 测试表明( n =每组6只)。 b 第37天记录各组小鼠肿瘤体积。数据表示为圆点图，中间线为中间线。p 值由双边未配对 t 测试表明( n =每组6只)。 c 在治疗过程中测量小鼠体重。小鼠体重在治疗过程中的变化表现为平均±扫描电镜。 n =每组6只)。各组间无显着性差异。 d –f 具有代表性的图像显示，从第37天PDX肿瘤标本中提取的蛋白质裂解物，经载体、脊椎动物、Torin 1和联合治疗后，用所指示的抗体进行免疫印迹。用密度分析法定量测定荧光/总指示蛋白的比值。数据表示为平均值±扫描电镜和 p 值由双边未配对 t 测试表明( n =每组6例肿瘤标本)。 g 载体和药物治疗组PDX肿瘤组织PCNA阳性细胞的代表图像和定量。数据以中线为中间值的点状图表示。 p 值由双边未配对 t 测试表明( n =5只小鼠/组，每组织切片3个区域)。标度条为20m，源数据作为源数据文件提供。
为进一步研究PDX模型中肿瘤内的药物作用效果，对切除肿瘤进行免疫印迹分析，以评估mTOR/YAP信号通路的活性。如图所示。 7D 、Torin 1单独或联合可显著降低肿瘤组织中rpS 6的磷酸化相对于rpS 6的磷酸化率，降低mTOR的下游活性。同样地，torin 1也抑制AKT的激活，降低AKT在Ser473的磷酸化比率，相对于AKT总量而言，这与mTORC2复合物的抑制是一致的。 7E )。在评估肿瘤标本中的脊椎动物鳍效应时，我们发现单用或联合使用维甲酸可显著降低YAP蛋白的表达(图一)。 7F )。最后，切除肿瘤的免疫组织学显示，按增殖标记PCNA的表达水平，每天单独或联合注射Torin 1或联合应用可显著降低肿瘤细胞的增殖(如图1所示)。 7g ).
总之，我们的研究强调了体内全基因组crispr屏幕的相关性和威力，这些屏幕可以询问癌症的脆弱性、抑癌剂的过敏反应和发现抗癌治疗方法。我们的结果还发现了一种有效的方法，以规避肿瘤发生和减少肿瘤负担，通过同时靶向原癌和抑癌途径。最后，我们的发现将有助于填补转移性乳腺癌市场上急需的医疗空白，开发一种潜在的一线靶向疗法来治疗tnbc，并有望迅速向临床试验过渡。
