INPP4B的表达在PIK3CA-突变型ER+乳腺癌
近年来，INPP4b被确认为乳腺癌ER阳性的真正标志。24。Inpp4b在三重阴性乳腺癌中的表达缺失，但其作为潜在癌基因在其他癌症中的出现促使我们研究其在ER中的相对表达和功能。+乳癌。免疫组织化学方法检测INPP4B(3D5)单克隆抗体的表达。6两个独立的组织队列；一个组织芯片包含224例原发性乳腺癌和32例癌旁正常乳腺组织(US Biomax)(补充图)。1A)，以及作为墨尔本协作队列研究(MCCS)的一部分收集的107例原发性乳腺癌的第二组6。INPP4B蛋白表达的缺失与三重阴性乳腺癌有关(图一)。1一个,b)，正如我们以前报告的那样6。然而，与ER/PR阳性和腔内(ER)相关的正常组织相比，14-40%的乳腺癌组织中INPP4b蛋白表达增加。+和/或公共关系+)乳腺癌亚型。1一个,b和补充图。1B， c)。由于没有这些队列的mRNA表达数据，INPP4B应用组织扫描乳腺癌cDNA芯片I-IV(Origene)检测130例原发性乳腺癌和16例正常乳腺组织中mRNA的表达。1C)。减少INPP4B表达与三重阴性乳腺癌相关，并显著增加。INPP4B25%与ER/PR阳性及腔内亚型相关的乳腺癌组织中均有表达。1C，d和补充图。1D， e).
图1：INPP4b在PIK3CA-突变型ER+乳癌。a, b来自组织芯片的原发性人类乳腺癌组织和正常相邻乳腺组织(US Biomax，n=224宗)(a)或墨尔本协作队列研究(MCCS)，n=107个案件)(b)用INPP4B特异性单克隆抗体进行免疫染色。INPP4B蛋白表达为0(无表达)、1(低)、2(中度)和3(高)，与乳腺癌亚型相关。c, d相对INPP4B组织扫描乳腺癌cDNA阵列I-IV(Origene)定量RT-PCR技术检测正常乳腺组织和原发性乳腺癌组织中mRNA的表达。INPP4B引物(n=130宗)。INPP4BMRNA表达β-肌动蛋白表达水平和量化相对于正常相邻乳腺样本的平均值。c数据表示中值INPP4BMRNA表达±25%和75%。d蚀变INPP4BMRNA表达与乳腺癌亚型相关。e, fINPP4BMRNA表达PIK3CA, PTEN，或AKT 1突变状态(e)，或PIK3CA突变状态与ER阳性(f)来自METABRIC队列的乳腺肿瘤(n=1904个案件)。中心线表示中值，盒的下界表示第25百分位数，框的上界表示75百分位数，下晶须从第25百分位数延伸到最小值，上晶须从第75百分位数延伸到最大值。p由Fisher精确测试确定的值显示在a, b, d，由Kruskal-Wallis检验和Dunn‘s后特别试验c, f，并通过两尾未配对的Mann-Whitney检验e.
PI3K通路基因的突变PIK3CA, PTEN，和AKT 1通常与ER相关+乳癌12。使用METABRIC和TCGA数据集8,25，我们发现只有1%的乳腺癌INPP4B基因改变，如突变、截断、扩增或缺失。INPP4BMRNA表达与PTEN或AKT 1突变，但与PIK3CA-突变状态(图1.1E和补充图。1F). INPP4B多发性乳腺癌组织中的表达也显著增高。PIK3CA突变(附图)1g)。进一步分层显示INPP4B表达式与PIK3CA-突变型ER+乳腺癌子集(图1.1F).
INPP4B增强PIK3CA-突变型ER+乳腺癌与乳腺上皮细胞增殖
中INPP4B表达增加的功能后果PIK3CA-突变型ER+乳腺癌组织中gfp-inpp4b在MCF-7和T47D ER中的表达+乳腺癌细胞(附图)2A)，哪个地方有超激活PIK3CAE545K和PIK3CAH1047R分别突变。癌细胞有能力经历不依赖支抗的细胞生长，这是细胞转化的一个标志。GFP-INPP4B能显著增加MCF-7(2.1倍)和T47D(1.8倍)细胞在软琼脂中的集落大小，但对集落数无明显影响。2A-c)。Myc-INPP4B的表达威汤哥，但不是PI(3，4)P24-磷酸酶-死亡Myc-INPP4BC842A突变体19(补充图。2B在软琼脂中MCF-7细胞集落大小增加2.1倍，但不影响菌落数(附图)。2C–e)，与细胞增殖增强相一致。GFP-INPP4B与载体对照组相比，血清剥夺后MCF-7细胞增殖增强(1.7倍)。2D，e)，但不影响MCF-7细胞在含血清培养基中的增殖(附图)。2F)。EGF刺激的AKTS 473和AKTT 308过表达GFP-INPP4B的MCF-7细胞磷酸化水平略有降低(图1)。2F-h)，表明INPP4B虽然降低了AKT的活性，但仍能促进细胞增殖。此外，GFP-INPP4B的表达对PTEN蛋白水平没有影响(附图)。2G，h)或EGF介导的SGK 3T 320磷酸化(补充图)2I, j)，提示我们所观察到的INPP4B表型不是通过PTEN和/或SGK 3信号通路的改变而介导的。这些结果不同于Gasser等人所描述的结果。谁使用iGF-1，而不是在这里使用EGF刺激来激活att和sgk 3信号。23。我们也不能排除我们的研究所产生的INPP4B过表达水平不足以过度激活SGK 3的可能性。
图2：INPP4B促进PIK3CA-突变型ER+乳腺癌与乳腺上皮细胞增殖。a–c将表达GFP-INPP4B或GFP-载体的Mcf-7或T47D细胞悬于0.3%软琼脂中，培养4周，使细胞生长不依赖于锚定。a)。数据表示殖民地的相对数量(b)，以及相对菌落大小(c) (n>50集落/实验)±SD(n=3项实验一式三份)。d, e将表达GFP-INPP4B或GFP-载体的Mcf-7细胞血清饥饿24 h，与BrdU共同孵育一夜，用BrdU抗体和DAPI对细胞进行固定和免疫染色。d)。数据表示BrdU阳性细胞的平均百分比±SD(n=3个实验，>300个细胞/实验)(e). f–h表达GFP-INPP4B或GFP-载体的McF-7细胞在夜间饥饿状态下，用EGF(100 ng/mL)刺激。细胞溶解后用Pakt免疫插槽。S 473帕克特T 308，或AKT(PAN)抗体或GAPDH抗体作为负荷对照(f)。数据表示平均相对帕克特。S 473 (g)或帕克特T 308 (h)相对于AKT(PAN)±SD(n=3项实验)。i–k表达Myc-INPP4B的Mcf-10A细胞威汤哥、Myc-INPP4BC842A，或空载体在Matrigel中培养7天后，用Ki 67抗体和DAPI进行固定和免疫染色。i)。数据表示Ki 67阳性细胞的平均百分比±sd(n=3个实验，>200个细胞/实验)(j)，和相对腺泡面积±SD(n=3个实验，15个最大的acini得分/实验)(k). l–n表达INPP4B的McF-10A细胞威汤哥、INPP4BC842A，或空载体在Matrigel中培养14天，用DAPI固定免疫染色。l)。数据表示相对acini面积(m)和每只腺泡的细胞数(n)±SD(n=3个实验，15个最大的acini得分/实验)。o, p表达Myc-INPP4B的Mcf-10A细胞威汤哥、Myc-INPP4BC842A空载体或血清饥饿48h后与BrdU共同孵育。用BrdU抗体和碘化丙酸丙酯固定细胞，免疫染色。o)。数据表示BrdU阳性细胞的平均百分比±SD(n=3个实验，>300个细胞/实验)(p)。标尺，50米(i, l)，100米(d, o)，1毫米(a). p由双尾未配对确定的值t-测试在c, e, g, h，或单因素方差分析及图基后专案测试。j, m, n, p.
接下来，我们用mcf-10a表达野生型乳腺细胞来评估inpp4b是否对三维上皮球体的形成有调节作用。PIK3CA，在三维Matrigel培养中形成极化生长受限腺泡。26。培养7天后，Myc-INPP4B威汤哥但不是Myc-INPP4BC842A(PI(3，4)P24-磷酸酶-死亡)表达MCF-10Aacini(补充图.)2K与病媒控制的acini相比，增殖细胞的比例显著增加(1.5倍)(如图所示)。2我，j)。第7天，腺泡大小无明显变化(见图)。2K)。第14天，Myc-INPP4B威汤哥但不是Myc-INPP4BC842A表达MCF-10A细胞形成较大的腺泡(1.8倍)，与载体对照组相比，每只腺泡细胞数增加1.4倍。2L-n)。21天后，Myc-INPP4B威汤哥过表达的MCF-10A细胞形成成熟的腺泡，在中空腔周围有单层上皮细胞(附图)。2L)。MYC-INPP4B威汤哥表达不影响高尔基标记GM 130的根尖分布。2M)，或切割caspase-3阳性腺泡的百分比(补充图)。2N, o)。这表明INPP4B过表达促进MCF-10A细胞增殖，但不影响细胞的基底极性和凋亡。与此一致，Myc-INPP4B威汤哥但不是Myc-INPP4BC842A血清剥夺(1.7倍)后，过表达的MCF-10A细胞在单层培养中增殖增强(图1.7倍)。2不，p)。EGF刺激的AKTS 473Myc-INPP4B磷酸化降低威汤哥但不是Myc-INPP4BC842A高表达MCF-10A细胞(附图)。2p，q)。这一数据与INPP4B促进PIK3CA-突变型ER+乳腺癌和PIK3CA-PI(3，4)P中的野生型乳腺上皮细胞24-磷酸酶依赖方式。
INPP4B促进PI(3，4)P2晚期内小体对PI(3)P转换的影响
我们使用了几种基于无偏蛋白质组学的技术来表征INPP4b的下游信号功能。PIK3CA-突变型ER+乳腺癌。首先，采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术，对表达MCF-7细胞的GFP-INPP4B和GFP-载体的蛋白质水平(>2倍)进行了研究。功能注释分析表明，INPP4B过表达细胞中的上调蛋白与细胞内溶酶体系统、介导细胞外受体和货物内化和降解的囊泡转运途径密切相关(图1)。3A)。此外，在EGF刺激的MCF-7细胞上，对GFP-INPP4B蛋白复合物进行了免疫共沉淀质谱(IP-MS)分析，以激活Ⅰ类PI3K信号。从这一分析中确定的最丰富的结合伙伴是RAB7A(Rab7)，这是一种小的GTPase，定位于晚期的内小体(图7)。3B)。GFP-INPP4B与内源性Rab7共沉淀证实了INPP4B与Rab7的结合(图7)。3C)。Rab7调节晚期内小体的形成、运动和与溶酶体的融合，其定位和功能受gtp/gp负荷的控制，在gtp结合状态下定位于晚期内小体，然后在gtp水解后分解为gdp。27。HA-Rab7的免疫共沉淀威汤哥、医管局-Rab7Q67L(符合宪法规定)或医管局第7条T22N结果表明，内源性INPP4B能够同时结合GTP和GDP负载Rab7(补充图7)。3A)。值得注意的是，在纯化的体外成分测定中，重组Rab7显著增强了PI(3，4)P24-重组INPP4B的磷酸酶活性呈剂量依赖性(附图)。3B, c).
图3：INPP4B促进局部PI(3，4)P2晚期内小体向PI(3)P转化。a将表达gfp-inpp4b或gfp-载体的mcf-7细胞裂解，用LC-MS/MS进行全细胞蛋白质组学分析，并对gfp-inpp4B表达细胞和gfp-载体细胞中的上调蛋白进行生物信息学微阵列分析(n=3项实验)。b表达GFP-INPP4B或GFP-载体的McF-7细胞在夜间饥饿状态下，用EGF(100 ng/mL)刺激5 min。用GFP-陷阱珠对细胞进行裂解和免疫沉淀.结合蛋白用质谱法测定，用超过2倍的变化和p < 0.05 (n=2项实验)。c将表达GFP-INPP4B或GFP-载体的McF-7细胞裂解，用GFP-陷阱珠进行免疫共沉淀.结合组分和可溶性裂解物(5%输入)进行免疫印迹检测内源Rab7。d表达GFP-INPP4B的McF-7细胞在夜间饥饿状态下，用EGF(100 ng/mL)刺激15 min。细胞固定后，用GFP(10 Nm)和CD 63(15 Nm)抗体进行免疫电镜分析。给出了具有代表性的电子显微照片。箭头显示GFP-INPP4B(白色)和CD 63(黑色)定位。黄色框表示拍摄到高倍率显微照片的区域。e表达HA-Rab7的Mcf-7细胞威汤哥、医管局-Rab7Q67L，或HA-Rab7T22N血清饥饿过夜后用EGF(100 ng/mL)刺激15 min。细胞经0.02%w/v皂甙处理后，用INPP4B、CD 63和HA抗体固定免疫。f用纯化的重组GST-2xFYVE、DAPI和phalloidin对表达GFP-INPP4B或GFP-载体的McF-7细胞进行固定和免疫染色。数据表示每个细胞±SD的2xFYVE+点数(n=3次实验，>50次/次)。g表达NT的McF-7细胞，INPP4B#1，或INPP4B2 shRNA固定，PI(3，4)P免疫染色。2抗体，DAPI，和phalloidin。h, i用重组GST-2xFYVE和EEA 1对表达GFP-INPP4B或GFP-载体的Mcf-7细胞进行固定和免疫染色。h)或CD 63(i)抗体，并与DAPI共染。数据表示2xFYVE+早期内小体的百分比(h)或晚期内小体(i)±SD(n=3次实验，>30次/次实验)。右下角或每幅图像下方的嵌入面板是盒装区域的较高功率区域。标尺为200 nm(d)，10米(e–i). p由修正的Fisher‘s精确测试确定的值在a，或由两尾未配对的t-测试b, f, i.
内源性INPP4B在MCF-7细胞的胞浆中呈弥散分布(附图)。三维空间)。然而，皂素处理的细胞质蛋白去除显示出一池INPP4B，其部分与CD 63阳性的晚期内小体共同定位，是Rab7细胞内定位的位点，这在EGF刺激后最为明显(补充图)。3E)。免疫电镜进一步分析了INPP4B在晚期内小体的定位，发现GFP-INPP4B定位于晚期内小体的限制膜和内膜(图1)。三维空间)，以前的研究已经确定了PI(3，4)P2和PI(3)P28,29。在皂甙处理的MCF-7细胞中，观察到内源性INPP4b与HA-Rab7共定位。威汤哥或HA-Rab7Q67LCD 63阳性的晚期内小体(图1)。3E)。HA-Rab7的表达T22N，一种不定位于晚期内小体的显性阴性突变体(附图)。3F)，也阻止了内源性INPP4B进入这个室(图1)。3E)，提示INPP4B亚细胞定位到晚期内小体需要激活的GTP结合的Rab7。
AsRab7增强INPP4B4-磷酸酶对PI(3，4)P的活性2，我们预测INPP4B可能促进PI(3，4)P2晚期内小体向PI(3)P转化。PI(3)P存在于早期和晚期内膜，并在此使用2xFYVE/Hrs重组生物传感器进行检测。28。GFP-INPP4B显著提高细胞内PI(3)P水平(1.8倍)。3F)。PI(3，4)P2，也存在于早期和晚期的内小体上。18,29，用抗体染色检测MCF-7细胞，但特异性染色不明显，我们推测可能是由于低信号或抗体亲和力。然而，mcf-7细胞表达INPP4B补充图第三代, h)细胞内PI(3，4)P2点点暗示INPP4B耗减抑制PI(3，4)P2内小体的降解导致其积累(如图所示)。第三代)。检查PI(3，4)P的位点2研究了INPP4B、2xFYVE/Hrs与早期内小体标记EEA 1和晚期内胚体标记CD 63对PI(3)P的转换，发现GFP-INPP4B没有改变PI(3)P阳性早期内小体的比例，但显著增加PI(3)P阳性的晚期内小体(1.7倍)(Fig)。3h，i)。相反，INPP4BShRNA耗竭降低PI(3)P阳性晚期内小体(附图)。3I)，支持INPP4B在促进PI(3，4)P转化方面的作用2晚期内小体对PI(3)P的影响。
INPP4B促进PI3Kα依赖的晚期内小体形成
内胚层PI(3)P信号是将含有fyVE或phox同源区(Px)结构域的蛋白质与内胚层膜结合和定位以调控许多过程的关键，包括内小体的早期融合、早期至晚期的内小体成熟和货物分类。30。对MCF-7细胞内溶酶体室的检测显示，GFP-INPP4B对EEA 1阳性的早期内小体无明显影响，但显著增加CD 63阳性的晚期内小体(2.5倍)和LAMP 1阳性溶酶体(1.7倍)的数量(图1)。4一个,b)，提示INPP4B促进晚期内小体/溶酶体的形成。采用BSA-Gold标记MCF-7细胞内溶酶体区进行电镜超微结构分析。GFP-INPP4B增加了BSA阳性空泡结构的数目，类似于晚期内小体。4C)。相反，INPP4BShRNA耗竭减少晚期内小体(附图)。4A-C)，提示INPP4B对晚期内小体的形成有调节作用。用染料猝灭bsa(bsa-dq)检测了货物向溶酶体的转运，该物质通过液相内吞作用被整合到内小体中，溶酶体水解酶随后促进荧光信号的去猝灭和激活。GFP-INPP4B显著增加BSA-DQ阳性结构的数目(2倍).4D，e)，INPP4B的发现增强了通过晚期内小体向溶酶体贩运内吞货物的能力。
图4：INPP4B促进PI3Kα依赖的晚期内小体形成。a, b用EEA 1、CD 63或LAMP 1抗体固定表达gfp-inPP4B或gfp-载体的Mcf-7细胞，并与dapi和phalloidin共染色。a)。数据表示每个细胞的EEA 1+、CD 63+或LAMP 1+点数(n=3个实验，每个实验>50个细胞)(b). c将表达GFP-INPP4B或GFP-载体的McF-7细胞血清饥饿1h，加入含BSA-金(10 Nm)的培养基培养3h，固定细胞，进行电镜观察。给出了具有代表性的低放大率和高倍率电子显微照片。黄色盒子表示拍摄到更高放大率显微照片的区域。d, e将表达GFP-INPP4B或GFP-载体的Mcf-7细胞与BSA-DQ(40g/mL)孵育5h，用DAPI固定染色。d)。数据表示每个细胞±SD的BSA-DQ+点数(n=3个实验，每个实验>50个细胞)(e). f, g将表达GFP-INPP4B或GFP-载体的Mcf-7细胞分别用BKM 120(0.5M)或BYL 179(1M)处理24h，或DMSO作为载体对照，用CD 63抗体固定染色，DAPI和phalloidin共染色。f)。数据代表每个细胞±SD的CD 63+点数(n=3个实验，每个实验>50个细胞)(g)。标尺为10公分(a, d, f)，2米(c). p由双尾未配对确定的值t-测试在b, e，或单因素方差分析及图基后专案测试。g.
Vps 34催化PI(3)P依赖性晚期内小体的形成31。这类PI3K将PI磷酸化成PI(3)P。然而，我们的发现表明PI(3，4)P2INPP4B向PI(3)P的转化也有助于晚期乳腺癌细胞内小体的形成。与此一致，Myc-INPP4B的表达威汤哥而不是PI(3，4)P2磷酸酶-死亡Myc-INPP4BC842A增加MCF-10A细胞CD 63阳性的晚期内小体数(1.5倍)(附图)。4D, e)。内小体PI(3，4)P2是由合成PI(3，4，5)P的I类PI3K的顺序作用生成的。3，以及水解PI(3，4，5)P的5-磷酸酶。3至PI(3，4)P2，然后被贩运到早期的内小体。18,32。内小体PI(3，4)P2也是由Ⅱ类PI3K PI3KC2α或肝脏特异性PI3KC2γ从PI(4)P生成的。33,34。确定产生PI(3，4)P的上游路径2经INPP4B降解后，我们使用shRNA或候选PI3Ks抑制剂。耗竭PIK3C2A使用两种不同的shRNAs(补充图)。5A, b)不影响GFP-载体或GFP-INPP4B MCF-7细胞的晚期内小体形成(附图)。5C， d)。相反，使用PAN-Ⅰ类PI3K抑制剂BKM 120抑制I类PI3K信号传导(补充图)。5E)，PI3Kα特异性抑制剂BYL 719(补充图1)。5F)或PIK3CA使用两种不同的siRNAs进行耗竭(补充图)。5G，h)抑制GFP-INPP4B细胞晚期内小体的形成。4f、g和补充图。5I, j)。这些结果提示了I类PI3K信号通过产生PI(3，4)P促进晚期内小体形成的模型。2，经INPP4B水解后，在晚期内小体上生成PI(3)P。
INPP4B促进晚期内膜体介导的细胞增殖和肿瘤生长
PI(3)P信号通过招募Hrs来调节晚期内小体的形成，Hrs是运输所需的内小体分选复合体(ESCRT)的一员，它有助于腔内囊泡(ILV)的形成。35. 小时ShRNA缺失对HeLa细胞增殖和移植瘤生长的抑制作用36。我们推测，INPP4B通过在晚期内小体上产生PI(3)P，通过Hrs促进晚期内小体的形成。值得注意的是，shRNA介导的Hrs耗竭(附图)。6A, b导致GFP-载体细胞中CD 63阳性的晚期内小体减少，GFP-INPP4B细胞后期内小体形成增加到GFP-载体控制水平(图1)。5一个,b)。透射电镜证实了这一点。6C)，表明INPP4B参与了PI(3)P驱动的Hrs介导的晚期内小体的形成。
图5：INPP4B促进晚期内小体依赖性细胞增殖和肿瘤生长.a, bMcf-7细胞共表达gfp-inpp4b或gfp-载体，以及nt或小时用CD 63抗体固定和免疫染色，DAPI和phalloidin共染色。a)。数据代表每个细胞±SD的CD 63+点数(n=3个实验，每个实验>50个细胞)(b). c, dMcf-7细胞共表达gfp-inpp4b或gfp-载体，以及nt或小时将shRNA悬浮在0.3%的软琼脂中，培养4周，以实现不依赖锚定的菌落生长(c)。数据表示相对菌落大小±SD(n=3项实验一式三份，n>50个菌落/试验)(d). e–g1×106Mcf-7细胞共表达gfp-载体n=8只老鼠)，绿色荧光蛋白-载体：小时ShRNA(n=8只小鼠)，GFP-INPP4B；NT shRNA(n=7只小鼠)，或GFP-INPP4B；小时ShRNA(n将7只小鼠与Matrigel混合，注射到BALB/c裸鼠第四乳脂肪垫内。自注射后2周起，用卡钳每周3次测量肿瘤大小。数据表示注射后2周的肿瘤大小，在实验的过程中±SD。e)。数据显示注射±SD后42天在体内提取的乳腺肿瘤重量。f)。注射后42天6例有代表性的离体乳腺肿瘤的比较g)。标尺10米(a)，1毫米(c)，1厘米(g). p由单因素方差分析及图基后专案测试确定的数值载於b, d，进行双向方差分析和Tukey后专案试验。e，或单因素方差分析f.
我们还研究了INPP4B是否依赖于Hrs介导的晚期内小体形成来促进MCF-7细胞的增殖。在不依赖安克雷奇的细胞生长测试中，小时ShRNA缺失对GFP-载体软琼脂集落大小无影响，但使GFP-INPP4B细胞集落数增加，与Hrs依赖性细胞增殖一致。5C，d)。为了检测hrs在体内对异种移植瘤生长的依赖性，将MCF-7细胞注射到女性第四腹股沟乳脂垫内。Balb/c裸鼠。与GFP-载体相比，GFP-INPP4B在体内的肿瘤体积和体外肿瘤重量明显增加(3倍)。5E-g)。尽管小时基因敲除不影响gfp载体肿瘤的大小和重量，抑制gfp-inpp4b肿瘤的生长。小时耗竭(图1.5E-g)，表明INPP4B促进细胞增殖和肿瘤生长。PIK3CA-突变型ER+乳腺癌细胞呈小时依赖性。
INPP4B通过促进GSK 3β溶酶体降解促进PI3K依赖性Wnt/β-catenin信号转导
晚期内胚体贩运可能通过促进细胞内信号受体和效应蛋白的激活或降解而影响许多不同的促增殖途径。为了解决这一问题，我们用NanoStringRNA谱分析了GFP-INPP4B与表达MCF-7细胞的GFP-载体中已知的肿瘤通路，揭示了几个Wnt/β-catenin途径基因的表达改变(图一)。6A)。Wnt/β-catenin信号转导调控乳腺上皮细胞增殖和迁移，并在超过50%的人乳腺癌中过度激活。37,38。Wnt/β-catenin靶基因mRNA表达增强AXIN 2(1.8倍)LEF 1(5.6倍)Dkk 1(3.3倍)MYCN定量RT-PCR证实GFP-INPP4B-MCF-7细胞Wnt/β-catenin信号增强。6B)。MRNA表达增加AXIN 2(1.9倍)LEF 1(2.3倍)Dkk 1T47D细胞表达GFP-INPP4B(附图)(3.2倍)。7A)，说明INPP4B增强了wnt/β-catenin在PIK3CA-突变型ER+乳腺癌细胞。AXIN 2Myc-INPP4B mRNA水平增高威汤哥但不是Myc-INPP4BC842A表达MCF-10A细胞(附图)。7b)，提示Wnt/β-catenin活化增强依赖于INPP4BPI(3，4)P24-磷酸酶活性。
图6：INPP4B促进Wnt/β-catenin活化。
aGFP-INPP4B与表达MCF-7细胞的GFP-INPP4B的NanoString RNA谱分析所鉴定的Wnt途径基因差异表达(>2倍)。表明WNT/β-catenin靶基因。b从表达gfp-inpp4b或gfp-载体的MCF-7细胞中提取RNA，用引物进行两步定量RT-PCR。AXIN 2, LEF 1, Dkk 1, MYCN, MYC，或CCND 1。表达式被规范化为GAPDH。表达用ΔΔCT法测定，表达相对于GFP-矢量控制细胞(±SD)。n=3项实验)。c–e用50%Wnt3a条件培养基±10%R-海绵体条件培养基或50%L-细胞控制培养基刺激表达GFP-INPP4B或GFP-载体的McF-7细胞。c提取RNA，用引物进行两步定量RT-PCR。AXIN 2表达式被规范化为GAPDH。用ΔΔCT法测定表达，表达相对于L细胞控制介质处理的gfp载体控制细胞(±sd)。n=3项实验)。d细胞经裂解后用非膦β-catenin免疫印迹。S33/S37/T41以活化-β-catenin、β-catenin或GSK 3β抗体和GAPDH抗体作为负载对照.e数据代表平均GSK 3β水平相对于GAPDH±SD(n=3项实验)。f, gMcf-7细胞共表达gfp-inpp4b或gfp-载体，以及nt或小时以GSK 3β抗体或GAPDH抗体作为负载对照(f)。数据代表平均GSK 3β水平相对于GAPDH±SD(n=4项实验)(g). h表达GFP-INPP4B或GFP-载体的McF-7细胞经6.5μg/mL洋地黄皂甙处理后，在0.1%TritonX-100存在或不存在的情况下，用1g/mL蛋白酶K处理。用GSK 3β抗体对细胞进行裂解免疫，以GAPDH抗体作为负载对照。黄色框表示GSK 3β蛋白不受蛋白酶K处理的保护。i将共表达RFP-GSK 3和GFP-INPP4B或GFP-载体的McF-7细胞与50 NM LysoTracker深红孵育1h，用DAPI固定染色。每个图像右下角的嵌入面板是盒装区域的较高功率区域。j, k将表达gfp-inpp4b或gfp-载体的Mcf-7细胞悬浮在0.3%软琼脂中，以2 M iWP-2或DMSO作为载体对照，培养4周，使细胞生长不依赖于锚定。j)。数据表示相对菌落大小±SD(n=3项实验一式3份，50批/试验)(k)。标尺为10公分(i)，1毫米(j). p由双尾未配对确定的值t-测试在b，单因素方差分析c, e, g，或单因素方差分析及图基后专案测试。k.
WNT/β-catenin通路激活需要抑制β-catenin破坏复合物(Axin、APC、CK1、PP2A和β-TrCP)中的GSK 3β。在wnt/β-catenin不活化的情况下，gsk 3β磷酸化β-catenin。S33/S37/T41导致β-catenin蛋白酶体降解，从而抑制Wnt/β-catenin信号传导.当wnt/β-catenin信号被激活时，gsk 3β被吸收到内小体中，然后在晚期内小体腔内固定，并被溶酶体降解。39,40。这使得β-catenin在细胞核中积累，并与TCF/LEF转录因子结合，促进Wnt靶基因的转录。Wnt/β-catenin信号转导被Wnt3a和R-海绵体激活，在此条件下，gfp-inpp4b细胞表达增强。AXIN 2非膦β-catenin的表达S33/S37/T41(Active-β-catenin)水平与gfp-载体对照(图1)相比较.6C，d)。此外，在基础和Wnt刺激条件下，GFP-INPP4B表达降低了GSK 3β蛋白水平，与GSK 3β的破坏增强相一致。6d)。无变化GSK3B在GFP-INPP4B细胞中观察mRNA水平(附图)。7C)。抑制晚期内小体形成后，GSK 3β蛋白水平降低。小时ShRNA耗竭(图1.6f、g)。用蛋白酶保护法检测了晚期内小体内谷胱甘肽3(GSK 3)的β固存情况。在洋地黄素渗透后，细胞质蛋白对蛋白酶K降解敏感，而细胞器内的蛋白质受到保护。41。在没有Wnt刺激的情况下，晚期内小体中不易检测到GSK 3β。40,42然而，GFP-INPP4B而不是GFP-载体细胞表现出明显的GSK 3β蛋白酶保护作用，这与增强GSK 3β向晚期内小体的转运相一致。六小时)。免疫荧光证实了这一点，RFP-GSK 3与LysoTracker共定位。LysoTracker是在GFP-INPP4B中积累的一种染料，在GFP-INPP4B中没有发现GFP-载体细胞(图1)。6I)。总之，这一数据表明INPP4B通过晚期内小体-溶酶体室促进GSK 3β的贩运和降解。
评估INPP4B是否促进PIK3CA-突变型ER+乳腺癌细胞通过wnt/β-catenin信号通路，在小分子Porcupn抑制剂iWP-2或lgk-974抑制wnt配体分泌的情况下，或在促进β-catenin破坏复合物稳定作用下，进行了β-catenn小分子抑制剂iwr-1-endo的检测。43。用滴定法测定对表达GFP载体的MCF-7细胞增殖无影响的最大浓度。用IWP-2、LGK-974或IWR-1处理GFP-INPP4B MCF-7细胞可使细胞增殖降低到与载体处理的GFP-载体细胞相当的水平(补充图1)。7D， e)。此外，在不依赖支抗的细胞生长试验中，IWP-2处理减少了GFP-INPP4B细胞的集落大小。6J，k).
249个ERα基因表达分析+乳腺癌显示几个Wnt通路基因上调(TCF7L2, MSX 2, Wnt5A，和TNFRSF11B)在PIK3CA-突变型肿瘤与野生型肿瘤44，提示ER中PI3Kα与Wnt信号之间可能存在功能联系。+乳腺癌。利用METABRIC数据集，我们对1459年ER中17个常见的wnt/β-catenin通路基因的表达进行了评估，其中包括几个wnt靶基因。+乳腺癌(图1.7A). PIK3CA-突变型癌症在17种Wnt基因中有12种表达高于PIK3CA野生型肿瘤，包括5个Wnt靶基因(LEF 1, MYCN, FZD 7, SFRP 2，和TNFRSF11B)和7个Wnt信令组件(TCF7L1, TCF7L2, CTNNB 1, FZD 4, SFRP 1，Wnt5A，和MSX 2)。我们还检测了这些基因在另一组698流明(ER/PR)中的表达情况。+)使用TCGA数据集的乳腺癌(补充图)。8)，在哪里PIK3CA-突变型癌症中有8个Wnt基因(LEF 1, TCF7L1, TCF7L2, CTNNB 1, LRP 6, SFRP 2, Wnt5A，和MSX 2)。因此PIK3CA-突变型ER+乳腺癌显示INPP4B表达增加，其基因表达谱与Wnt/β-catenin信号增强相一致。为了确定INPP4B是否促进PI3K和wnt/β-catenin通路之间的串扰，我们用PI3K抑制剂BKM 120(0.5和1M)对gfp-载体和gfp-INPP4B MCF-7细胞进行了处理，并检测了wnt靶基因的mrna表达。AXIN 2, LEF 1，和MYCN(无花果)7乙-d)。在GFP-载体细胞中，低剂量BKM 120对Wnt靶基因表达的影响最小，高剂量时Wnt基因表达降低。在GFP-INPP4B表达细胞中，较低的BKM 120可部分抑制Wnt基因表达的增加，且在高浓度时进一步降低。总之，这些发现与一种解释一致，即inpp4b促进wnt/β-catenin信号传递，从而促进wnt/catenin信号的增殖。PIK3CA-突变型ER+乳腺癌细胞通过增强晚期内小体的形成(图一)。7E).
图7：突变体PIK3CA通过INPP4B促进Wnt基因的表达。a在1469个ER中检测了17个Wnt通路基因的表达情况。+来自METABRIC队列的乳腺癌，由PIK3CA-突变状况。中间线表示中位数，下界表示第25百分位数，框的上界表示第75百分位数，下晶须从第25百分位数延伸到第5百分位数，上晶须从第75百分位数延伸到第95百分位数。b–d将表达gfp-inpp4b或gfp-载体的mcf-7细胞用BKM 120(0.5或1M)或DMSO作为载体对照处理48h，然后用引物提取RNA进行两步定量RT-PCR。AXIN 2 (b), MYCN (c)，或LEF 1 (d)。表达式被规范化为RRN18S。表达用ΔΔCT法测定，表达相对于车辆处理的gfp载体控制细胞(±sd)。n=3项实验)。eINPP4B介导的PI3Kα和Wnt/β串扰模型在……里面PIK3CA-突变型ER+乳腺癌INPP4B通过与Rab7的相互作用而被上调并定位于晚期内膜小体，从而增强其PI(3，4)P24-磷酸酶活性。INPP4B转换PI(3，4)P2PI3Kα下游的PI(3)P促进Hrs介导的迟发性内小体形成，增加GSK 3β与β-catenin结合的溶酶体降解，促进Wnt/β-catenin信号的激活。p由未配对的双尾Mann-Whitney检验确定的数值a，或单因素方差分析及图基后专案测试。b, c, d.
