病人特征
在7个不同的治疗中心对62例AML患者进行了筛查，其中25例接受了AFMT治疗，20例被认为是治疗方案的人群。表中列出了接受治疗和按方案治疗的患者的基线特征。1(见补充表中筛选失败病人的数据)1)。按方案人口中男性多于女性(比例为3：1)，中位年龄为50岁(范围为24-68岁)。大多数患者(80%的治疗和每方案患者)被认为是中度危险的AML，而治疗人群中的3名和2名分别来自有利和不利的危险组。所有患者均接受胞嘧啶阿糖胞苷联合蒽环强化IC治疗，但1例用吉图祖马阿扎霉素替代蒽环类药物的患者除外。IC期间未使用预防性抗生素，但除1例患者外，其余患者均接受了大剂量抗厌氧抗生素(哌拉西林-他唑巴坦或亚胺培南-西司他丁)治疗发热性中性粒细胞减少。最后一位病人没有使用抗生素治疗发热性中性粒细胞减少症。
表1.治疗和按方案治疗的患者的基线人口和临床特征。 AFMT程序的可行性和可接受性
将AFMT的可行性和可接受性作为次要结果进行评价。符合纳入和排除标准的患者28例，拒绝接受AFMT手术的3例，接受治疗的25例，每隔1天接受两次AFMT治疗。然而，只有20名患者能够按计划在IC和再生障碍性造血恢复后接受两种AFMT治疗(见图)。1学习流程图)。其余5例中，AFMT在IC后即刻不可行，第一次巩固化疗后延迟4例[AFMT禁忌症2例(肛瘘2例)。n=1)和结肠炎(n(1)1例因感染需要延长抗生素的感染事件，在再生障碍性贫血造血恢复后35天内组织后勤。
图1：学习流程图。急性髓系白血病。AFMT，自净粪便微生物区系转移；D，日。
在AFMT时，血红蛋白中位数为9.35g/dL(IQR为8.85~10.1)，白细胞数为4.8g/L(IQR为2.0~8.0)，白细胞数为1.78g/L(IQR为0.75~4.7)，淋巴细胞计数为0.88G/L(IQR为0.65~1.12)，血小板计数为66G/L(IQR，31.5~246)。1)。第一次和第二次保留时间分别为188.50 min[范围48-288]和138 min[范围41-245]，而非推荐的120 min)，证明了灌肠程序的可行性和患者无不适感。
为了评估手术的可接受性，接受治疗的患者的生活质量(n在整个临床研究中进行了评估。数据显示，与武警前V2组相比，AFMT(V3)后问卷调查结果相似或有改善趋势(特别是自我护理、日常活动、焦虑和抑郁参数)，这说明AFMT对患者整体健康没有负面影响(补充表)。2).
用AFMT重建肠道微生物区系
评价AFMT对微生物多样性测定治疗失调的疗效，作为一项共同的结果。我们首先研究了IC和随后的AFMT治疗对各方案患者粪便微生物区系丰富度和多样性的影响。我们证明，基于α-多样性指数，IC引起了丰富度的显著下降，这些指数反映了V1(IC之前的基线)和V2(IC之后和AFMT之前)之间存在的独特细菌类群的数量及其相对丰度：中位Shannon指数4.0对2.4；p=0.0002)和中位逆Simpson指数21.5对5.1(p分别=0.0009)(图1。2A)。在基因水平上也进行了类似的观察：中位丰富度548,529对81,980(p < 0.0001) (Supplementary Fig. 2)。使用Bray-Curtis相似指数(BC)测量β-多样性，该指数允许对每个参与者样本之间的细菌多样性进行比较评估，结果表明，在IC之后，微生物群落发生了显著的变化(中位数BC V1-V2：0.12)。2B)和支持炎症的家庭的统治(肠杆菌科, 肠球菌科和维龙葵科)(图1.3和补充图。3)。与V2相比，α多样性指数恢复到最初的中位数水平(中位数Shannon：4.0)。p=0.0001；中位逆辛普森：21.8，p=0.0003)，V1和V3值之间无显着性差异(图1)。2A)。基因数量显著增加，但没有恢复到基线水平(中位丰富度：389,768，p < 0.0001 when compared to V2) (Supplementary Fig. 3)。因此，根据物种多样性指数，对AFMT后V3区的肠道微生物群进行了重建。事实上，bc相似性指数显示了AFMT处理后微生物群落的恢复，特别是对家庭而言。龙须草科和反刍动物科，在物种水平(BCV-1-V3：0.50)，哪种组成更接近于最初群落的组成(图五)。2b，3)。然后我们观察到，以阿糖胞苷为基础的巩固化疗不会改变V4的肠道微生物多样性，与V3相比，α多样性指数没有明显降低，基因丰富度略有降低(中位香农：3.5；反向辛普森：14.2；基因丰富度：270,689，p=0.039)(图1。2A和补充图。2)。最后，我们观察到，在19例接受抗生素治疗的患者中，接受碳青霉烯类(亚胺培南-西司他丁或美洛南)的患者与单用哌拉西林-他唑巴坦的患者相比，V2的α-多样性指数有所下降，但在AFMT(补充图3)后仍维持在V3。4).
图2：每例患者从探视1(V1)到探视4(V4)的粪便微生物区系特征(n =20)。a在物种水平上测量的α多样性，从左到右：Shannon和反向Simpson指数(P-数值由双面符号级Wilcoxon配对检验确定，不作多次比较调整，误差条表示中位数和四分位数范围)。b利用Bray-Curtis指数测量物种的β-多样性，基于每次访问的Bray-Curtis相似性，比较访问和主坐标分析(P-数值由双面符号级Wilcoxon配对检验确定，不作多次比较调整，误差条表示中位数和四分位数范围)。源数据作为源数据文件提供。
图3：家庭概况热图。在不同样品中发现的家族的相对丰度用蓝色表示。每个列对应于一个病人，并且在不同的面板之间尊重列的顺序。只有提供了从探视1(V1)到探视4(V4)的完整动力学的病人(n=12)。每个样本的Shannon指数在物种水平和Bray-Curtis在物种水平上与V1相似的相关值被表示出来。Shannon指数的范围以研究群体的Shannon值为基础：低<1四分位数、中等≥第一四分位数和<3四分位数、高≥第三四分位数。对于Bray-Curtis相似性指数：低<0.4，中等≥0.4和<0.6，高≥0.6.在对结果进行分析之前，对这一数学方法进行了选择。
MDRB非殖民化
评价AFMT根除MDRB的疗效，作为一个共同的结果。为了评价抗生素耐药性的存在，我们在MEGARes抗药性基因数据库中绘制了总序列读图。我们发现有证据表明IC和相关的抗生素治疗会导致从V1到V2的针对抗生素耐药基因的中位阅读数显著增加(166,158对352,140读)，p=0.0008)的每个方案的病人(图)。4)。此后，在AFMT(198 374读)后，在V3观察到映射的读数中位数显著减少。p=0.0056)。V4(158,229读)的抗生素耐药基因计数与V3相比也没有显著差异，说明AFMT对缓解巩固化疗和抗生素引起的微生物破坏有积极作用(图一)。4).
图4：通过从V1到V4的亚基因组测序所确定的针对抗生素耐药基因的读取数(n =20)。P-数值由双面符号级Wilcoxon配对检验确定，不作多次比较调整，误差栏显示中间值和四分位数范围。ABR是针对抗生素耐药基因的。源数据作为源数据文件提供。
不良事件
收集不良事件，评价AFMT(次要结局)的安全性。在AFMT治疗期间，接受治疗的患者生命体征无不良变化(n(心率、血压)(补充表)3)。在AFMT后的前24小时，有4名患者(16%)报告了5项不良事件(补充表)。4)。两例患者均认为与手术有关，但均不需要治疗，无后遗症，1例中度腹痛6天，1例轻度腹泻5周，均于第二次AFMT治疗后第2天开始。AFMT后24h内，其余3例AES均为轻度短暂性发热(38.1°C)、腹泻和体重增加。关于体重的增加，病人在V2和V3之间增加了6公斤。值得注意的是，这个病人在AFMT期间营养不良，在IC(V1和V2之间)期间体重减轻了12公斤。在此期间，治疗人群中未报告严重不良事件(SAES)。
术后24小时至1年随访结束，25例接受治疗的患者中有24例报告415例(96%)(补充表)。5)。其中1例在AFMT后第8天出现轻度黏膜炎症，自AFMT后103天开始，可能与手术有关。其他AES与接受强化化疗的白血病患者的资料一致。大多数AE发生在包涵体与AFMT之间(V1-V2)(发病率为每100人日27%)和V3至V4(发病率为每100人日15%)(补充图)。5).
此外，还报道了SAES，主要是与AFMT(V1-V2)(5例15例，发病率为每100人日1.57%)和V3至V4(3例11例，发病率为每100人日0.90%)之间的SAES(补充图)(补充图)。5和补充表6)。这些SAE均未发生在AFMT后的第一个月。现场调查员宣布只有一个SAE可能与AFMT治疗有关。多药耐药无症状定殖大肠杆菌在第二次AFMT后22天V3检测到患者的粪便。此后，病人出现了大肠杆菌第二次AFMT后93天出现脓毒症，伴有体温升高和胃肠道症状，经抗生素治疗完全痊愈。多药耐药大肠杆菌在AFMT产品筛选过程中未检测到。
最后，急性髓细胞白血病患者在巩固后强化化疗过程中有很高的传染性负担。16我们决定评估AFMT对感染性AE的影响。在巩固化疗过程中，仅有6例患者有微生物定义感染(MDI)，1例临床定义感染(CDI)，8例发热原因不明，5例无发热。三组间AFMT后的微生物多样性差异无显着性(附图)。6)。关于巩固化疗过程中使用抗生素的问题，我们发现只有一半的患者(n=10)接受大剂量抗厌氧菌(亚胺培南-西司他丁)抗生素，n=3；哌拉西林-他唑巴坦，n第三代或第四代头孢菌素5例，未使用抗生素5例。有趣的是，接受抗生素大范围抗厌食症覆盖的患者在afmt后的α多样性显著低于那些接受抗厌食症治疗的患者或没有抗生素的患者(补充图)。6).
炎症参数
此外，为了评估AFMT(二级预后)的安全性，我们还在肠道和系统地测量了每一方案患者的肠道和血浆中的炎症参数。n20)在头三次访问期间(见图)。5和补充图。7)。如强化化疗后预期的那样，在V2(中位数V1：8.9mg/L；V2：19.1mg/L)时，全身C反应蛋白显著增加；p(中位V3：4.05mg/L；V2对V3：p=0.0052)。全身新蝶呤水平的变化与V2的变化相同，在V2时增加，在V3时恢复到基线水平(图1)。5A).
图5：各方案患者生化和免疫学参数的演变(n =20)。a血液系统水平，从左到右：新蝶呤，C-反应蛋白(P-数值由双面符号秩Wilcoxon配对检验确定，对多个比较不作调整，误差条表示中位值和四分位数范围，对于新蝶呤，则不作调整。n=10)。b粪便中的局部水平：新蝶呤，分泌免疫球蛋白A(IgA，P-数值由双面符号级Wilcoxon配对检验确定，不作多次比较调整，误差条表示中位数和四分位数范围)。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们试图通过测定粪便中的新蝶呤和分泌型IgA来评估肠道的局部免疫和炎症。5B)。新蝶呤是由活化的巨噬细胞在不同的诱导剂(如细菌成分)的刺激下，并通过干扰素γ、肿瘤坏死因子α途径产生和释放的。17。新蝶呤反映了细胞介导的免疫反应的程度，从而反映了肠道炎症的程度。IC后粪中位新蝶呤水平显著升高(V1：1.05 ng/g，V2：23.45 ng/g)；p0.0002)，重点介绍了IC和抗生素治疗后患者的肠道炎症状态。AFMT后水平显著下降并恢复到基线水平(V3：1.58纳克/克粪便)；p=0.0003(与V2相比)。这些变异与C反应蛋白变异一致。作为局部免疫指标，粪便中分泌型IgA也有类似的变化趋势(中位V1：1.21mg/g粪便，V2：2.55mg/g粪便，V3：1.72mg/g粪便)。总之，这些数据清楚地指出，AFMT后没有局部和系统的有害炎症反应。
以前的研究报告说氧化应激与癌症的发生和发展密切相关。18也与肠道失调有关。炎症过程中发生的氧化应激是一种通过强烈降低肠道微生物多样性和促进特定耐气性和促炎性细菌类群的生长而导致肠道生物失调的因素。19。因此，保持功能性抗氧化反应是很重要的。我们测定了总抗氧化状态(TAS)，观察到V1和V2(中位数V1：1.35mmol/L；V2：1.30mmol/L)之间TAS水平无明显变化，但AFMT后(V3：1.44mmol/L)显著升高；p=0.0026)，可能与肠道微生物区系恢复有关(附图)。5).
宿主与微生物区系参数的相关性
最后，为了建立一个生物异常特征(次级结果)，我们试图研究微生物参数(例如，特定类群的丰富度和α多样性指数)与免疫和炎症参数(新蝶呤、IgA、IL-10、crp…)之间的联系。)通过进行Spearman相关分析，所有的访问加在一起(如图所示)。6)。我们把重点放在已经被证实在血液恶性肿瘤患者中起作用的细菌上。20，包括产生丁酸的细菌(Blautia，Rummino球菌，Roseburia，Clostridium和Eubecterium Limosum), 双歧杆菌交叉喂食丁酸盐，阿克门西亚和肠球菌。我们发现粪便新蝶呤与α多样性、产丁酸杆菌和双歧杆菌。同样，一些产生丁酸的细菌与其他炎症指标(包括CRP、铁蛋白和CD 14+单核细胞)呈负相关。此外，IgA，这是与炎症和肠道微生物群失调在肠易激综合征，也与相关的丁酸产生细菌在您的研究。与之形成对照的是促炎细菌。肠球菌与粪新蝶呤、铁蛋白呈正相关，与产丁酸杆菌呈负相关。蔷薇。最后，阿克曼西亚这与肥胖、糖尿病、心脏代谢疾病和低度炎症成反比关系。21，同时也是对癌症免疫治疗的反应。22，与产丁酸杆菌和TGFβ2呈正相关，与炎症指标(粪便新蝶呤、CD 14+单核细胞和中性粒细胞)呈负相关。
图6：宿主与微生物参数的相关性(n =20)。Spearman成对相关只描述了显著的相关性。蓝色=正相关；红色=负相关。相关值是根据所有患者在所有就诊时测量的值计算的(除β2外，仅考虑在访问V3时测量的值)。CRP为C反应蛋白、IgA、免疫球蛋白A、转化生长因子2_V3、转化生长因子β_2、CD_14_pos、分化14阳性。源数据作为源数据文件提供。
临床结果
本文描述了所有接受AFMT治疗的患者的临床结果和畸形矫正对临床状态(次级结局)的影响。n=25)。存活患者的中位随访时间为29.9个月(27.5~37.0)个月.在接受治疗的患者中，除1名外，其余均对V3期化疗有反应(96%)，根据2017年ELN指令，23例完全缓解，1例部分缓解。23。7例复发患者中位16.8个月(3.9~27.8)个月。无白血病生存率(LFS)6个月为88%，2年为60%(补充图)。8)。18例患者在纳入后5.0(2.8~2 1.6)个月内接受同种异体HCT治疗，其中3例在复发和挽救化疗后接受治疗。第180天II~Ⅳ级急性GVHD累计发病率为22%(n=4)，包括3例胃肠道受累(第1期，n=1；第2阶段，n=1和第4阶段，n=1)。死亡8例，死亡2例，GVHD 1例，脓毒症2例(1例急性GVHD患者AFMT后1~113天，AML复发1例，AFMT后1例762天)，CMV 1例，多器官衰竭1例，血栓栓塞1例。总生存率(OS)6个月为92%，2年为72%(补充图)。8)。最后，为了评价V3区微生物重建对患者预后的影响，我们将α-多样性指数分为低多样性、中多样性和高多样性，并对低和中高α多样性患者的OS和LFS进行了比较。中高Shannon指数组(AFMT后)2年OS和LFS分别为71%和71%，而低Shannon指数组分别为62%和38%。p=0.79和p=0.27，附图。8).
