瘤内CXCR 5+CD8+T与胃癌良好的临床结局及免疫背景的关系

检验CD8之间的联系的研究+胃癌的T和预后不一致，CXCR 5的人群也不同。+CD8+与更好的整体生存率相关的T在各种恶性肿瘤中已经有报道。在这里，我们展示了瘤内CXCR 5的丰富度。+CD8+T细胞与胃癌患者的整体生存密切相关。肿瘤内CXCR 5增高的TNMⅡ+III型胃癌患者+CD8+T细胞浸润更有可能受益于辅助化疗。CXCR 5富集微卫星不稳定型和Epstein-Barr病毒阳性肿瘤+CD8+T细胞胃癌浸润CXCR 5+CD8+T细胞代表一种特殊的干细胞样CD8亚型。+具有效应器记忆功能。胃癌浸润CXCR 5的临床意义及表型鉴定+CD8+T为患者分层和靶向治疗试验提供了路线图。

在胃癌(GC)中，人们曾多次尝试将CD8的密度联系起来。+T与预后及治疗结果有关。虽然CD8+T细胞被认为是肿瘤微环境的抗肿瘤手臂，研究证实了肿瘤内CD8之间的联系。+T与GC预后结果不一致1,2,3。先前的研究2显示出CD8的关联+T和损害整体生存(OS)，这与后来的研究结果相反。3。这些发现提示了有争议的预后效应和CD8的异质性特征。+T细胞4,5在GC里。

一些研究已经确定了CD8的一个子集。+在慢性淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒感染中以cxr 5的表达为特征的t，它是一种自我更新的精疲力竭的祖细胞，并在程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)阻断后产生增殖爆发。6,7,8。进一步的研究报告，CXCR 5的频繁密度+CD8+T与淋巴瘤患者OS改善相关9肝10、胰腺11肺12、结肠直肠13，和甲状腺14恶性肿瘤。然而，靶向CXCR 5的预后价值和潜在的治疗效果+CD8+未对气相色谱中的T进行研究。

这里我们展示了瘤内CXCR 5的丰富度。+CD8+在胃癌患者中，T与较好的OS有关。肿瘤、淋巴结、转移瘤(TNM)Ⅱ+III型肿瘤CXCR 5增高的患者+CD8+T细胞浸润更有利于辅助化疗(ACT)。此外，GC渗入CXCR 5+CD8+T有茎样效应记忆CD8+T特征在癌基因组图谱(Tcga)分类的微卫星不稳定(Msi)和EB病毒(epstein-barr virus，EBV)阳性子集和亚洲癌症研究小组(Amrg)msi子集中得到丰富。15,16.

CXCR 5的存在+CD8+GC中的T细胞

确定是否存在CXCR 5+CD8+在GC中进行T细胞双免疫组织化学(IHC)染色和流式细胞术(见图)。1)。如图所示，有更多的CXCR 5。+CD8+低病理T期T细胞与非转移性肿瘤(图1)。1A，b)。进一步的分析验证了CXCR 5的有效性。+CD8+T细胞主要存在于肿瘤和癌周组织，仅占CD8的3%。+外周血T细胞表达CXCR 5。1C，d).

a具有代表性的高、低CXCR 5图像+CD8+T细胞浸润GC组织。三个独立实验中有代表性的染色。bCXCR 5协会+CD8+与ZSHS和FUSCC联合队列的病理T分期、病理N期、转移和分级有关。图显示极小，最大值，中心，盒和晶须的界，和百分位数n=781例胃癌病理T期(n=162和n分别为T1+2和T3+4亚组619例)，病理N期(n=242和n分别为N0和N1+2+3亚组539例)、转移组(n=758和n分别为M0和M1亚组23例)，分级(n=192和n分别为G1+2和G3亚组589例)。双尾未配对统计分析t测试一下。cCXCR 5的典型流式细胞术图像+CD8+外周血、瘤周和肿瘤组织中的T细胞。dCXCR 5的存在+CD8+外周血、瘤周和肿瘤组织中的T细胞。图显示平均±SDn=4(外周血)，n=26(瘤周组织)，和n=37例(肿瘤组织)患者。双尾未配对统计分析t测试一下。源数据作为源数据文件提供。高功率场。

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CXCR 5+CD8+据报道，t群体与肿瘤组织中的三级淋巴样结构(TLS)有关。17。为了研究这个子集是否存在于类似TLS的小生境中，我们进一步在连续的切片中进行了多重免疫荧光(IF)和苏木精-伊红染色。如附图所示。1、CXCR 5+CD8+T细胞主要分布在tls样生态位，而存在散在的cxcr 5。+CD8+T细胞位于非TLS区。

CXCR 5+CD8+T是一个比CD8更好的预言家。+气相色谱中的T

肿瘤内CD8的预后价值比较+T和CXCR 5+CD8+在胃癌患者中，我们在中山医院队列中进行了Kaplan-Meier曲线(ZSHS，n=457)，复旦大学上海癌症中心(FUSCC)n=324)，TCGA队列(n=318)，以及ACRG队列(n=261)。四个队列的病人特征见补充表1和2并在附图中给出了患者登记和研究设计的流程图。2。CD8之间的关联+T与预后在四个队列中不一致，CD8的存在具有良好的临床意义。+在ZSHS队列中P=0.004；图1。2A)，在FUSCC和TCGA队列中没有统计学意义(P=0.663和P分别=0.068；图1。2B，c)，并缩短了ACRG队列中操作系统的持续时间(P=0.048；图1。二维空间)。然而，CXCR 5之间的关联+CD8+T与预后保持一致，与CXCR 5一致+CD8+具有比CXCR 5更长OS的t-高组+CD8+四组中的T-low组(P < 0.001, P=0.002，P=0.034，以及P分别=0.013；图1。2)。CXCR 5丰度+CD8+经年龄、性别、组织类型、分级、病理T分期、病理N分期、转移、MSI状态、EBV四组调整后，T仍是一个较好的预后指标，而CD8则以EBV为混杂因子。+调整FUSCC、TCGA和ACRG队列中的混杂因子后，T细胞浸润不具有统计学意义(见图)。2和补充图。3).

a–dCD8生存曲线+T/CXCR 5+CD8+系统中操作系统的T细胞浸润(高和低)aZSHSbFUSCC，cTCGA，和dACRG队列。P所显示的值是由于CD8之间的比较而显示的。+T/CXCR 5+CD8+T细胞低、高组n=457(ZSHS队列)，n=324(FUSCC队列)，n=318(TCGA队列)，和n=261例(ACRG组)胃癌患者，采用Kaplan-Meier法，经对数秩统计检验，未调整和调整的HRs和95%的cis。源数据作为源数据文件提供。中山医院，复旦大学上海癌症中心，TCGA癌症基因组图谱，ACRG亚洲癌症研究组，人力资源风险比。

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CXCR 5协会+CD8+T对ACT的反应

TNMⅡ+III型胃癌患者ACT(±放射治疗)与OS的相关性已被证实。18经典19，以及批评家20审判。补充表中列出了ZSHS和ACRG TNMⅡ+III队列的患者特征。3。评估CXCR 5患者是否+CD8+与CXCR 5相比，t高肿瘤从ACT(±RT)中获益更多。+CD8+T-低肿瘤，我们研究了CXCR 5的相关性。+CD8+TNMⅡ+III型疾病患者中T细胞密度和OS在接受ACT或未接受ACT的患者中有显着性差异。结果证实，ACT治疗的患者在CXCR 5中有较高的OS表达率。+CD8+综援计划的高病人人数(P < 0.001; Fig. 3A)和ACRG(P < 0.001; Fig. 3B)队列。生物标记物与治疗之间相互作用的测试表明，在CXCR 5中观察到的益处+CD8+T-高亚组优于cxr 5所观察到的亚群。+CD8+在两个ZSHS中的t-低子集(P < 0.001) and ACRG (P=0.025)队列。然而，CD8的密度之间的相互作用的检验+T细胞和治疗在ZSHS中均无统计学意义(P=0.387)和ACRG(P=0.885，由于个体数量有限，结果应谨慎对待。此外，多因素Cox分析显示，ACT患者在调整各亚组的混杂因素后，死亡率低于无ACT的患者(图一)。3和补充表4和5).

a, b高/低CD8患者ACT(±RT)应用的生存曲线+T/CXCR 5+CD8+T细胞浸润aZSHS和bACRG队列。ACT(±RT)与不伴肿瘤CD8患者的疾病死亡率比较+T/CXCR 5+CD8+报道了T细胞浸润和生物标志物与处理之间的相互作用。对TNMⅡ+III期疾病患者进行ACT(±RT)分析。PACT(±RT)治疗与ACT(±RT)治疗的疗效比较n=343(ZSHS TNM II+III队列)和n=161例(ACRG TNMⅡ+III组)胃癌患者，采用Kaplan-Meier法，经对数秩统计检验，未调整和调整的HRs和95%的cis。#样本规模太小，无法进行多变量Cox分析。源数据作为源数据文件提供。ZSHS中山医院、ACRG亚洲癌症研究组、HR危险度、CI置信区间、ACT辅助化疗、RT放射治疗。

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CXCR 5协会+CD8+T与TCGA/ACRG分类

TCGA建立了分子亚型及其与预后和患者治疗策略的关系。15和ACRG16研究网络。为了整合肿瘤的微环境特征和分子亚型，我们试图确定CD8之间的联系。+T/CXCR 5+CD8+T和TCGA/ACRG分类。在TCGA队列中，CD8的密度+T在EBV亚型高，而在MSI低，基因组稳定(GS)和染色体不稳定(CIN)亚型。然而，CXCR 5+CD8+在MSI、EBV和GS亚型中，t签名得分相对较高，但在CIN亚型中最低(P < 0.001, P < 0.0001, and P < 0.0001, respectively; Fig. 4A)。在ACRG队列中，CD8的存在+T在微卫星稳定(Mss)/上皮间充质转换(Emt)亚型中较高，而在msi、mss/肿瘤蛋白53活性(Tp 53)中较低。+)和MSS/TP 53-不活动(TP 53)−)亚型。有趣的是，CXCR 5+CD8+T签名评分在MSI亚型中最高，在MSS/EMT和MSS/TP 53中居中。+子类型，但在MSS/TP 53中最低。−亚型(P < 0.0001, P < 0.0001, and P < 0.001, respectively; Fig. 4B).

aCD8+T%CiberSort-LM 22和CXCR 5+CD8+在TCGA队列的MSI、EBV、GS和CIN子群(TCGA分类，n=318例胃癌患者。图显示平均±SDn=62(MSI)，n=27(EBV)，n=46(GS)，和n=183(CIN)患者，采用两尾不成对的统计分析。t测试一下。bCD8+T%CiberSort-LM 22和CXCR 5+CD8+在MSI，MSS/EMT，MSS/TP 53中的T签名评分+，以及MSS/TP 53−ACRG分组(ACRG分类，n=261例胃癌患者。图显示平均±SDn=61(MSI)，n=43(MSS/EMT)，n=68(MSS/TP 53)+)，以及n=89(MSS/TP 53)−)个体患者，使用两尾不成对的统计分析。t测试一下。源数据作为源数据文件提供。TCGA肿瘤基因组图谱，ACRG亚洲癌症研究小组，MSI微卫星不稳定，EBV Epstein-Barr病毒，GS基因稳定，CIN染色体不稳定，MSS微卫星稳定，EMT间充质样型，TP 53肿瘤蛋白.

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调查总体人口中的结果是否由为CXCR 5富集的MSI和EBV亚群驱动。+CD8+T-高肿瘤，我们将zshs、tcga和acrg队列合并为一个组合队列(n(=1036)并在联合队列中进行分组分析。如附图所示。4，CXCR 5患者+CD8+T型肿瘤比CXCR 5患者有更好的OS。+CD8+低肿瘤在MSI-低/MSS，MSI-高和EBV-阴性亚组(P < 0.001, P=0.006，以及P分别=0.034；附图。4A，b)。进一步的单因素Cox分析显示，MSI-低/MSS和CXCR 5患者+CD8+T-低肿瘤或EBV阴性和CXCR 5患者+CD8+T-低肿瘤有最坏的结果(附图)。4C，d).

GC渗透CXCR 5+CD8+T是茎样CD8的一个子集。+具有效应记忆特性的T

为了探讨上述观察所强调的机制，我们研究了CXCR 5的特性。+CD8+用新鲜的胃癌手术标本观察肿瘤组织。值得注意的是，CXCR 5+CD8+Gc中的t细胞表达较高水平的免疫检查点分子。4,21包括pd-1、延迟-3和ctla-4，并与它们的cxcr 5进行了比较。−对应方(图1.5A)。此外，CXCR 5+CD8+T细胞有较高水平的细胞因子(白细胞介素(IL)-2、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素-γ)和CD107a，但颗粒酶B水平较低。5B，c)，意味着终止时间较短的区分状态22,23。有趣的是，两个CD8+T子集表示可比较的Ki-67，但表示CXCR 5。+CD8+T细胞有较高的组织滞留率。24,25,26(CD 103和CD 69)与茎相关标记27,28,29(Tcf 7和CD 27)表达。5D，e)。关于转录因子，这两个子集都表达了Eomes和T-bet。30,31、CXCR 5+CD8+T细胞表达较高的T-bet和较低的Eomes，而CXCR 5表达较低。−CD8+T细胞有较高的Eomes表达和较低的T-bet表达.中央记忆细胞标记物的表达32(CCR 7和CD62L)在这两个子集中都是低的，而效应记忆细胞标记则是低的。32IL-7R在CXCR 5中的含量较高+CD8+T细胞令人惊讶的是，一些CXCR 5−CD8+T细胞呈bcl-6表达，cxcl-13在cxcr 5中有部分高表达。−CD8+T细胞(图1.5E)，这可能意味着CXCR 5的耗竭表型。−CD8+T细胞33,34.

aCXCR 5的免疫检查点+CD8+T细胞与CXCR 5−CD8+来自GC组织的T细胞。图显示平均±SD值n=20(PD-1)，n=15(Tim-3)，n=15(滞后-3)，n=15(CTLA-4)，以及n=15(TIGIT)个别病人。bCXCR 5细胞因子+CD8+T细胞与CXCR 5−CD8+来自GC组织的T细胞。图显示平均±SD值n=12(IL-2)，n=12(TNF-α)，以及n=20例(IFN-γ)患者。cCXCR 5的有效分子+CD8+T细胞与CXCR 5−CD8+来自GC组织的T细胞。图显示平均±SD值n=20(CD107a)，n=10(颗粒酶B)，和n=10例(穿孔素)患者。dCXCR 5的增殖潜能+CD8+T细胞与CXCR 5−CD8+来自GC组织的T细胞。图显示平均±SD值n=20(KI-67)个别病人。a–d双尾配对统计分析t测试一下。eCXCR 5分子相对表达的热图+CD8+T细胞与CXCR 5−CD8+T细胞n=12例胃癌。fPd-1的耗竭标志+CXCR 5+CD8+T细胞与PD1+CD 39+CXCR 5−CD8+来自GC组织的T细胞。图显示平均±SD值n=12(PD-1)，n=12(Tim-3)，n=10(滞后-3)，n=10(CTLA-4)，以及n=10(TIGIT)个别病人。gPd-1细胞因子+CXCR 5+CD8+T细胞与PD1+CD 39+CXCR 5−CD8+来自GC组织的T细胞。图显示平均±SD值n=10(IL-2)，n=12(TNF-α)，以及n=10例(IFN-γ)患者。hPd-1的有效分子+CXCR 5+CD8+T细胞与PD1+CD 39+CXCR 5−CD8+来自GC组织的T细胞。图显示平均±SD值n=12(CD107a)，n=12(颗粒酶B)，和n=10例(穿孔素)患者。iPd-1的增殖潜能+CXCR 5+CD8+T细胞与PD1+CD 39+CXCR 5−CD8+来自GC组织的T细胞。图显示平均±SD值n=10(KI-67)个别病人。jPd-1的转录因子+CXCR 5+CD8+T细胞与PD1+CD 39+CXCR 5−CD8+来自GC组织的T细胞。图显示平均±SD值n=10(Eomes)，n=10(T-打赌)，n=8(TOX)，和n=10(Tcf 7)个别病人。f–j双尾未配对统计分析t测试一下。源数据作为源数据文件提供。

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据报道，CD8的大多数+T细胞是旁观者细胞35。然而，CXCR 5+CD8+T细胞主要代表肿瘤特异性CD8。+T细胞因此，我们进一步比较了pd-1。+CXCR 5+CD8+带PD1的T细胞+CD 39+CXCR 5−CD8+T细胞探讨肿瘤特异性CD8的特征+T细胞有趣的是，PD-1+CXCR 5+CD8+GC中的T细胞表达较低水平的耗竭标记物(PD-1、Tim-3、延迟-3和TIGIT)。5F)及较高水平的细胞因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ)；5G)，但效应分子水平较低(颗粒酶B和穿孔素，图1)。5H)与PD1的比较+CD 39+CXCR 5−CD8+T细胞此外，PD-1+CXCR 5+CD8+T子集有较高的Ki-67表达(图1)。5I)。关于转录因子，这两种肿瘤特异性的CD8。+T子集表达可比较的Eomes和TOX，而pd-1+CXCR 5+CD8+T细胞有较高的T-bet和Tcf 7表达。5J).

正如我们所预期的，我们的研究确定了CD8之间的联系+T和OS是不一致的。然而，我们发现了不同的CXCR 5种群。+CD8+气相色谱中的T与CXCR 5高密度之间的关联+CD8+使用四个病人队列，使OS持续时间延长。考虑到数据集的大小和考虑调整的混杂因素，这项研究为CXCR 5的独立预测作用提供了可靠的证据。+CD8+T.

值得注意的是，目前的研究揭示了CXCR 5的预测价值。+CD8+T反应ACT(±RT)。CXCR 5增高的TNMⅡ+III型肿瘤患者+CD8+T从ACT(±RT)中获得更好的OS。然而，我们注意到，与ACRG队列相比，ZSHS队列中的风险降低是不同的，即使在调整了相互作用和混杂因素之后，这可能是由不同的登记人群和部分ACRG队列中的患者使用RT来解释的。同时，有可能是影响预后和难以调整的治疗资格的驱动因素，还需要进行进一步的前瞻性研究验证。

此外，据报道，msi高且EBV阳性的gc患者对抗pd-1的治疗效果显著。36。我们已经证明了CXCR 5+CD8+高Pd-1表达的T细胞在TCGA分型MSI和EBV亚型以及ACRG分型MSI亚型中均有较强的表达，这可能部分解释了MSI高、EBV阳性胃癌抗PD-1治疗的优势机制。另一个观察是CXCR 5的存在。+CD8+TCGA分类中GS亚型中的T细胞，MSS/EMT和MSS/TP 53+ACRG亚型的亚型，并考虑pd-1/ctla-4在CXCR 5中的表达模式+CD8+这些结果提示这些亚型GC可能对抗PD-1/抗CTLA-4联合治疗有反应。

摘要(附图)5)，肿瘤内CXCR 5的丰度+CD8+T与OS改善有关，TNMⅡ+III型肿瘤呈较高的瘤内CXCR 5。+CD8+T细胞可从ACT中获益。这个类似茎的CXCR 5+CD8+具有效应记忆特性的t在TCGA分类MSI、EBV和GS亚型以及ACRG分类MSI、MSS/EMT和MSS/TP 53中得到了高度的体现。+GC的亚型CXCR 5对ACT的预测价值和预测价值+CD8+GC中T与CD8的比较+T，CXCR 5+CD8+T可作为胃癌的生物标志物和治疗靶点。