首先，我们对14例HGG中的3万~60万个分类小胶质细胞和巨噬细胞进行了RNA-seq检查(图1). 1A 和补充表 1 和 2 )。主成分分析表明，根据IDH的突变状态，样品有明显的分离(图1)。 1A )。为了进一步分析这些基因型依赖的信号，我们在流式细胞术纯化的CD 45上进行了单细胞rna-seq(scrna-seq)检测。 + CD3 − CD 19 − CD 20 − 从idh野生型(WT)分离的造血细胞( n =5)和idh-突变体( n =5)与对照脑组织比较( n =7)(图1。 1B )。使用数据集成工作流对4,460个通过质量控制的细胞进行了Seurat分析，发现了10个与不同细胞类型和状态相对应的转录不同的簇(图)。 1C )4 。采用超几何学方法对每种条件下考虑不同细胞数的细胞进行富集实验，发现髓系细胞簇(C)C0、C3、C4和C6在正常组织细胞中富集，C1和C5在IDH-WT HGG细胞中富集，C2在IDH突变型HGG细胞中富集。 1D 以及扩展数据图。 1A )。对idh-WT-富集的c1和c5的差异基因表达分析表明，小胶质细胞稳态基因表达下调。 TMEM 119 , P2RY12 , CSF1R )伴随干扰素(IFN)信号和缺氧相关基因的上调，包括 IFI44L 和 HIF1a 分别。此外，C1和C5表达的基因与急性激活的巨噬细胞有关，包括 APOE , CD 163 和 S100A11 ，表明这些团簇含有大量浸润的造血细胞。 3 ,5 。IDH-突变体丰富的C2群显示了编码趋化因子基因的上调(图1)。 1E )。C_0、C_3、C_4和C_6显示小胶质细胞特异性基因的上调，如 TMEM 119 和 OLFML 3 (无花果) 1E )。因此，我们发现与稳态小胶质细胞相关的基因的累积表达增加。 P2RY12 , CX3CR1 和 CSF1R )C_0、C_3、C_4和C_6。 1E )。小胶质细胞和巨噬细胞群C0-C6的差异基因表达分析显示，主要组织相容性复合体(Mhc)Ⅰ和Ⅱ类编码基因上调，包括 Hla-B , CD 74 和 Hla-DPA 1 ，在idh-WT中，HGG相关的GAM相对于他们的idh-突变HGG相关的对应物(图1)。 1F 以及扩展数据图。 1B )。后一种细胞表现出稳定的小胶质细胞和炎症介质编码基因的上调，如 P2RY12 和 IL1B (无花果) 1F )。接下来，我们用流式细胞术(Cytof)在蛋白质水平上验证了scrna-seq的结果.无监督聚类 n =65,909个嘌呤能受体(P2RY12) + 小胶质细胞( n =25 973项控制 n =17,646个来自idh-突变体hgg和 n 从IDH-WT HGG中鉴定出10个蛋白表达谱相似的簇(扩展数据图)。 1C-g )。为了确保在不同条件下蛋白质表达的可靠的聚类比较，我们排除了四个簇(C4、C7、C8和C10)，它们在每种情况下都不到所有细胞的0.05%(如图所示)。 1g )。C1和C5主要由对照组织细胞组成，C3主要含IDH-WT HGG细胞，C6和C9主要含IDH-WT和IDH突变的HGG细胞。 1g 以及扩展数据图。 1E )。C3具有激活基因表达谱，包括趋化因子受体CX3CR1、跨膜蛋白TMEM 119和P2RY 12，以及载脂蛋白(APOE)和受体EMR 1等小胶质细胞激活蛋白(APOE)和受体EMR 1的上调。 氢 以及扩展数据图。 1g )。此外，在idh-突变体和idh-WT HGG中富集的C6和C9簇均显示抗原提呈(AP)相关蛋白上调，其中包括HLA-DR和CD 74。 氢 )。对MHCⅡ类和抗体面板中共同刺激蛋白标记的分析显示，除C2(图2)外，HGG样本中除C2外，均有一致的上调。 氢 )。值得注意的是，髓系细胞以前根据mhcⅡ和共刺激基因的表达，在免疫和耐受性状态下被区分开来。 6 。根据转录谱分析，IDH-突变型HGG衍生髓样细胞与idh-WT细胞相比，对小胶质细胞稳态信号的下调不明显，对AP信号的上调也不明显(见图)。 氢 )。使用不同的细胞因子抗体面板(补充表)可以检测到类似的差异。 2 以及扩展数据图。 2 )。这些数据表明，人类HGG中的GAM具有明显的和差异的基因型依赖性形成，向免疫抑制表型方向发展。
图1：完整的单细胞图谱识别HGG中不同的髓样细胞亚群. a ，人idh-WT髓系细胞大量rna-seq数据的主成分分析(Pca) n =8例)和idh-突变型( n (6例)HGG。 N (巨噬细胞)=13，其中 n (idh-WT)=8，和 n (idh-突变体)=5； n (小胶质细胞)=14，其中 n (idh-WT)=8，和 n (idh-突变体)=6.mΦ，巨噬细胞。 b ，工作流应用于包括在本研究中的人的scRNA-seq样本。 c ，利用均匀流形近似和投影(UMAP)对scRNA-seq数据进行可视化。左面板基于Seurat算法的聚类输出进行颜色编码。基于细胞型富集基因的表达，进行细胞类型分配。UMAPs颜色编码小胶质细胞(右上)和单核细胞富集(右下)基因的累积基因表达。 n =7例对照组织， n =5例IDH-WT HGG患者， n =5例IDH突变型HGG； n 每个条件的值与 d –f 。自然杀伤T细胞。 d ，分别用UMAP(左)和Marimekko图(右)观察对照、idh-WT和idh-突变hgg组织样本的细胞分布情况(*)。 P < 0.01, ***P < 0.001) for clusterwise enrichment analysis in the one-tailed hypergeometric test. Adjustment for multiple testing was achieved using the Bonferroni method. e ，前15位标记基因的单细胞热图，左侧标注有代表性基因。 f ，Volcano图描述了IDH-WT GAM(右半部分)与idh-突变型GAM(左半)的差异表达基因。突出显示的基因代表高差异表达的基因 P 值<0.05，平均对数转换褶皱变化>0.25。 g 左转， t -分布式随机邻居嵌入( t -SNE)为蛋白质相似的细胞簇编码的地图颜色。正确的, t -SNE图描述了对照、IDH-突变体和IDH-WT GAM在簇间的分布. h 、小提琴图描述了在各自条件下稳态和AP蛋白的累积表达。 P 数值的计算采用单向Kruskal-Wallis检验和Dunn后特别试验，并采用本雅明-霍奇贝格法对多重检验进行调整。该配色方案与 g 。NS，没什么意义。
源数据
为了研究胶质瘤基因依赖的GAM免疫抑制表型的动态变化及其分子机制，我们利用实验性HGG小鼠模型GL261高表达WT和突变体idh(图1)。 2A 以及扩展数据图。 3A-g )。我们进行了流式细胞术纯化CD 45的scrna-seq。 + 从IDH-突变体和idh-WT GL 261胶质瘤中分离细胞，包括小胶质细胞、单核细胞、巨噬细胞、单核细胞来源的树突状细胞(DC)、肥大细胞、粒细胞和T、B细胞。 2A-d )。在d7时，小胶质细胞占肿瘤髓系细胞的75%以上(idh-WT为75%±17.6%，idh-突变体为92%±2.1%)，而D28以侵袭细胞为主(巨噬细胞为23%±11.6%，idh-突变体为36%±7.1%)，DC为11%±7.7%和14%±3.2%。 2E )。有趣的是，在第7天，入侵免疫细胞在IDH-WT比IDH-突变胶质瘤更丰富，而在后期，造血免疫细胞的含量在两个实验HGG之间是相当的(图)。 2E )。比较分析D7和D28实验HGG的细胞类型和IDH状态，发现HGG中相对小胶质细胞含量下降，伴随着巨噬细胞和DC数量的增加，提示HGG早期和晚期循环免疫细胞的内流率较高。重要的是，这些差异并不是差异肿瘤生长的结果。 2E，f 以及扩展数据图。 3E )。基于这些观察，我们推测，依赖于他们的idh状态，早期hgg微环境形成的小胶质细胞驱动入侵免疫细胞，特别是血液传播的巨噬细胞的差异招募。事实上，在idh-WT肿瘤中，d7小胶质细胞与人idh-wt hgg相一致，表现出高表达。 CCL 12 ，编码CCR 2配体的基因，参与外周髓样细胞向中枢神经系统(CNS)的募集。 CCL 12 IDH-WT GL 261胶质瘤小胶质细胞差异表达(图1)。 2G )。小胶质细胞在早期实验hgg中的差异表达分析进一步显示编码mhc和辅助刺激分子的基因在idh-WT胶质瘤中的表达增加，而idh突变胶质瘤的小胶质细胞则表现出较高的稳态小胶质细胞基因的表达。 P2ry12 根据我们在人类GAM中的发现(图1)。 2G )。为了评估稳态和活化小胶质细胞之间的逐渐变化，我们用StemID 2(参考文献2)对早期小胶质细胞进行了假时间分析。 7 )表示从稳态状态向差异化状态的转变。与我们的假设一致，我们发现在idh-突变的HGG中有稳定状态的小胶质细胞富集，在idh-WT的HGG中发现了活化的小胶质细胞的富集(图1)。 2H-j 以及扩展数据图。 3H，I )。综上所述，IDH突变型实验HGG在肿瘤进展过程中早期表现为免疫原性小胶质细胞表达减弱，浸润性髓系细胞减少。
图2：胶质瘤免疫浸润纵向分析显示肿瘤基因型依赖性GAM网络组成和早期小胶质细胞状态。 a ，工作流应用于本研究中的小鼠HGG样品。 n =14个样本 n =4只荷瘤小鼠(D7)， n =4 idh-突变型荷瘤小鼠(D7)， n =3只荷瘤小鼠(D28)， n =3只突变型荷瘤小鼠(D28)。 n 值是相同的。 b –j . b ，UMAP可视化的小鼠scRNA-seq数据，颜色编码为聚类输出的Seurat算法。 c ，UMAP颜色编码的细胞类型，根据表达的细胞类型丰富的基因签名。MOMΦ，单核巨噬细胞。 d ，UMAP颜色编码为HGG基因型，按时间点分离。 e .class=‘class 1’>关于HGG中肿瘤髓系区的组成与时间点和IDH-突变状态的关系. P 采用单尾超几何学检验，计算各时间点IDH-WT与IDH突变型肿瘤细胞类型的富集值。采用Bonferroni方法实现了多次测试的调整。绝对平均计数小于20的细胞类型被排除在分析之外。 f 点-线图描述HGG中髓系室相对于idh-突变状态和时间点的组成。 P 数值的计算方法是将负二项数函数拟合成细胞百分率作为时间点和细胞类型的函数，然后用R中的emmeans方法对时间点之间的时间点进行事后比较，并使用Tukey方法进行多次测试调整。错误条，S.E.M.绝对平均计数小于20的细胞类型被排除在分析之外。单核细胞。 g ，Volcano图描述了IDH-WT小胶质细胞(右半部分)与突变型小胶质细胞(左半)的差异表达基因。突出显示的基因代表高差异表达的基因 P 值<0.05，平均对数转换褶皱变化>0.25。 h 、StemID 2算法提出的GAM轨迹。 i 的轨迹，成簇标记基因的单细胞热图。 h 。代表基因在左边突出显示。 j 、热图 z 的轨道上由细胞表达的许多基因 h 。代表基因在右边突出显示。在热图(中间)下面，堆叠的条形图描述了沿轨道的细胞组成与idh突变状态有关。在此基础上，用双尾Spearman相关分析，对idh突变型实验HGG中的小胶质细胞丰度与idh-WT实验HGG中的小胶质细胞丰度沿轨迹进行了简单的线性回归，并进行了双尾Spearman相关分析。 F 分子自由度(DFN)=1，分母自由度(DFD)=28。
源数据
随着晚期实验肿瘤对募集的髓样细胞的富集，我们在晚期研究了单核细胞衍生细胞的功能表型，并在两个细胞室中发现了先前定义的AP信号的稳健表达(如图1所示)。 3A )8 。与idh-WT实验肿瘤相比，dc在idh-突变体中仅表现出中度差异特征，而来自idh-突变型胶质瘤的巨噬细胞则表现出上调。 IL1b 伴随着下调 Arg 1 (无花果) 3B，c )。为了评估晚期idh突变体hgg中AP信号减弱的机制，我们对从idh突变体中分离出的巨噬细胞和单核细胞来源的DC进行了假性时间分析，并将其与idh-WT肿瘤进行了比较(图一)。 三维空间 以及扩展数据图。 3H，I )。值得注意的是，我们观察到在idh突变的实验hgg中，两种细胞类型的丰度都较低，这表明在晚期idh-突变肿瘤中，要么延迟了功能极化，要么出现了单核细胞来源细胞的分化阻滞(如图所示)。 3E，f )。比较小鼠和人的数据，肿瘤内dc相对较高的丰度仅限于我们的hgg模型，目前的研究发现dc在人脑胶质瘤免疫细胞浸润中所占的比例不到5%。 9 。因此，我们的目的是从功能上验证小胶质细胞和巨噬细胞转录谱推断的AP衰减特征。在体外共培养实验HGG中分离的小胶质细胞和巨噬细胞后，我们观察到细胞毒性和T辅助细胞中IFN-γ的产生和程序性细胞死亡蛋白(PD)-1的表达均有一致的比例依赖性的下降。此外，在细胞毒性T细胞中，颗粒酶(GRZ)B的产生也减少了。 3G，h 以及扩展数据图。 3A )。值得注意的是，我们观察到巨噬细胞对T细胞的抑制程度不同，而小胶质细胞则没有，这是基于idh-突变状态的。与巨噬细胞共培养时，对T细胞的抑制作用明显增强。根据以前对T细胞的观察 10 我们假设IDH突变型实验肿瘤中巨噬细胞的AP衰减特征依赖于突变体idh的新纯酶活性。血脑屏障通透性突变型IDH抑制剂BAY 1436032对荷颅内idh突变体和idh-WT HGG小鼠的治疗作用(参考文献1436032)。 11 )显示在巨噬细胞中有IDH突变相关的衰减AP信号的部分可逆性，而在小胶质细胞中则没有。 3I ).
图3：浸润性造血巨噬细胞的肿瘤基因型特异性教育进一步推动晚期肿瘤胶质瘤微环境的耐受性排列。 a ，UMAP显示从小鼠scRNA-seq数据浸润造血髓系细胞，颜色编码为聚类(左)和累加基因表达参与AP(右)。 n =6个样本 n =3只荷瘤小鼠(D28)， n =3只突变型荷瘤小鼠(D28)。 b ，Volcano图描述了IDH-WT相关巨噬细胞(右半部分)与IDH突变相关巨噬细胞(左半)的差异表达基因。 c ，Volcano图描述了IDH-WT相关DC的差异表达基因(右半部分)与IDH突变相关DC(左半)的差异表达基因。在……里面 b ,c ，突出显示的基因代表差异表达最高的基因 P 值<0.05，平均对数转换褶皱变化>0.25。单核细胞源性DC。 d ，浸润造血髓系细胞轨迹，由StemID 2算法提出。 e 、热图 z 细胞沿巨噬细胞轨迹表达的基因 d 。代表基因在右边突出显示。在热图(中间)下面，堆叠的条形图描述了沿轨道的细胞组成与idh突变状态有关。底部，简单线性回归与双尾Spearman相关分析( F IDH突变相关巨噬细胞相对丰度为16.87，DFN=1，DFD=28)。 f 、热图 z 细胞沿DC轨迹表达的大量基因 d 。代表基因在右边突出显示。在热图(中间)下面，堆叠的条形图描述了沿轨道的细胞组成与idh突变状态的关系。底部，简单线性回归与双尾Spearman相关分析( F IDH突变相关DC的丰度与IDH-WT相关DC的相对丰度为65.98，DFN=1，DFD=28。 g 、脑胶质瘤相关小胶质细胞T细胞抑制试验。顶部CD4 + T细胞与小胶质细胞共培养。 n =10只从IDH-WT荷瘤小鼠分离的小胶质细胞，n =9例从IDH突变型荷瘤小鼠中分离到的单个小胶质细胞。底部，CD8+ T细胞与小胶质细胞共培养； n 值与上面的值相同。采用单因素方差分析结合Tukey‘s检验确定统计学意义。E：T，效率-目标比。 h 体外胶质瘤相关巨噬细胞T细胞抑制试验。程序和 n 值与 g 。采用单因素方差分析结合Tukey‘s检验确定统计学意义。 i 。抑制突变体idh可有效逆转突变体诱导的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)表型. n =12； n =4只荷瘤小鼠， n =4 ih-突变型荷瘤小鼠， n 用BAY 1436032处理4只idh突变型荷瘤小鼠。胶质瘤相关小胶质细胞和巨噬细胞流式细胞术分析。盒子和晶须(最小到最大，中间为中心)显示。采用单因素方差分析结合Tukey‘s检验确定统计学意义。IDHi，IDH抑制剂；P.O.，每os。如果不另加说明，则所有数据均表示为平均值±S.E.M。
源数据
为了确定这种时间依赖性和肿瘤基因型相关功能转移的分子机制，我们将人类单核细胞和巨噬细胞置于突变体idh的新纯酶产物中， R -2-羟基戊二酸(R-2-HG) 12 。将R-2-HG预处理的单核细胞或巨噬细胞与T细胞共孵育，显示了剂量依赖性的抑制T细胞增殖的作用。 4A )。为了证实巨噬细胞接触R-2-HG后，AP能力减弱，我们用流式细胞术检测了CD 80、CD 86和HLA-DR的表达。事实上，在R-2-HG暴露后，这些蛋白的剂量依赖性下调被观察到(如图所示)。 4B，c )。巨噬细胞和小胶质细胞与激活状态无关地吸收外源性R-2-HG。 4D 以及扩展数据图。 4A )。过量表达已知转运R-2-HG的氨基酸转运体，如溶质载体(SLC)13A3，但不表达SLC22A6、SLC16A5或SLC3A2，导致R2-HG摄取增加(图1)。 4E 以及扩展数据图。 4B )13 。为了探讨IDH突变型肿瘤中GAM再编程的机制，我们从正常人供体中分离出R2-HG处理的原代巨噬细胞，进行体外转录组筛选。 4F 以及扩展数据图。 4C )。路径分析表明，R2-HG暴露后的调控通路是由合成毒素2，3，7，8-四氯二苯并-1诱导的。 p -二恶英(TCDD) 4F 和补充表 3 )。TCDD是一种最强的二恶英类化合物，它通过特定的配体受体与芳基烃受体(AHR)相互作用。 14 。值得注意的是，在idh-突变型胶质瘤的肿瘤基因组图谱(Tcga)数据集中，AHR目标基因的表达显著提高(P<0.05)。 n =226)高于idh-WT肿瘤( n =55)，但只有当肿瘤内髓样细胞丰度恢复正常时，才能通过 ITGAM (CD11b)表达式(扩展数据图)。 4D )。AHR靶基因，如 AHRR (编码AHR抑制器)， TIPARP (编码TCDD诱导的聚(ADP-核糖)聚合酶)和 CYP1A1 R-2-hg对单核细胞的诱导作用与已知的内源性aHR配体的诱导程度相似。 L -金牛柳碱(Kynurenine) L -京)体外试验(图一)。 4G )。进一步观察到人巨噬细胞R2-HG激活AHR靶基因具有剂量依赖性(扩展数据图)。 4E )。为了验证AHR靶基因在GAM中的特异性表达，我们对人脑胶质瘤浸润进行了伪时轨迹分析。我们发现，AHR靶基因沿富含idh突变体GAM的轨迹(C3→C2)上调，而不是IDH-WT衍生GAM(图1)。 4H )。与此形成对照的是，idh-WT衍生的GAM主要沿另一条免疫原性较强的轨迹，表达抗原提呈细胞标志基因(C3→C0→C1，图1)。 4H )。根据人的数据，在实验的HGG中形成髓样细胞轨迹的所有簇在idh-突变体衍生细胞和idh-WT-来源细胞之间表现出AHR激活基因特征的差异累积表达(如图所示)。 4I )。如 AHR 与其他免疫细胞相比，单核细胞中转录本最丰富(扩展数据图)。 4F )，这些发现表明免疫细胞亚型特异性易受R-2-HG重新编程的影响.值得注意的是，aHR被认为是免疫抑制转化生长因子β和白细胞介素1β信号转导的关键辅助因子。 15 ,16 。此外，AHR还直接促进IL-10的生产。 17 ,18 。我们发现，在R2-HG暴露后，巨噬细胞的IL-10和转化生长因子-β呈剂量依赖性增加(如图所示)。 4J 以及扩展数据图。 4G )。对单核巨噬细胞的分析表明，IL-10的产生实际上是在IDH-突变型实验HGG微环境中诱导的，需要功能性AHR(图1)。 4K )。因此，在AHR-WT中生长的IDH突变型实验HGG中，新分离的肿瘤裂解液中IL-10水平高于AHR缺陷微环境中的IL-10水平(图1)。 4L )。为了验证R-2-HG对GAM的AHR依赖性重编程是否是AHR易位增加的结果，我们采用体外AHR易位报告试验，用dre依赖性启动子驱动gfp的表达。 德雷 -绿色伙伴关系)。用高表达突变体idh的胶质瘤细胞浓缩上清液孵育可提高AHR易位和转录活性(扩展数据图)。 4H )。为了确定所观察到的AHR的激活是否是由R-2-HG而不是其他差异释放物质驱动的，我们测试了合成的R-2-HG，并观察到在孵育60分钟内核AHR易位增加(如图所示)。 4m 以及扩展数据图。 4I )。我们在一种独立的、以荧光素酶为基础的端点分析中验证了这些结果。 4N )。值得注意的是，R-2-HG诱导的AHR易位与由R2-HG诱发的AHR易位相当。 L -Kyn(图1. 4m-o 以及扩展数据图。 4I )。作为剥夺 L -Trp通过R-2-HG降低AHR易位，而不是通过R2-HG降低AHR易位。 L -Kyn，我们的累积数据表明R-2-HG不是一个直接的AHR配体，而是导致细胞内细胞内水平升高。 L -Kyn，想必在此之前 L -TRP分解代谢及随后的AHR激活(图1)。 4O )。评估巨噬细胞对T细胞的抑制作用是否依赖于 L -TRP，我们与巨噬细胞共培养 L -不含Trp的媒体和控制媒体。令人注意的是，色氨酸剥夺R-2-HG暴露的巨噬细胞导致共同孵育的T细胞的效应功能增加(图1)。 4P ).
图4：AHR信号在idh突变型胶质瘤中损害巨噬细胞的教育和功能. a 、氚化胸苷( 3 人T细胞与自体外周血源性单核细胞或分化巨噬细胞共培养，预先暴露于不同剂量的R-2-HG中，对原代人T细胞的增殖试验。 n =20例单个单核细胞-T细胞共培养。n =19例单个巨噬细胞-T细胞共培养。采用双尾Spearman相关分析(P Corr )在20至19岁之间 x –y 双尾学生 t -在0毫米至20毫米之间进行测试( P 0毫米对20毫米 )。CPM，每分钟计数。 b ,c 流式细胞仪检测R2-HG处理的外周血单核细胞表面CD 86、CD 80和HLA-DR的蛋白丰度。 b 、一位健康供体的典型流式细胞术伪彩色图。脂多糖。 c ，CD 86的量化 + 、CD 80 + HLA-DR + 巨噬细胞。统计学意义由双尾学生决定 t -测试； n =6名健康的人类捐献者。 d 、R2-HG体外孵育及IFN-γ和LPS刺激24h后，原代巨噬细胞内R-2-HG的变化，呈非线性回归。 n =3次实验重复。 e 用R-2-HG体外孵育24h后，细胞内测定过表达SLC亚型的细胞内R-2-HG，用单因素方差分析和Tukey‘s试验测定其统计学意义。 n =3次实验重复。EC，胞外；IC，胞内。 f ，人巨噬细胞DNA微阵列筛选( n 8)外源性R-2-HG处理，进行配对分析。巧妙路径分析数据集，表明TCDD诱导的规范网络。 g ，不同剂量的R-2-HG或R2-HG对单核巨噬细胞AHR靶基因的诱导作用。 L -用PCR法测定。与车辆处理相关的折叠式变化显示( n =5-6名独立健康捐赠者)。 h 分别对IDH-WT GBMs(C0，C1)和IDH-突变型GBMs(C2)细胞株间的逐步变化进行假时分析。分析 n =1,957个来自对照组患者的细胞， n =690个细胞来自idh-突变的GBMs和 n =809个来自IDH-WT GBMs的细胞。 i 、沿着图所示的轨迹浸润造血髓系细胞的分析。 三维空间 使用UMAP表示为RaceID集群编码的颜色和AHR激活签名的累积表达式。 j ，ELISA法检测骨髓巨噬细胞白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(Bmdm)。 AHR +/+ 对决 AHR −/− 体外高剂量R-2-HG染毒小鼠。给出了非线性回归的结果。统计学意义由双尾学生决定 t -浓度为10的试验 −2 M. n =3 AHR +/+ 对决 n =3 AHR − /− 老鼠。 k GL261肿瘤移植瘤中巨噬细胞的流式细胞术分析 AHR +/+ (n =10，其中idh-WT n =6和idh-突变体 n =4)相对于 AHR −/− n =12，其中idh-WT n =6和idh-突变体 n =6)小鼠。盒子和晶须(最小到最大，中间为中心)显示。采用单因素方差分析结合Tukey‘s检验确定统计学意义。 l ，IL-10酶联免疫吸附试验(ELISA)检测GL261 idh突变型荷瘤患者的半球冲洗液。 AHR +/+ (n =12个匹配样本) AHR −/− n 6只配对的小鼠。以自体对侧半球作为对照。 m 、AHR易位报告试验。AHR易位的时间相关量化 德雷 -GFP记者。显示任意单位(AU)。扩展数据图中概述的三个独立重复序列的代表性实验。 4I . n 、荧光素酶终点报告法检测AHR易位。用指示化合物处理6h后，报告试验。 CMV 以荧光素酶(CMVLuc)为阳性对照。 n =3种独立的分析方法，每种方法使用两种不同的R2-HG细胞株和 L -Kyn条件)。相对发光单位。 o .class=‘class 1’>增加剂量R-2-hg或Vehicle(Pbs)治疗6h后的AHR报告试验. L -Kyn或Vehicle(PBS)6小时，细胞被保存在含5毫克升的RPMI 1640培养基中。 −1 L -跨国激进党与FBS或 L -TRP-无透析FBS培养基。数据表示为 n =3次独立检测，用S.E.M.投影为误差带。 p 巨噬细胞T细胞抑制试验。BMDMs在含5 mg l的培养基中与R2-HG或Vehicle进行体外分化。 −1 L -跨国激进党与FBS或 L 用透析的fbs培养基培养24h，细胞与受刺激的同基因T细胞共培养72h。干扰素-γ的相对测定(R2-HG/Vehicle，%/%) + 或GrzB + T细胞显示。统计学意义由双尾学生决定 t -测试。 n =6(干扰素-γ)或 n 3只小鼠作为BMDM和T细胞供体的配对样本=8(增殖，GrzB)。如果不另加说明，则所有数据均表示为平均值±S.E.M。
源数据
根据我们的发现，我们假设免疫抑制 L -TRP分解代谢通过kynurenine途径驱动巨噬细胞浸润idh-突变肿瘤的重新编程。 19 。定义…的动力学 L 在R-2-HG的影响下，我们在巨噬细胞和T细胞中进行了一项基于LC-MS/MS的研究。 5A，b 以及扩展数据图。 5A )。在这里我们发现外生 L -T细胞以剂量依赖性的方式摄取TRP。而在T细胞中， L -在跨国激进党水平的同时， L -Kyn水平；胞内水平 L -巨噬细胞中Trp水平随时间的增加而保持稳定。 L -Kyn水平(图1. 5A )。在此基础上，可以合理地假设R-2-hg暴露的巨噬细胞会产生巨噬细胞。 L -进口京 L -跨国激进党 L -TRP分解代谢途径通过Kynurenine途径。色氨酸2，3-双加氧酶(TDO2)和吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)1和IDO 2催化了菊花碱途径的限速步骤，共占饲料的90%。 L -跨国激进党降解 20 ,21 。血浆kynurenine-色氨酸( L -京][ L -跨国激进党] −1 )浓度比经常被用来表达或反映这些酶的活性 22 。事实上，当巨噬细胞暴露于R-2-HG时，巨噬细胞的[ L -京][ L -跨国激进党] −1 随着细胞外浓度的增加 L -跨国激进党。相反，T细胞并没有显示出 L -Kyn的产量超过了线性增长，这可能是由于基板水平增加而引起的平衡反应的改变的结果(见图)。 5B )。找出背后的机制 L -TRP在巨噬细胞中降解，而在T细胞中不降解，我们用Kynurenine途径中描述的限速酶进行了无细胞酶分析。在此，剂量依赖性的R-2-HG补充可使TDO2增加Kynurenine的生成，而IDO 1或IDO 2则没有增加Kynurenine的产量，表明R2-HG具有TDO2-HG的诱导作用(图1)。 5C-E )。根据诱导动力学，R-2-hg在tdo 2四聚体蛋白复合物界面上可能是一种新的变构激活剂，因为tdo 2不依赖于α-酮戊二酸，类似于其他被描述为受R-2-hg影响的酶。 23 ,24 。人们普遍认为TDO2在肝细胞中具有活性以达到 L -Trp动态平衡，而许多细胞类型显示基础IDO低表达，可由促炎细胞因子迅速诱导。 25 。然而， TDO2 基于不同免疫细胞群体间可公开获得的rna-seq数据的表达分析显示，单核细胞和巨噬细胞中的表达水平中等(图1)。 5F )26 。在体外功能测试中使用的细胞 Tdo2 −/− 小鼠，我们证实了R-2-HG相关的T细胞增殖对T细胞增殖的依赖性。 Tdo2 在原代巨噬细胞中的表达，以及IL-10和TGF-β信号的表达。有趣的是，基因消融 Tdo2 在原代巨噬细胞中，应用PD-配体(L)1免疫检查点阻断可逆转R-2-HG相关的T细胞增殖.因此，直接适用 L -Kyn模拟TDO2-HG在TDO2缺乏细胞中的表型效应。 5G )。如 AHR 和 TDO2 转录本在人类单核细胞中比在其他免疫细胞中更丰富(扩展数据图)。 4F )27 这些发现表明，巨噬细胞具有免疫细胞亚型特异性，易受idh突变肿瘤旁分泌重新编程的影响。
图5：单核细胞衍生巨噬细胞的酶易损性使R-2-HG驱动的金牛尿碱产生. a ,b , L -R-2-HG暴露于免疫细胞亚群中的Trp导入和降解动力学.细胞内LC-MS/MS测量 L -跨国激进党和 L T细胞和单核巨噬细胞在20 mM R-2-HG和不同剂量的R2-HG中的Kyn L -跨国激进党。第一，剂量依赖性代谢物积累的线性回归。底部，细胞内的定量 L -跨国激进党和 L -Kyn级和[ L -京][ L -跨国激进党] −1 比率。显示为误差带(上)或条(下)。 n =3名独立健康捐赠者。S.E.M.投影为误差带。采用单因素方差分析结合Tukey‘s检验确定统计学意义。 c –e 随着合成R2-HG浓度的增加，IDO 1、IDO 2和TDO2酶活性的无细胞测定。给出了一个非线性回归模型(log(R-2-HG)与响应).回归曲线 y =0+(0.16−0)(1+10) (log(EC 50)−) x )−1 (欧共体) 50 ，最大有效浓度)。产 L -Kyn在321 nm处用吸光度法测定。 321 )。灰色盒显示脑胶质瘤组织中R2-HG的浓度范围。 12 n =IDO 1的2项独立测量， n =IDO 2的4项独立测量， n =对TDO2的4项独立测量。 f ，表达 Tdo2 在不同的小鼠免疫细胞亚群中。RNA-seq数据来源于参考文献。 27 。T型 n ，幼稚T细胞 EFF ，效应T细胞；T细胞 埃姆 ，效应记忆T细胞 GD ，γδT细胞；NK，自然杀伤细胞(NK)；Mo，单核细胞；MG，小胶质细胞。 g ，单核细胞源性巨噬细胞-T细胞 3 H-DT增殖试验。单核巨噬细胞 n =3 Tdo2 +/+ 和 n =3 Tdo2 −/− 小鼠用10 mmR-2-HG或车辆预处理，10 ng ml。 −1 抗白细胞介素-10和抗转化生长因子-β抗体(α-IL-10/TGF-β)或同工型对照；10 ng ml。 −1 抗pd-L1抗体或同类型对照；或10 mm L -Kyn或载体按指示作用24h，与受刺激的C57BL6/J T细胞共培养24h，单因素方差分析结合Tukey‘s试验测定统计学意义。如果不另加说明，则所有数据均表示为平均值±S.E.M。
源数据
我们发现，在巨噬细胞中，TdO 2由R-2-hg直接诱导，导致aHR配体的积累。 L -Kyn这种病理激活的kynurenine通路只有在减少时才能持续。 L -TRP水平被检测到，细胞外 L -TRP的进口达到了足够的程度，因为对动物细胞来说，它的新合成是不可能的。有趣的是，人单核细胞源性巨噬细胞接触R-2-hg后，其氨基酸转运蛋白的表达模式与细胞外转运蛋白的表达模式相似。 L -Trp，暗示R-2-hg引起氨基酸饥饿样反应。 L -TRP在巨噬细胞中的降解(图1. 6A )。值得注意的是， SLC3A2 R-2-hg暴露细胞的细胞数高于R-2-hg细胞。 L -TRP-剥夺细胞。值得注意的是，不是 Slc13a3 ，编码所描述的R-2-HG转运体，但是 Slc3a2 CD 98对小鼠HGG的单核-巨噬细胞轨迹有一定的促进作用(图1)。 3E ). Slc3a2 和 Slc7a5 LAT 1在翻译后形成异源二聚体LAT1-CD 98，与idh-WT实验肿瘤相比，在idh-突变体中差异表达，并在单核-巨噬细胞轨迹上表现出一致的表达模式(图1)。 6B，c )。SLC3A2(CD 98)具有多个结合伙伴。基因表达及原位杂交分析 Slc7a5 在不同的组织居住的巨噬细胞群体中，最高水平的巨噬细胞 Slc7a5 在CNS巨噬细胞中(如图所示)。 6C 以及扩展数据图。 5B，c )28 。结果表明，支链氨基酸的跨膜转运，如 L -Trp优先由LAT1-CD 98介导 29 因此，可以提供 L -Trp需要通过R-2-HG维持Kynurenine通路的激活.接下来，我们研究了lat 1-cd 98的增加是否依赖。 L -TRP通过AHR信号通路减弱实验性HGG中巨噬细胞的AP能力。为此，我们研究了LAT1-CD 98在体外和体内的抑制作用。 6d，e )。小分子LAT1-CD 98抑制剂预处理单核巨噬细胞 30 拯救了由R-2-HG诱导的22个AHR靶点中的17个(如图所示). 6d )。同样，LAT1-CD98抑制剂对胶质瘤动物的作用也导致mhcⅡ丰度增加。 + CD 80 + CD 86 + 免疫刺激巨噬细胞在idh-突变肿瘤，从而增强AP的标志(图一)。 6E )。这与我们先前的发现一致，即在巨噬细胞接触R-2-HG时，色氨酸剥夺导致共同孵育的T细胞的效应功能增加(图一)。 4P )。我们的目的是调查人类idh突变型胶质瘤的微环境是否实际上被配置来维持这种状态。 L -TRP依赖轴。利用基质辅助激光解吸电离(Madi)质谱成像(Msi)分析方法，我们发现了细胞外积累。 L -原位人HGG组织群中的TRP(图1)。 6f 以及扩展数据图。 6a，b )。如所料，所有诊断为idh突变体的肿瘤均有R2-HG积聚，而在IDH-WT HGG或对照皮层标本中未检测到R2-HG。 6f，g )。有趣的是，我们观察到细胞外的大量积聚 L -idh-突变体hgg中的trp在所有人类复制组中的丰度显著高于 L -TRP在IDH-WT HGG。 L -TRP水平在IDH-WT HGG中为中等水平，而在对照皮质中，它们与背景水平相当，因此明显低于肿瘤组织(图1)。 6f，g )。增加水平 L 突变型IDH 1和/或IDH 2过表达或外源性R-2-HG暴露于肿瘤细胞株中。 31 。我们同样发现细胞内和细胞外的细胞内和细胞外都有中度到高度的增加。 L -TRP水平，分别在idh-突变的实验性HGG(图1. 六小时 )。巨噬细胞呈中度表达 TDO2 与其他免疫细胞亚群相比，tcga胶质瘤数据集的rna-seq分析显示， TDO2 在idh突变型肿瘤中的表达水平。 6I )32 。总的来说，这些数据表明过度刺激的，R-2-HG依赖的摄取 L 髓系细胞经LAT1-CD 98介导的Trp可维持idh-突变型HGG中GAM的免疫抑制重编程。
图6：LAT1-CD 98连接IDH突变胶质瘤和单核巨噬细胞的色氨酸代谢失调。 a 人氨基酸和药物转运蛋白在R2-HG或载体中作用于单核巨噬细胞的序列PCR分析 −1 L -跨国激进党与FBS或 L -TRP-无透析FBS培养基。给出了与车辆状况相关的ΔΔCT值。 n =3集合健康的人类捐献者。 b ,c ，局部多项式曲线拟合 Slc3a2 (b )和 Slc7a5 (c )沿着小鼠HGG单核-巨噬细胞轨迹(TOP)表达； Slc3a2 和 Slc7a5 通过rna-seq(底部，从参考文献中提取的数据集)跨越不同的组织驻留巨噬细胞群体。 27 ，所示平均值)。Bl.，血液；emb.，胚胎；Kupff，Kupffer；mo，单核细胞；PER，腹膜；PP，Peyer‘s贴片；q.d.，quakiker死亡，每天一次；SPL.，脾脏。 d 用20 mM R-2-HG±1MLAAT1-CD98i抑制剂(LAT1-CD98i)或PCR-AHR信号阵列检测载体诱导巨噬细胞AHR靶基因。 n =3集合健康的人类捐献者。 e 抑制LAT1-CD 98能有效地恢复IDH突变诱导的GAM表型。 n =4只IDH 1突变型GL 261 HGG荷瘤小鼠， n =7只IDH 1突变型GL261 HGG荷瘤小鼠，用LAT1-CD 98抑制剂处理。胶质瘤相关巨噬细胞流式细胞术分析。盒子和晶须(最小到最大，中间为中心)显示。采用单因素方差分析结合Tukey‘s检验确定统计学意义。 f ,g ，R-2-HG和R2-HG的空间分布和同位定位 L -用MALDI-MSI评估HGG患者和对照组组织中的TRP。 n =5个对照皮质样本， n =5个idh-突变病人样本， n =5个idh-WT患者样本。 f 相应的苏木精和伊红(H&E)染色组织(第一列)、二维(2D)和三维(3d)R-2-HG信号强度图(分别为第二和第三列)和二维和三维离子表面图。 L -TRP信号强度(分别为第四列和第五列)。 g ，左，小提琴图的估计信号强度分布(内标为(0，1)AU)的R-2-HG。右图，估计信号强度分布的小提琴图(内部缩放为(0，1)AU) L -跨国激进党。单因素方差分析结合Tukey的诚实显着性差异检验(*)确定统计学显着性。 P < 0.001). h ，细胞外和细胞内的定量 L GL261idh-突变体和GL261idh-WT肿瘤经LC-MS/MS浓度测定后，沿Kynurenine途径代谢产物水平与体积或细胞计数相一致。显示了一个日志图。 i 。TDO2在TCGA低级别胶质瘤中的表达 n =286)和HGG( n =402)数据集。数据来源于参考文献。 33 。单因素方差分析结合Tukey诚实显着性差异检验确定统计学意义。如果不另加说明，则所有数据均表示为平均值±S.E.M。
源数据
我们先前的研究结果表明，R-2-HG诱导的GAM对T细胞的抑制作用依赖于GAM的积累和降解。 L -跨国激进党和功能性AHR。小分子抑制剂对AHR或LAT1-CD 98的抑制能有效地逆转R-2-HG介导的巨噬细胞重组，AHR靶标筛选阵列(图1)显示。 6d 和 7A 以及扩展数据图。 4H )。与r2-hg联合培养的巨噬细胞对T细胞增殖和效应功能无明显抑制作用。 L -Trp丰度(图1. 7b )。因此，我们的目的是测试idh突变的实验性HGG是否存在一种独特的免疫脆弱性，可以通过AHR抑制进行治疗性开发。因此，我们将免疫检查点阻断(抗pd-l1抗体)的T细胞活化免疫疗法与一种小分子aHR抑制剂结合起来。 33 目的：探讨AHR介导的免疫微环境对idh-突变型HGG的影响。 7C，d )。接种idh-WT hgg并经免疫检查点阻断治疗的小鼠中，40%为长期存活者，而携带idh突变瘤的小鼠对免疫检查点阻断无反应，这一观察结果支持了idh突变瘤实际上促进了其免疫微环境的耐受性排列。而服用AHR抑制剂并不能改善荷瘤小鼠的预后(如图所示)。 7C )，我们观察到有统计学意义的延长荷瘤小鼠的存活时间(如图所示)。 7D )。与先前的结果一致(图1)。 3I 和 4K )AHR抑制剂处理的IDH突变型胶质瘤的单核巨噬细胞显示出较高水平的AP标记物。AHR抑制IDH突变瘤细胞产生IL-10和转化生长因子-β，而对IDH-WT肿瘤无抑制作用(图1)。 7C，d ).
图7：IDH 1突变型巨噬细胞抑制的抗肿瘤免疫可被AHR的药理抑制逆转。 a 用20 mM R-2-HG±1M AHR抑制剂(AHRI)或TaqMan实时(RT)PCR AHR信号阵列检测的载体诱导巨噬细胞AHR靶基因。分数差异如所示。 n =3集合健康的人类捐献者。 b 单核细胞源性巨噬细胞T细胞抑制试验。BMDM AHR −/− 小鼠在含5 mg l的rpmi 1640培养基中与rpmi 1640或载体进行体外分化。 −1 L -跨国激进党与FBS或 L 用透析FBS培养24h，与抗CD3和抗CD 28抗体刺激的同基因T细胞共培养72h。采用流式细胞术对T细胞进行分析。T细胞增殖和干扰素-γ的相对测量(R-2-HG/Vehicle，%/%) + 或GrzB + T细胞显示。统计学意义由双尾学生决定 t -测试。 n 用4只小鼠的8只配对样本进行增殖和GrzB检测。+ 细胞， n 用3只小鼠的6份配对样品对干扰素-γ进行检测。+ 细胞。 c ,d AHR抑制的治疗效果仅限于IDH突变型胶质瘤.C57BL/6J小鼠在40%2-羟丙基(40%2-羟丙基)-β-环糊精(Hpbcd)、pH 7.2或载体(40%hpcd在水中，pH 7.2，bd)后，每3d(Q3d)用100 g抗pd-l1抗体(Q3d)、ahr抑制剂(50 mg/kg，每日2次)处理，脑内注射GL261 idh-或GL261 idh-r132H肿瘤(GL261 idh-或GL261 IDH1-r132H肿瘤)后，以随机法对肿瘤体积进行随机化处理。 n =19只idh-WT荷瘤小鼠 n =17只突变型荷瘤小鼠)。顶部，Kaplan-Meier生存曲线采用对数秩Mantel-Cox检验进行统计检验.肿瘤浸润巨噬细胞(CD 45)的流式细胞分析 嗨 CD11b + F4/80 + GR-1 − )。用Mann-Whitney检验确定统计学意义。如未另作说明，则所有数据均表示为平均值±S.E.M。
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